《Biochemistry and Biophysics Reports》：Phototoxic effects of pheophorbide-a nanoconjugates on melanoma tumor spheroids
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黑色素瘤是致死率最高的皮肤癌类型，晚期确诊患者预后较差且发病率快速上升。光动力疗法（PDT）作为一种有前景的微创黑色素瘤治疗手段，其临床应用常受限于传统光敏剂（PSs）的肿瘤选择性差和细胞内蓄积不足。为解决上述问题，研究人员构建了一种主动靶向光敏剂纳米颗粒，将
黑色素瘤是致死率最高的皮肤癌类型，晚期确诊患者预后较差且发病率快速上升。光动力疗法（PDT）作为一种有前景的微创黑色素瘤治疗手段，其临床应用常受限于传统光敏剂（PSs）的肿瘤选择性差和细胞内蓄积不足。为解决上述问题，研究人员构建了一种主动靶向光敏剂纳米颗粒，将叶绿酸-a（Ppa）与金纳米颗粒（AuNPs）及叶酸（FA）偶联。AuNPs作为纳米载体具有高生物相容性、良好光物理性质和高载药能力等独特优势，有助于光敏剂的有效递送。研究人员合成了Ppa-AuNP-FA纳米生物偶联物，并对其形貌、稳定性和光动力性能进行了表征。该纳米光敏剂的光毒性效能在三堆维（3D）黑色素瘤多细胞肿瘤球体（MCTS）上进行了测试。游离Ppa的优化研究得出IC50浓度为9.3 μM，该浓度贯穿整个研究使用。高浓度Ppa显著破裂球体，提示需要对该光敏剂进行修饰以降低剂量依赖性并防止患者出现不良副作用。在激光照射（10 J/cm2）后，与游离Ppa和非靶向对照组相比，Ppa-AuNP-FA导致球体外膜显著破坏、细胞内活性氧（ROS）产生增加并诱导严重的细胞死亡。研究结果表明，Ppa与AuNPs和FA的偶联改善了光敏剂递送、光毒性和细胞摄取。Ppa-AuNP-FA复合物可能成为主动靶向纳米技术平台中改善恶性黑色素瘤PDT治疗的优秀方案。
黑色素瘤是致死率最高的皮肤癌类型，具有复杂的耐药机制和高转移潜能，限制了手术、化疗和放疗等治疗手段的疗效。光动力疗法（PDT）作为一种非侵入性治疗模式，依赖光敏剂（PS）、内源性分子氧和特定波长光的协同作用，通过产生活性氧（ROS）氧化脂质、蛋白质和核酸导致肿瘤细胞死亡。然而，传统光敏剂存在水溶性差、肿瘤蓄积不足和非特异性生物分布等局限。叶绿酸-a（Ppa）作为第二代光敏剂，具有600-800 nm强吸收、高效单线态氧生成和低暗毒性等优势，其分子结构允许与载体系统化学偶联。金纳米颗粒（AuNPs）作为纳米载体具有高生物相容性和高载药能力，而叶酸受体α（FRα）在多种恶性肿瘤中过表达，使叶酸（FA）功能化纳米载体成为提高肿瘤选择性摄取的有效策略。此外，多数PDT研究仍在二维（2-D）单层细胞模型上进行，无法充分反映体内肿瘤的复杂微环境，而三维（3-D）肿瘤球体更能模拟天然肿瘤的多种特征。因此，本研究旨在开发由Ppa、PEG化胺功能化AuNPs和FA组成的多组分纳米生物偶联物，用于3-D转移性黑色素瘤肿瘤球体的主动靶向光敏药物递送，以增强PDT治疗效果。
研究人员首先合成了PEG化柠檬酸盐-AuNPs，随后通过EDC/NHS碳二亚胺化学将Ppa和FA依次偶联到胺端PEG包覆的AuNP表面，成功制备了Ppa-AuNP-FA纳米偶联物。通过紫外-可见光谱、粒径分布和表面电荷分析、傅里叶变换红外光谱（FTIR）对纳米偶联物进行了表征，并研究了药物释放曲线、细胞摄取、亚细胞定位。研究使用人恶性黑色素瘤A375细胞系，在超低吸附U型底96孔板中生成多细胞肿瘤球体（MCTS），目标直径约450 μm。通过TEM表征纳米颗粒形貌，通过共聚焦显微镜进行亚细胞定位研究，通过LDH释放实验优化IC50浓度（9.3 μM），通过Calcein-AM/EtBr活/死染色、CytoTox 96细胞毒性实验、CellTiter-Glo 3D细胞活力实验、DCFH-DA ROS检测、Annexin V-FITC/PI流式细胞术、JC-10线粒体膜电位检测、ELISA检测细胞色素c释放以及Caspase-Glo 3/7活性实验综合评价光毒性效应和细胞死亡机制。
