《Biochemistry and Biophysics Reports》：Structure-based binding pocket conservation analysis identifies 9-OH urolithin dehydroxylase candidates across phylogenetically diverse bacteria
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尿石素是由肠道微生物群从膳食鞣花单宁和鞣花酸产生的多酚化合物，其中尿石素A（urolithin A）生物活性最强，与抗衰老和抗炎等一系列药理活性相关。尽管具有这些益处，但目前已知的产生尿石素A的细菌及其相应酶的数量非常有限。在本研究中，研究人员将传统的基于序列
尿石素是由肠道微生物群从膳食鞣花单宁和鞣花酸产生的多酚化合物，其中尿石素A（urolithin A）生物活性最强，与抗衰老和抗炎等一系列药理活性相关。尽管具有这些益处，但目前已知的产生尿石素A的细菌及其相应酶的数量非常有限。在本研究中，研究人员将传统的基于序列的同源搜索与结构建模相结合，以识别可能含有9-OH尿石素脱羟基酶（9-OH urolithin dehydroxylase）的新细菌，该酶主要在肠溶梭菌属（Enterocloster）中被鉴定，催化尿石素A生产所必需的关键脱羟基步骤。研究人员利用三种肠溶梭菌（Enterocloster）参考序列，进行了数据库序列搜索并结合亚基共现筛选。随后采用AlphaFold 3对候选的多亚基复合物的三维结构进行建模。基于这些模型，进行了比较分析，以筛选那些在其活性位点口袋内具有高度保守的三维结构特征和保守核心残基架构的候选酶。最终获得的非肠溶梭菌（non-Enterocloster）候选物，包括 Aromatoleum sp. 和 Dehalobacter restrictus，基于其保守的结合口袋架构，显示出与参考酶高度预测的功能相似性。本研究表明，结合口袋的结构特征有助于识别新型潜在的尿石素脱羟基酶以及先前未被识别的产尿石素A细菌。
研究背景与科学问题
尿石素（urolithins）是肠道微生物群代谢膳食鞣花单宁和鞣花酸后产生的多酚类化合物。其中，尿石素A因其显著的抗衰老、抗炎等生物活性而备受关注。尿石素的生物合成涉及一系列酶促反应，包括水解、内酯化、脱羧和脱羟基。关键的脱羟基步骤由特定的脱羟基酶催化，其中9-OH尿石素脱羟基酶负责将尿石素C转化为最具活性的尿石素A。然而，目前已知能够产生尿石素A的细菌种类极其有限，特别是已确认编码9-OH尿石素脱羟基酶的菌株仅有肠溶梭菌属（Enterocloster）的少数几种，例如 Enterocloster bolteae。由于多数肠道细菌为严格厌氧菌，难以在实验室条件下培养和分离，这极大地限制了新产尿石素A菌株的发现。鉴于许多细菌的基因或蛋白序列已存在于公共数据库中，如何有效利用这些序列数据，超越传统基于序列同源性搜索的局限性，快速准确地识别潜在的新型尿石素产生菌及其关键酶，成为亟待解决的科学问题。
研究目的
本研究旨在整合传统的基于序列的同源搜索与基于人工智能的结构建模技术，开发一种新的筛选策略。具体目标是利用已知的Enterocloster属9-OH尿石素脱羟基酶作为参考，通过分析候选酶的三维结构，特别是活性位点结合口袋的保守性，来识别系统发育上更为多样、但可能具有相同催化功能的细菌及其酶，从而拓展已知的尿石素A生物合成潜力。
主要关键技术方法
- 1.
多平台序列筛选：以三种Enterocloster参考菌株（E. bolteae, E. asparagiformis, E. citroniae）的三个亚基（Mo结合大亚基、FAD结合中亚基、FES结合小亚基）氨基酸序列为查询序列，对NCBI等多个蛋白质和核苷酸数据库进行BLASTP和TBLASTN搜索，并通过亚基共现筛选和冗余去除，获得65个非冗余候选酶。
- 2.
