蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）水提物增强NK细胞抗人乳腺癌、结肠癌与肺癌活性的体外共培养研究

《Algal Research》：Immunoenhancement effect of water extract of Chlorella pyrenoidosa – in vitro research in co-cultures of NK cells with human breast, colon and lung cancer cells

　　

本研究评估了蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）水提物对自然杀伤（NK）细胞抗人乳腺癌、结肠癌与肺癌细胞活性的免疫增强作用，并对其直接抗癌特性及化学成分进行了表征。研究人员将人NK细胞系NK-92与人肺癌A549细胞、人结肠腺癌LS180细胞及人乳腺癌T47D细胞以1:1比例共培养，并单独或联合给予不同浓度（50、250、500、1000 μg/ml）的小球藻水提物处理48 h。通过MTT法检测细胞代谢活性、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估细胞膜完整性、细胞死亡检测酶联免疫吸附实验（ELISA）测定核小体富集以评价细胞凋亡，并以Hoechst 33342与碘化丙啶（PI）双染进行荧光显微镜形态学观察；同时在人皮肤成纤维细胞（HSF）与人结肠上皮细胞CCD841 CoN中考察选择性。化学成分分析采用苯酚-硫酸法测定糖含量、Bradford法测定蛋白含量、分光光度法测定多酚含量，并结合傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）糖组成与连接分析及核磁共振（NMR）波谱解析。结果显示，该水提物主要由糖（41.6 ± 1.45%）、蛋白（25.0 ± 2.58%）与多酚（9.1 ± 0.02%）组成，糖组分以葡萄糖（59.6%）和半乳糖（23.6%）为主，主要经→4)、→3)及→3,4)糖苷键连接，并含淀粉样α-构型→4)连接己糖单元。水提物单独作用即以剂量依赖方式降低三种癌细胞代谢活性、破坏细胞膜完整性并诱导凋亡，其中LS180细胞最敏感、T47D细胞相对耐受、A549细胞呈中间表型；与NK-92细胞联合应用后，对三种癌细胞的清除作用显著增强，且在A549与T47D细胞的细胞毒性层面、LS180细胞的代谢抑制与凋亡诱导层面观察到协同效应。该联合处理未对HSF与CCD841 CoN正常细胞产生可检测的不良影响，提示其具有选择性。上述结果表明，蛋白核小球藻水提物兼具直接抗癌与增强NK细胞抗癌活性的双重潜力，为其作为乳腺癌、结肠癌与肺癌辅助治疗策略的进一步研究提供了依据；但体外模型尚不能直接推断临床疗效与安全性，其增强癌细胞清除的机制亦不能完全归因于对NK细胞的直接作用。

研究背景与问题提出

结肠癌、乳腺癌与肺癌长期位居全球发病率和死亡率前列。据国际癌症研究机构数据，2020年乳腺癌、肺癌与结直肠癌新发病例分别为230万（11.7%）、220万（11.4%）与196万（10.0%），肺癌为癌症死亡首位原因，约180万例死亡（18%），结直肠癌与乳腺癌分别导致90万与70万例死亡。尽管诊断与治疗不断进步，癌症发病率仍逐年上升、死亡率居高不下。免疫治疗被视为扭转这一趋势的可能途径，其中自然杀伤（NK）细胞作为机体防御异常细胞的第一道防线，无需预先致敏即可识别并清除癌细胞，其细胞毒活性与癌症发生发展风险呈负相关，肿瘤内NK细胞浸润是有效肿瘤治疗的阳性预测指标。然而，基于NK细胞的治疗面临细胞来源与安全有效增强其抗癌效应两大问题，常用的细胞因子增强方式可能扰乱机体稳态。

