《Acta Biomaterialia》：Long-Term Structural Stability and Maturation of Centimeter-Scale Stretch-Grown Sensory Axons Following Collagen Encapsulation
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摘要由于生物学活性再生策略有限，周围神经损伤（PNI）仍然是一个重要的临床挑战。组织工程神经移植（TENGs）通过形成活的桥梁来引导和辅助自然再生过程，其中包含长距离延伸的、经过牵拉生长的轴突束，已成为一种有前景的策略。然而，其长期结构稳定性尚未完全了解。在这项研究中，我们评估了
摘要
由于生物学活性再生策略有限，周围神经损伤（PNI）仍然是一个重要的临床挑战。组织工程神经移植（TENGs）通过形成活的桥梁来引导和辅助自然再生过程，其中包含长距离延伸的、经过牵拉生长的轴突束，已成为一种有前景的策略。然而，其长期结构稳定性尚未完全了解。在这项研究中，我们评估了背根神经节（DRG）种植密度对机械牵拉生长后的TENGs在3-7周内的结构稳定性和形态的影响，这些TENGs经过了三维胶原蛋白包裹并从机械生物反应器中取出。由20、40或80个DRG生成的TENGs保持了神经元-轴突的表型，并在所有条件下都表现出强烈的纵向轴突排列。虽然高密度的TENGs随着时间的推移长度有所减小，但整体收缩程度有限，各组之间的收缩率没有显著差异。牵拉生长的轴突在包裹后5-7周内仍保持了超过90%的初始长度。高密度的TENGs还表现出DRG的整合和融合增加，形成了连续的神经元体细胞场，这些场与牵拉生长的轴突垂直排列。此外，定量分析显示轴突束结构的密度和时间依赖性重建，其特征是束直径增加，而束数量没有显著变化，这与轴突的逐渐增厚、捆绑和网络巩固一致。尽管有这种与成熟相关的重建，TENGs在培养过程中仍保持了整体的结构完整性和排列。
意义声明
组织工程神经移植（TENGs）利用活的、牵拉生长的轴突来指导周围神经损伤后的修复，但它们的长期结构稳定性尚不清楚。在这项研究中，我们发现用不同密度的背根神经节制造的胶原蛋白包裹的TENGs在长达七周的时间内仍然完整，保持了纵向轴突排列，并保留了超过90%的原始长度。同时，其内部结构通过轴突捆绑和束直径增加而继续成熟，尤其是在细胞密度较高的情况下。这些发现表明TENGs可以在不失去整体形状或尺寸的情况下进行生物重建。这种“动态稳定性”对于可重复的生产、储存、手术操作以及未来将活神经移植用于周围神经修复非常重要。
引言
周围神经损伤（PNIs）对临床医生来说是一个挑战，因为其发病率高，内源性再生能力不足，且临床干预措施有限。元数据分析显示，1.64-2.8%的创伤患者遭受肢体相关神经损伤[1,2]。同样，在美国和欧洲，每年约有50万例因PNI而进行的外科手术[1]。PNI包括急性挤压损伤和切断以及慢性压迫[[3], [4], [5]]。神经切断后，目前的治疗方法包括使用直接吻合术进行外科干预，对于长缺损，还使用自体移植（金标准治疗）、同种异体移植或神经导引导管，有时还会结合电刺激、磁刺激等[6,7]。尽管目前的治疗方法在某些PNI病例中取得了成功，但大多数患者会经历终生症状，如肌肉损失、感觉功能障碍、本体感觉缺陷以及部分或完全的运动功能丧失[5]。据估计，只有50%的患者能够恢复完全的感觉和运动功能[8]。不幸的是，自体移植的金标准治疗涉及移除健康的感官神经并将其植入损伤区域，导致患者身体其他部分的功能受损。
神经的退化和再生生物学过程非常复杂，导致患者的恢复程度不一。在完全神经切断的情况下，远端残端的退化在受伤后的第一周就开始了。这一过程被称为Wallerian退化，首先表现为受伤神经的轴突细胞骨架快速分解，随后髓鞘碎裂和血-神经膜通透性增加[9]。在此过程中，巨噬细胞通过释放生长因子和清除碎片来帮助再生[10]。最后，在受伤后的几周或几个月内，巨噬细胞发展出更具再生能力的表型，施万细胞形成了Bungner带以支持轴突再生[11]。在严重情况下，受伤神经周围的组织损伤和疤痕形成会复杂化恢复和再生过程。
