通过酶消化法模拟中部动脉的退行性特征，以评估胸主动脉中与疾病相关的结构-功能关系

《Acta Biomaterialia》：Modelling Medial Degenerative Features by Enzymatic Digestion to Evaluate Disease-Relevant Structure-Function Relationships in the Thoracic Aorta

　　

摘要

背景

为了阐明主动脉微结构与功能之间的关系，我们使用了改进的、基于疾病机制的酶消化模型来评估主动脉中层的各个细胞外基质（ECM）成分（即弹性蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖）及其对升主动脉组织生物力学特性的影响。

方法

采用200微米厚的猪升主动脉中层切片，分别用弹性蛋白酶或胶原酶进行逐步消化，以选择性降解这些ECM成分。完整的牛主动脉组织则用软骨素酶、透明质酸酶和肝素酶处理，以完全去除蛋白聚糖。通过平面双轴拉伸试验获得了低应变模量、高应变模量、过渡区行为、应变-能量密度和能量损失等参数。弹性蛋白的降解过程通过双光子激发荧光成像技术进行观测；胶原蛋白的降解则通过普罗西鲁斯红色染色和偏振光显微镜观察；蛋白聚糖的含量和排列结构通过阿尔辛蓝染色法确认。

结果

弹性蛋白纤维的降解降低了低应变模量、应变-能量密度、过渡区应力及能量损失。胶原蛋白的降解同样降低了应变-能量密度，并减少了过渡开始时的应变；随着降解程度的增加，高应变模量和能量损失也有所减小。蛋白聚糖的去除减少了能量损失、应变-能量密度以及过渡开始时的应变，并提高了高应变模量。

结论

通过针对ECM降解特征进行建模，我们明确了主要基质成分的叠加效应，强调了主动脉疾病中结构与功能关系的复杂性及多因素性质。我们还发现了多种导致能量增加和主动脉组织易损性的微观结构途径。

意义声明

胸主动脉夹层是由于主动脉壁细胞外基质的渐进性降解引起的，然而各个基质成分对这种机械性故障的贡献仍不充分了解。为了解决这一困惑，我们开发了一种基于疾病机制的酶模型，能够对主动脉组织中的关键细胞外基质成分进行可控的、渐进性的修饰，比现有方法更能模拟体内观察到的部分降解过程。利用这一模型，我们系统地评估了弹性蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖降解的生物力学后果。研究发现，这些微观结构变化与主动脉易损性的增加密切相关。这些发现为理解主动脉疾病中的结构-功能关系提供了新的机制见解。

引言

升主动脉瘤会导致主动脉中层层状结构的异常改变，从而改变主动脉组织的力学特性，进而增加主动脉夹层等致命状况的风险[1,2]。这类改变统称为中层降解，包括弹性蛋白纤维的丢失和断裂、胶原蛋白的降解以及平滑肌细胞的减少，同时蛋白聚糖会积聚[2],[3],[4]。尽管这些单独的降解特征通常与特定的遗传性主动脉疾病（如马凡氏综合征和埃勒斯-丹洛斯综合征）相关，但实际上，中层降解并非由单一成分引起。无论主动脉疾病的病理生理学原因是什么，所有降解特征都会以不同程度共存，这使得难以确定每个成分在主动脉壁弱化和机械性故障风险增加中的具体机制作用。

通过选择性酶消化ECM成分，可以研究ECM改变对主动脉生物力学的影响。多项研究利用这一方法证实了弹性蛋白主导的低应变行为和胶原蛋白主导的高应变行为[5],[6],[7],[8],[9],[10]。然而，完全去除ECM成分并不能准确反映主动脉瘤中的中层降解情况。为此，其他研究采用了温和且渐进的酶消化方法来更好地模拟疾病过程[8],[11],[12],[13]。但组织学检查显示，随着消化向样本中部进行，酶通常会严重破坏主动脉组织边缘的弹性蛋白或胶原蛋白，从而捕捉到非生理性的成分-功能关系，这促使人们开发出更符合疾病实际的模型。

近年来，蛋白聚糖作为主动脉生物力学的关键调节因素逐渐受到重视，但在酶消化模型中，它们相对于弹性蛋白和胶原蛋白来说较少被作为研究目标。Beenakker等人通过原子力显微镜观察到去除蛋白聚糖后组织硬度降低[7]；Ghadie等人通过类似的压缩测试发现硬度增加，同时残余应力也有所减少[14]；Mattson等人则发现去除蛋白聚糖后整体硬度没有显著变化，但非线性应力-应变曲线的过渡点提前，应力松弛响应也减弱[15]。这些发现表明蛋白聚糖对主动脉力学的贡献多种多样，进一步强调了进一步研究其在疾病相关主动脉生物力学中作用的重要性。

因此，本研究的目的是通过基于疾病机制的酶降解模型，揭示弹性蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖等ECM成分如何影响主动脉壁的生物力学特性。

章节摘录

弹性蛋白和胶原蛋白的消化

由于猪的主动脉在结构和生物力学上与人类主动脉相似，并且易于进行可控、可重复的实验，因此选择了未经年龄限定的猪主动脉组织（n=10）作为研究对象。为了实现均匀的渐进性降解，我们获取了200微米厚的中层切片（见补充图1A-C），使酶能够作用于整个主动脉组织厚度（见补充图1D和1E）。

弹性蛋白降解建模

图1展示了弹性蛋白酶处理的效果。处理前（0小时），弹性蛋白纤维呈同心且连续的层状结构（图1A），平均片段长度为640±142微米（图1B），平均波形为12.6±3.5°（图1C）。所有纤维都沿圆周方向排列均匀（图1A中从左到右）。处理2小时后，弹性蛋白结构在整个组织厚度上出现了明显的断裂。

4. 讨论

通过针对性的酶消化模型，我们评估了主要ECM成分在主动脉组织生物力学中的作用。这些消化模型使用薄层主动脉中层，使得弹性蛋白和胶原蛋白的降解过程更加符合疾病实际情况。在蛋白聚糖消化模型中加入人类动脉瘤组织，有助于研究主动脉的粘弹性特性，这一点越来越受到重视。

5. 限制因素

本研究的局限性在于使用了200微米厚的切片，这不可避免地改变了组织的整体力学行为。然而，这种方法对于确保整个样本厚度内一致的降解是必要的。此外，由于本研究的目标是识别结构和力学趋势而非绝对的属性值，这一局限性并不影响我们对结果的解读。

6. 结论

本研究明确了主要基质成分在疾病中的生物力学作用，加深了我们对中层降解如何影响主动脉组织完整性的理解。研究发现，弹性蛋白纤维的降解会降低其在较低生理应变范围内的功能，从而减少弹性回缩，使组织更具韧性但在力学效率上较低，这表现为循环负荷下能量损失增加。

CRediT作者贡献声明

Daniella Eliathamby: 写作——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化，项目管理，方法论，数据分析，概念构思。Lucas Ung: 数据分析，数据管理。Hayley Yap: 数据分析。Malak Elbatarny: 数据分析。Maral Ouzounian: 写作——审稿与编辑，资源协调。Michelle Bendeck: 写作——审稿与编辑，监督，资源协调，方法论。Michael A. Seidman: 写作——

Daniella Eliathamby|Lucas Ung|Hayley Yap|Malak Elbatarny|Maral Ouzounian|Michelle Bendeck|Michael A. Seidman|Craig A. Simmons|Jennifer C.-Y. Chung