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）在台湾与日本传统上作为食品，因其健康促进作用在欧洲消费者中日益流行。其营养价值与促进健康的特性与其组成密切相关：细胞壁约60%为蛋白质（含全部必需氨基酸）、约20%为碳水化合物，脂肪含量超过9%，其中多不饱和脂肪酸约占82%，并富含B族维生素、维生素C、D、K及Ca、Co、Cu、Fe、K、Mg、Mn、P、S、Zn等矿物元素，叶绿素含量在已知植物中最高。已有研究报道其免疫调节特性：Hsu等发现其热水溶性多糖（CWSP）经TLR4介导的蛋白激酶活化诱导巨噬细胞表达TNFα与IL1β，并增强巨噬细胞抗原提呈功能；Ewart等发现其水提物与人外周血单个核细胞（PBMC）孵育24 h可诱导Th1型细胞因子应答（TNFα、IFNγ）及强抗炎调节性细胞因子应答（IL10）；Kralovec等证明其水提组分可刺激BALB/c小鼠脾细胞增殖及巨噬细胞产生IL6、IL10、IL12、IFNγ、TNFα与NO，并在小鼠感染模型中有效减轻单核细胞增生李斯特菌与白色念珠菌感染。其有益作用与相对高分子量（>100 kDa）多糖及蛋白-多糖复合物相关，主要单糖为半乳糖（约22.6–50.6%）、鼠李糖（约18.3–35.5%）与阿拉伯糖（约13.9–25.9%），蛋白-多糖复合物（约22–26%）的主要氨基酸为天冬氨酸（约9.5–11.9%）与谷氨酸（约8.6–14.7%）。Kralovec发明的CPE（Respondin）在124名50–89岁健康成人的随机双盲安慰剂对照临床试验中，每日200 mg或400 mg服用28天并于第21天接种三价灭活流感疫苗，整体人群抗体应答未升高，但50–55岁参与者抗体应答增强；Otsuki等发现每日食用5–6 g、持续4–8周可提高sIgA浓度与分泌速率，支持黏膜免疫。

综上，已有研究揭示了蛋白核小球藻及其提取物的免疫增强潜力，但据研究人员所知，尚缺乏其组分对NK细胞及其抗癌能力影响的证据。本研究旨在填补这一空白，评估其水提物在NK-92细胞存在下对乳腺癌（T47D）、结肠癌（LS180）与肺癌（A549）细胞清除的影响，并以人皮肤成纤维细胞检验选择性与安全性，同时表征其主要成分尤其是多糖的化学特征。

主要技术方法

研究人员以市售Bio Chlorella（100%蛋白核小球藻干生物量，Green Ways，捷克布拉格）片剂粉碎后经无菌水20 °C旋转提取24 h、离心、过滤并冻干制备水提物。关键技术方法包括：MTT法检测细胞代谢活性、LDH释放实验评估细胞膜完整性、细胞死亡检测ELISA测定核小体富集以评价凋亡，以及Hoechst 33342/PI双染荧光显微镜观察细胞死亡形态；细胞模型为ATCC来源人NK细胞系NK-92、ECACC来源A549、LS180、T47D细胞，以及波兰卢布林农村卫生研究所医学生物学系以组织块外植法建立的人皮肤成纤维细胞（HSF）实验室株，另用CCD841 CoN人结肠上皮细胞作正常对照，共培养时贴壁细胞与NK细胞比例为1:1，处理48 h。化学成分表征采用苯酚-硫酸法测糖、Bradford法测蛋白、以间苯三酚为标样的分光光度法测多酚，FT-IR-ATR光谱（4000–400 cm^?1），SDS-PAGE（12%与14%凝胶），糖组成与连接分析（三氟乙酸水解、乙基化、NaBD₄还原、乙酰化后GC-MS分析），以及500 MHz ¹H/¹³C NMR（COSY、TOCSY、NOESY、HSQC-DEPT）。

研究结果

3.1 蛋白核小球藻水提物的主要成分：分光光度分析显示提取物主要由糖（41.6 ± 1.45%）、蛋白（25.0 ± 2.58%）组成，多酚含量（9.1 ± 0.02%）亦显著。SDS-PAGE分出约100、70、55、50、30、20、15、12与10 kDa的10条蛋白带，提示提取物含糖-蛋白复合物。

3.2 水提物的FT-IR光谱：约3300 cm^?1处宽强吸收峰为O–H与N–H伸缩振动，2924 cm^?1为C–H伸缩振动，1000–1200 cm^?1宽吸收带最大峰在1042 cm^?1，对应C–O、C–C伸缩与C–OH弯曲振动，均为多糖特征；2933与2880 cm^?1指示CH₃与CH₂的C–H键；1641与1542 cm^?1双峰指示蛋白酰胺I与酰胺II及吸附水；1453 cm^?1对应蛋白与脂质来源的CH₃、CH₂不对称变形振动；1403 cm^?1对应糖与蛋白的CH₃、CH₂及C=O基团；1237 cm^?1可能来自核酸与磷酸化蛋白的PO₂^?不对称伸缩振动，亦与酚类C–O伸缩（黄酮C环吡喃C–O）相关；1150–970 cm^?1重叠吸收带（最大1042 cm^?1）归属糖苷键C-O-C振动、环振动及侧基C-O-H伸缩，并可能对应核酸分子；950–820 cm^?1弱峰为α型糖苷键葡萄糖基聚合物特征。光谱同时显示蛋白与糖聚合物存在。

