通过模拟自组装水凝胶重塑干细胞微环境来促进功能性牙髓再生

《Acta Biomaterialia》：Boosting Functional Dental Pulp Regeneration by a Biomimetic Self-assembling Hydrogel through Remodeling the Stem Cell Niche

　　摘要
无细胞策略用于牙髓再生依赖于内源性干细胞的募集，但仅细胞进入是不够的。这些干细胞需要分阶段的微环境信号来支持早期的机械适应，并在后期协调成牙本质生成、血管生成和神经支持的反应。在这里，我们报告了RQK（RADA16/QP5/KLT），这是一种可注射的自组装肽水凝胶，旨在将类似细胞外基质的结构与具有指导作用的生物活性信号整合在一起，以实现功能性牙髓再生。RQK结合了RADA16（RAD）纳米纤维骨架、来自amelogenin的成牙本质生成基序QP5以及模拟血管内皮生长因子（VEGF）的血管生成基序KLT。该水凝胶在37°C下形成，具有可注射性和恢复性，并能适应不规则的根管空间。在三维培养中，RQK引导人类牙髓干细胞经历一个分阶段的再生过程：首先维持干细胞特性和机械敏感性信号，然后促进黏附重塑、成牙本质分化、增强血管生成活性，并提供神经支持作用。转录组分析进一步将这一分阶段反应与细胞外基质相互作用、细胞黏附、机械敏感性信号和发育程序联系起来。分子动力学模拟和超微结构分析表明，RQK与胶原蛋白之间的相互作用创造了一个有利于成牙本质分化的基质环境。此外，在受感染的未成熟比格犬牙齿模型中的不同阶段评估显示，RQK促进了根尖愈合和持续的根发育。新形成的类似牙髓的组织功能更强，并显示出成牙本质细胞排列、血管生长和神经组织形成。这些发现表明，仿生微环境重建可以指导内源性干细胞的行为，并改善体内的无细胞牙髓再生，为增强原位组织再生提供了一个仿生框架。

意义声明
本研究开发了RQK，一种用于无细胞牙髓再生的可注射自组装肽水凝胶。与传统支架设计不同，RQK结合了模拟细胞外基质的纳米纤维基质以及成牙本质生成和血管生成的生物活性基序。该水凝胶在37°C下形成，能适应不规则的根管空间，并通过分阶段的微环境信号指导内源性干细胞的行为。它支持早期的机械适应、后续的成牙本质分化、血管生成活性以及神经支持作用。在受感染的未成熟比格犬牙齿模型中，RQK促进了根尖愈合、持续的根发育和有组织的类似牙髓的组织形成，为增强原位组织再生提供了一种仿生策略。

引言
牙髓是一种高度血管化和神经化的结缔组织，其活力依赖于成牙本质细胞、间质细胞和专门的神经血管网络的协同作用[1,2]。因此，成功的牙髓再生不能仅仅通过根管是否被新组织填充来判断。一个更有意义的目标是重建能够支持营养、感觉功能、牙本质修复的活体牙髓组织，在未成熟的牙齿中还能促进根的继续成熟[3]。与细胞移植相比，包括细胞外囊泡和去细胞化细胞外基质在内的无细胞再生牙科策略在临床转化方面更具吸引力，因为它们避免了与细胞来源、体外扩增、免疫兼容性、成本和监管相关的许多实际障碍[4], [5], [6]。尽管如此，当前的再生牙科程序仍然常常产生修复性的根管内组织，而不是具有有序血管化、神经支配和成牙本质细胞相关功能的真正再生牙髓组织[6,7]。

细胞微环境并不是一个被动的背景，而是一个由生物、化学和物理信号组成的动态环境[8,9]。除了生长因子和细胞因子等可溶性信号外，干细胞还感知来自周围环境的生物物理信号，包括细胞外基质（ECM）的组成、基质结构和局部生物特性。这些信号随后被转化为影响细胞命运的细胞内途径[10,11]。同样，在牙髓中，富含胶原蛋白和生物活性分子的ECM直接参与牙髓细胞的募集、极化以及修复活性[12], [13], [14]。因此，用于无细胞策略的支架不仅应作为结构支持，还应作为局部再生环境的关键调节器[12,15]。受天然牙髓微环境的启发，已经设计了水凝胶平台来通过调节基质力学、可降解性和细胞黏附配体呈现来调节干细胞行为。然而，许多水凝胶系统仍然倾向于只关注生物物理调节或生物活性信号的传递。这两个方面的协调整合仍然有限，这在一定程度上解释了为什么功能性牙髓再生仍然难以实现[5,12,13]。