系统发育分析：使用MAFFT对候选序列进行多序列比对，并通过IQ-TREE 2构建最大似然法系统发育树，以评估候选酶与参考酶之间的进化关系。
- 3.
AI辅助结构建模与辅因子注释：使用AlphaFold 3对参考酶和所有候选酶的三亚基复合物进行三维结构预测。通过FoldSeek搜索PDB数据库确定最适模板结构（1RM6, 3AMZ, 3UNI），并将FAD、两个[2Fe-2S]簇和钼辅因子（PCD）等关键功能辅因子整合到后续模型中。
- 4.
结合口袋分析与候选物优先级排序：在存在辅因子和底物尿石素C的条件下，对所有候选酶进行AlphaFold 3建模。应用几何过滤器，仅选择尿石素C的C9-羟基最接近钼中心（Mo）的催化相关构象模型。定义结合口袋残基（距配体或Mo中心4.4 ?内的残基），计算其与参考酶口袋的残基相似性和均方根偏差（RMSD）。仅保留口袋残基相似度超过75%的非Enterocloster候选物。
研究结果
3.1. 基于序列的同源搜索识别出65个候选物
通过多数据库BLAST搜索和亚基共现筛选，从570个初始命中中优先确定了65个潜在的同源酶。系统发育分析显示，三个Enterocloster参考酶形成一个与尿石素代谢相关的独特单系分支。其他候选物分布在不同的进化枝上，包括Dehalobacter restrictus、Aromatoleum sp.等，表明仅凭序列相似性不足以预测尿石素生产能力。
3.2. 整合口袋结构特征将候选物缩小至6个
对所有65个候选物进行AlphaFold 3建模和结合口袋分析。首先，参考酶模型成功展示了完整的电子传递链（FAD → [2Fe-2S]簇 → Mo）和正确的底物定位。其次，通过定义并比较结合口袋残基，发现仅有6个非参考候选物的口袋残基相似度超过75%。这六个候选物包括Lacrimispora sp. 210928-DFI.3.58、Dehalobacter restrictus、Aromatoleum sp.、Anaerovorax odorimutans、Cloacibacillus evryensis和Zhenpiania hominis。
3.3. 候选物活性位点的结构谱图和基于参考的比较分析
对参考酶的口袋分析揭示了16个核心保守残基（如催化性谷氨酸E741）。与参考酶相比，Lacrimispora sp.表现出最高的口袋相似性（100%序列一致性，RMSD低至0.49-1.26 ?），被认为是误分类的Enterocloster。Dehalobacter restrictus保留了15个核心残基，仅有一个非保守取代（Q341L），被评为最高置信度的非Enterocloster候选物。Aromatoleum sp.有两个非保守取代（Q341L和Y536F），被列为中等置信度候选物。Anaerovorax odorimutans、C. evryensis和Z. hominis共享相同的取代谱（含三个非保守取代），同样为中等置信度候选物。这些结果表明，高全局序列相似性并不保证活性位点架构的保守性，而口袋结构分析能更有效地筛选功能候选物。
讨论与结论
本研究通过将AI结构建模与口袋保守性分析整合到传统序列筛选流程中，成功识别出Lacrimispora sp.、Dehalobacter restrictus和Aromatoleum sp.等非Enterocloster候选菌，它们具有与已验证酶高度相似的预测口袋架构。研究发现，这一催化框架广泛分布于厚壁菌门（Bacillota）、变形菌门（Pseudomonadota）和互养菌门（Synergistota）等多个细菌门中，暗示了钼依赖性尿石素脱羟基能力的进化分布可能比预期更广。值得注意的是，此前报道的其他产尿石素A细菌并未出现在顶级候选列表中，这可能归因于数据库序列的代表性不足或序列差异过大。研究人员强调，虽然保守的口袋架构支持功能相似性，但底物特异性仍需生化实验验证。未来应重点对D. restrictus和Aromatoleum sp.进行异源表达和体外活性测定。此外，本研究采用的几何过滤和多模型共识方法有效减少了AI预测中配体构象的变异性，为复杂氧化还原酶的功能注释提供了更可靠的比较基础。