研究结果显示：紫外-可见光谱分析证实Ppa-AuNP-FA保留了Ppa（410、660、670 nm）、AuNPs（520 nm）和FA（370 nm）的特征吸收峰，表明Ppa成功偶联且光动力性质得以保持。TEM显示AuNPs、Ppa-AuNP和Ppa-AuNP-FA均为球形、分散良好，粒径约25-26 nm。DLS测得Ppa-AuNP-FA的水合粒径为298.3 ± 6.44 nm（PDI 0.773），Zeta电位为?37 ± 5.72 mV，表明胶体稳定性良好但呈多分散性。FTIR确认了酰胺键（1645-1636 cm?1）和Au-S键（600-607 cm?1）的形成。药物释放研究显示两种纳米偶联物均具有pH依赖性释放特征，在酸性pH（5.8）下释放更快更高（24 h内Ppa-AuNP释放88%，Ppa-AuNP-FA释放83%），而在生理pH（7.4）下Ppa-AuNP-FA释放显著低于Ppa-AuNP（47% vs 64%），pH敏感性比值分别为1.8和1.4，表明FA功能化可增加正常组织中的稳定性并减少脱靶释放。细胞摄取研究显示Ppa-AuNP-FA的细胞内蓄积最高（2.1 × 10? a.u.），分别为游离Ppa（1.0 × 10? a.u.）的2.1倍和Ppa-AuNP（1.7 × 10? a.u.）的1.48倍。亚细胞定位研究显示Ppa-AuNP-FA与溶酶体、线粒体和内质网均有视觉共定位。细胞形态学观察显示，未照射组球体保持完整外膜，而照射后各Ppa处理组球体出现显著形态学改变和外围破坏。活/死染色显示照射后Ppa-AuNP-FA组红色荧光最强、绿色荧光最弱。细胞毒性实验（LDH）显示照射后Ppa-AuNP-FA组中位LDH释放最高，但未达统计学显著性。ATP活力检测显示照射后游离Ppa、Ppa-AuNP和Ppa-AuNP-FA组细胞活力分别降至44%、31%和24%。ROS检测显示照射后游离Ppa、Ppa-AuNP和Ppa-AuNP-FA组ROS分别增加3.4倍、5.2倍和7.2倍，仅Ppa-AuNP-FA组达到统计学显著性（*p < 0.05）。流式细胞术显示Ppa-AuNP-FA + 激光组活细胞降至26%，早期凋亡增至46%，晚期凋亡增至27%（唯一达统计学显著性），坏死细胞比例低（<1%-3%），表明凋亡为主要死亡方式。线粒体膜电位检测显示所有含Ppa组照射后红色荧光显著降低（p < 0.001），仅Ppa-AuNP-FA组绿色荧光显著增加（*p < 0.05），表明最严重的线粒体损伤。ELISA显示Ppa-AuNP-FA组细胞色素c释放最高（较对照增加3.2倍），显著高于游离Ppa（2.3倍）和非靶向Ppa-AuNP（2.8倍）。Caspase-3/7活性检测显示Ppa-AuNP-FA组活性最高（2.7 × 10? RLU，较未处理组增加6.7倍），其次为Ppa-AuNP（5.5倍）和游离Ppa（3.9倍）。
讨论部分指出，本研究成功解决了PDT中光敏剂溶解度差、脱靶毒性、细胞内浓度低以及缺乏合适3-D细胞模型等局限。Ppa-AuNP-FA通过叶酸受体介导的内吞作用增强细胞摄取，在酸性肿瘤微环境中实现优先释放，并通过线粒体（内源性）凋亡途径主要诱导细胞凋亡。与游离Ppa和非靶向Ppa-AuNP相比，Ppa-AuNP-FA在更低光剂量（10 J/cm2）下即表现出更优的光毒性效果。研究同时承认了若干局限性，包括离心纯化可能未完全去除未反应的EDC/NHS和游离Ppa、DCFH-DA非特异性检测总ROS而非单线态氧、活/死染色5分钟孵育可能不足以完全渗透450 μm球体核心、亚细胞共定位数据为定性观察、缺乏药理学救援实验和Western blot验证、以及本研究仅为体外实验未进行体内验证。
研究结论翻译：综上所述，本研究成功开发并表征了一种主动靶向纳米光敏剂，并证明了其对黑色素瘤肿瘤球体增强的光毒性效应。该纳米偶联物尺寸小、稳定性优异、理化性质良好，并具有促进肿瘤特异性递送的pH依赖性药物释放特征。叶酸功能化显著增加了细胞摄取、ROS生成和通过线粒体途径的凋亡性细胞死亡，优于游离Ppa和非靶向Ppa-AuNP。3-D球体的使用提供了一个生理相关平台，紧密模拟了实体肿瘤的主要特征和患者中观察到的耐药模式。总体而言，这些发现表明Ppa-AuNP-FA是进一步临床前开发作为侵袭性黑色素瘤PDT有效纳米光敏剂的有前景候选物。未来研究应包括黑色素瘤异种移植模型的体内验证，包括药代动力学、生物分布和肿瘤靶向评估，以及靶向效率优化和联合治疗策略评价。