自组装肽水凝胶提供了一种解决这一设计挑战的方法，因为它们可以形成类似于天然ECM的可注射纳米纤维基质，并允许相对精确地结合生物活性基序[16,17]。RADA16（RAD）是一种合成的自组装肽，由四个重复的RADA基序（Arg-Ala-Asp-Ala）组成，属于离子自互补肽家族。其疏水性丙氨酸残基和带相反电荷的氨基酸的规则排列促进了在生理条件下的β-折叠形成和随后高度水合的纳米纤维基质组装[18,19]。基于RAD的支架已被探索作为血管和神经组织再生的三维基质，并且还可以用组织特异的生物活性基序进行功能化[20,21]。在本系统中，RAD作为基质形成的结构骨架和功能性肽的呈现。QP5是一种由我们团队从amelogenin保守的Gln-Pro-X重复区域及其C末端序列衍生出的肽。虽然它本身不能自组装，但我们的先前研究表明，QP5可以被牙髓细胞有效摄取，并促进其迁移和成牙本质分化，包括碱性磷酸酶活性的增加和成牙本质分化相关基因的表达[22,23]。这些发现支持在RQK系统中包含QP5作为指导招募的牙髓干细胞/祖细胞行为和成牙本质分化的指导性信号。KLT是一种模拟血管内皮生长因子（VEGF）的肽，可以促进血管生成。当在自组装肽系统中呈现时，它已被证明可以增强内皮细胞的存活、迁移和管状生成[24,25]。模拟ECM的材料通常将三维基质框架与生物活性成分结合起来，再现细胞外微环境的选定结构和细胞指导功能[26,27]。根据这一模块化设计原则，RQK（RAD/QP5/KLT）的三个组分分别发挥着互补的作用：RAD形成纳米纤维三维基质，QP5提供牙髓细胞迁移和成牙本质分化的指导信号，KLT提供模拟VEGF的信号以支持血管生成反应。因此，它们的整合结合了类似ECM的物理框架与与牙髓再生相关的选定生物信号。

在这里，我们开发了一种基于RQK的功能性牙髓再生策略，通过在一个自组装水凝胶系统中整合类似ECM的结构和具有指导作用的生物活性信号。RQK结合了RAD自组装骨架、来自amelogenin的成牙本质生成基序QP5以及模拟VEGF的血管生成基序KLT。这样，纳米纤维基质的形成和生物信号的处理就在一个平台上实现了。该水凝胶是可注射的，并且在生理温度下形成，可以将其输送到根管并适应其不规则的空间。在一个更反映天然细胞微环境的三维培养系统中，RQK以时间依赖的方式调节人类牙髓干细胞的命运：首先通过与纳米纤维基质的机械响应相互作用来保持干细胞特性，然后促进成牙本质分化以及血管生成和神经支持反应。分子动力学模拟表明，RQK可以在胶原蛋白界面促进钙和磷酸盐的吸附，从而创造一个有利于成牙本质分化的微环境。在受感染的未成熟比格犬牙齿模型中，这种策略进一步促进了有组织的类似牙髓的组织再生、神经血管重塑和持续的根发育。这项研究不是将支架视为被动载体或依赖于单一生物信号，而是专注于重建局部微环境以引导内源性干细胞在原位进行功能性牙髓再生。这种设计也为通过重现天然微环境的关键特征来指导更广泛的原位组织再生策略提供了信息。

部分摘录
肽合成和水凝胶形成
自组装肽R（RAD/RADA16, Ac-(RADA)?-NH?）、RAD-QP5（Ac-(RADA)?-QPYQPVQPHQPMQPQTKREEVD-NH?）和RAD-KLT（Ac-(RADA)?-G?-KLTWQELYQLKYKGI-NH?）由中国杭州的Bingtuo有限公司定制合成（纯度>95%）。所有肽的N端进行了乙酰化处理，C端进行了酰胺化处理。肽序列和描述列在表S1中。混合比例是根据先前的研究选定的[28,29]。冻干的肽溶解在蒸馏水中。

自组装肽水凝胶的特性
首先进行了质谱分析以验证合成肽的身份。RAD、RAD-QP5和RAD-KLT的测量分子量与其理论值非常接近，质量偏差分别为0.004%、0.001%和0.002%（表S1）。这些结果证实了所有三种肽的成功合成，并支持它们在水凝胶构建和特性分析中的使用。然后，我们成功构建了R（RAD）、RQ（RAD/QP5）和RK。

讨论
本研究描述了一种不依赖于细胞移植的再生策略。RQK设计的理念遵循了一种模块化的ECM模拟策略，其中不同的肽组分分别发挥不同的结构和细胞指导功能。RAD建立了纳米纤维三维框架，而QP5和KLT分别引入了成牙本质生成和血管生成信号[26,27]。这种模块化设计在模仿ECM的材料中越来越受欢迎，因为...