3.3 水提物的化学组成：GC-MS分析显示主要糖组分为己糖，即葡萄糖（Glc，59.6%）与半乳糖（Gal，23.6%），另检出鼠李糖（Rha）、核糖（Rib）、木糖（Xyl）、3-O-甲基-半乳糖（3-OMe-Gal）、甘露糖（Man）、葡萄糖胺（GlcN）及痕量阿拉伯糖（Ara）；除Rha为l-构型外，其余糖均为d-构型。连接分析显示糖主要以→4)连接，亦存在末端己糖残基及→3)、→3,4)、→2,3)、→4,6)连接。¹H NMR仅在异头氢区显示一个信号（δ = 5.21 ppm，标记为H1），最可能来自葡萄糖α-异头物；COSY与TOCSY确认仅存在一个可归属为4-连接葡萄糖残基的自旋体系，NOESY显示H1（δ = 5.21 ppm）与H4（δ = 3.50 ppm）间强NOE效应，证实水提物含大量淀粉，与FT-IR及化学分析中α-异头→4)连接己糖单元的结果一致。

3.4 水提物增强NK细胞抗人肺癌、结肠癌与乳腺癌细胞活性：MTT法显示，水提物在50、250、500、1000 μg/ml浓度下使肺癌细胞代谢活性分别降低37.5%、40.7%与41.8%；NK-92细胞单独作用使A549细胞活力降至61.3%，联合250–1000 μg/ml水提物后进一步降至44.7%（250 μg/ml）、44.7%（500 μg/ml）与39.00%（1000 μg/ml）。LS180细胞对直接抗癌作用最敏感，代谢活性在四个浓度下分别降低25.3%、46.4%、52.3%与58.4%；NK细胞单独作用使LS180细胞减少22.7%，联合水提物后分别减少62.2%、73.2%、75.2%与76.8%。T47D细胞在250–1000 μg/ml水提物作用下活力分别降低17.8%、29.7%与36.6%；NK-92细胞单独作用清除28.3%的乳腺癌细胞，联合水提物后活力降至58.0%（250 μg/ml）、53.2%（500 μg/ml）与43.8%（1000 μg/ml）。需强调，250–1000 μg/ml水提物与NK细胞联合对乳腺癌与肺癌细胞的清除显著强于同浓度水提物单独作用；对结肠癌细胞，全浓度范围内联合作用不仅更有效，且提示协同作用。

LDH实验显示水提物对A549、LS180与T47D细胞具细胞毒作用，最显著变化见于LS180与A549细胞，1000 μg/ml水提物使LDH释放分别增加70.0%与69.6%；T47D细胞敏感性较低，250 μg/ml（LDH为对照的113.3%）至1000 μg/ml（126.3%）时出现显著膜完整性损伤。NK-92细胞单独作用亦对A549、T47D与LS180细胞显示细胞毒作用，LDH水平平均增加47.2%、45.1%与39.1%。水提物全浓度范围显著增强NK-92细胞对癌细胞的清除：A549细胞联合处理后LDH水平达184.5%、205.5%、218.0%与244.4%；LS180细胞从131.9%（NK细胞单独）升至162.0%（50 μg/ml）、179.9%（250 μg/ml）、184.7%（500 μg/ml）与190.0%（1000 μg/ml）；T47D细胞为161.1%、164.1%、177.0%与193.6%。比较单独与联合作用显示，水提物与NK细胞在A549与T47D细胞中具协同细胞毒效应，联合处理造成的膜损伤大于两者直接效应之和。

细胞死亡检测ELISA显示，水提物使A549细胞核小体数增加22.6%（250 μg/ml）、28.3%（500 μg/ml）、35.1%（1000 μg/ml），T47D细胞分别增加18.6%、25.0%与34.9%；LS180细胞对促凋亡作用最耐受，但全浓度范围使DNA片段化增加7.7%、17.8%、19.9%与21.1%。NK-92细胞诱导程序性细胞死亡，使A549、T47D与LS180细胞核小体量分别升至对照的253.5%、219.8%与125.3%。水提物全浓度范围与NK-92细胞联合使LS180细胞核小体量从125.3%（NK细胞单独）升至136.0%、148.8%、149.5%与153.0%，显示协同促凋亡作用；而A549与T47D细胞仅在最高浓度联合处理时凋亡显著改善，DNA片段化分别增加179.3%与145.5%，观察到的凋亡诱导主要源于NK-92细胞活性（联合1000 μg/ml水提物者除外）。