组织工程神经移植（TENGs）在过去十年中成为引导周围神经再生的一种有前景的策略[[12], [13], [14], [15], [16]]。感觉TENGs是通过种植两组平行的背根神经节（DRG）并让它们牵拉生长来制造的[12]。也曾经制造过由运动神经元组成的TENGs[17]。牵拉生长涉及施加机械张力以分离这两组细胞，从而形成延长的轴突束。在牵拉生长过程中，轴突逐渐与邻近轴突形成束状结构。牵拉生长后，TENGs被包裹在胶原蛋白细胞外基质（ECM）中，为其在移植前和移植期间的轴突保护提供所需的结构稳定性。先前的研究表明，TENGs在Rat和猪的PNI模型中的表现优于无细胞神经导引管，并且在轴突再生率、移植前施万细胞浸润和电生理功能方面与自体移植相当[12],[18],[19],[20]]。有趣的是，在猪模型的超长距离再生情况下，TENGs的表现与自体移植相当，甚至在某些情况下更优[18]。
如前所述，TENGs在牵拉后会被包裹在胶原蛋白ECM中以提供结构稳定性和保护。历史上已经证明胶原蛋白在体外条件下会收缩[21]，尤其是在与细胞一起培养时。研究表明，胶原蛋白基质的收缩通常是由细胞产生的牵引力驱动的，收缩的幅度取决于嵌入细胞的表型——也就是其产生力的能力。例如，韧带成纤维细胞、人类牙龈成纤维细胞和颅骨细胞产生的收缩力不同，导致胶原蛋白凝胶的收缩程度也不同[21]。在工程化的三维神经组织中也观察到了神经元与胶原蛋白之间的类似相互作用。例如，嵌入胶原蛋白基质的神经元保持存活状态，延伸并排列轴突，主动重组细胞外基质以建立相互连接的神经网络[22]。更具体地说，DRG在基于胶原蛋白的三维培养中产生了强烈的收缩力[23]。同样，从神经元延伸出的轴突也表现出机械活性，这是由于细胞-细胞和细胞-ECM之间的粘附分子使轴突能够在各种环境中移动。收缩最初可能受到生长锥介导的肌球蛋白II张力的影响；然而，成熟的TENG轴突可能通过轴突内的肌动蛋白-肌球蛋白相互作用继续产生机械力，从而在生长锥消失后仍能进行结构重塑[24,25]。这些收缩特性对于TENG的长期储存和手术应用是一个担忧，因为存在结构变化和收缩导致移植物缩小的风险，尤其是当DRG在培养中继续扩展其延伸部分时。尽管对活体工程神经组织的兴趣日益增加，但轴突力学与胶原蛋白重塑在长时间培养中的相互作用仍不明确。因此，胶原蛋白包裹的活体神经组织的长期结构稳定性和形态仍是一个未解决的问题。
在这项研究中，我们分析了在牵拉后3-5周内，厘米级牵拉生长轴突的结构稳定性和形态。我们还研究了在不同DRG数量（即20、40或80个DRG）下，固定种植尺寸对TENG结构和胶原蛋白收缩的影响。分析重点关注轴突束的形态、束数量、DRG的融合以及富含轴突的胶原蛋白包裹TENGs的整体结构完整性。
章节片段
背根神经节的采集
本研究中进行的所有动物程序均得到了宾夕法尼亚大学和Coral Michael J. Crescenz VA医疗中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。动物护理和实验程序遵循《实验室动物护理和使用指南》并遵守ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南[26]。
DRG来自胚胎第16天的大鼠胚胎
TENGs保持感觉神经元表型和轴突排列
在评估密度依赖性效应之前，首先分析了成熟TENGs的基线表型组成。免疫标记通过MAP2和TUJ1染色确认了神经元身份，而CGRP染色确认了种植后两周DRG神经元的典型感觉表型（图2A）。TENGs表现出强烈的纵向轴突排列，并从牵引膜到底膜保持一致的表型（图2B）。更高倍数的分析显示了完整的轴突形成
讨论与结论
包含长距离延伸轴突的组织工程神经移植已成为治疗PNIs的有希望的方法。这些移植利用来自背根神经节的轴突束提供结构引导和生物支持。本研究分析了不同DRG密度制成的TENGs的结构稳定性和形态。尽管它们在促进再生方面具有潜力，但对于其5周内的结构稳定性知之甚少
CRediT作者贡献声明
Viviana Alpizar Vargas：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学，数据分析，概念化。Chunghsun Lin：撰写 – 审稿与编辑，调查。Robert B. Shultz：撰写 – 审稿与编辑，方法学，概念化。Hannah H. Lee：撰写 – 审稿与编辑，概念化。D. Kacy Cullen：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，方法学，概念化。
Viviana Alpizar Vargas|Chunghsun Lin|Robert B. Shultz|Hannah H. Lee|D. Kacy Cullen