以人皮肤成纤维细胞与人结肠上皮CCD841 CoN细胞进行的同系列实验（MTT、LDH、ELISA）显示，水提物未引起正常细胞活力的不良变化；NK-92细胞单独作用不影响成纤维细胞与结肠上皮的代谢活性、膜完整性，亦不触发程序性死亡；联合处理亦未改变上述生物学过程，唯一例外是1000 μg/ml水提物与NK细胞联合使成纤维细胞代谢活性从97.2%（NK-92单独）升至102.9%。

Hoechst/PI双染显微分析印证了LDH与ELISA结果：水提物在A549、LS180与T47D细胞中同时诱导坏死与凋亡，且随浓度升高而增强，但主要形态学特征为质膜完整性丧失伴PI摄取，提示坏死是提取物直接诱导的主要死亡方式，Hoechst阳性核浓缩和/或碎裂的凋亡细胞亦可见但程度较轻；各细胞系反应差异明显，LS180对细胞死亡诱导最敏感，250 μg/ml及以上几乎影响整个细胞群体，T47D最耐受，即使最高浓度仍有相当比例细胞保持正常核形态且PI阴性。NK-92细胞亦诱导凋亡与坏死变化，以膜完整性丧失相关的细胞毒为主。联合处理后癌细胞清除明显增加，伴坏死与凋亡细胞水平升高，但主要形态学表现仍为PI摄取与质膜破坏，坏死是联合处理下癌细胞清除的主要终点；水提物对NK细胞抗癌作用的有益影响呈剂量依赖，且效应大小取决于癌细胞系，LS180细胞联合处理后细胞死亡增幅最显著，A549细胞相对更耐受。

讨论与结论

讨论指出，既往研究多将蛋白核小球藻制剂的免疫增强作用归因于改善巨噬细胞、脾细胞与外周血单个核细胞的细胞因子产生，以及促进sIgA生成与分泌，但缺乏其对NK细胞影响的证据。本研究首次在NK细胞与癌细胞共培养体系中考察其水提物的作用，发现联合给予水提物与NK-92细胞可显著改善对人肺癌A549、结肠癌LS180与乳腺癌T47D细胞的清除，且增强的范围与性质因细胞模型而异：A549细胞中联合处理引起明显更强的膜损伤与代谢活性紊乱，细胞毒层面呈协同，凋亡的显著增强仅见于最高浓度；T47D细胞反应相似但较弱，该细胞系对单独与联合处理均相对耐受，水提物的贡献主要在于增强淋巴细胞细胞毒而非广泛促进凋亡；LS180细胞改善最显著，全浓度范围内联合效应超过单独作用之和，代谢抑制与凋亡诱导均呈协同，膜崩解是其主要清除机制。联合处理对恶性细胞具有明显选择性，未影响人结肠上皮细胞与人皮肤成纤维细胞的活力、增殖或形态。

与Chlorella vulgaris相关研究比较：Kwak等的随机双盲安慰剂对照试验显示每日食用5 g、持续8周可提高NK细胞对K562细胞的细胞毒能力；Chang等发现42天膳食补充可恢复环磷酰胺慢性暴露抑制的小鼠免疫功能，包括恢复NK细胞对YAC-1细胞的细胞毒特性；Queiroz等发现10天口服50 mg/kg可对抗醋酸铅所致不良变化并维持NK细胞对YAC-1细胞的细胞毒活性，且能提高未处理小鼠来源NK细胞的细胞毒活性。但上述研究均未使用均一NK细胞群体（分别使用小鼠脾细胞或外周血单个核细胞），而本研究采用经多项临床研究证实具有治疗实用性的人NK-92细胞系，因而具有独特价值。

化学分析显示，本研究水提物以糖（41.6%）为主，葡萄糖（59.6%）与半乳糖（23.6%）占优，主要经→4)、→3)与→3,4)糖苷键连接，与Hsu等报道的CWSP单糖组成（鼠李糖31.8%、葡萄糖20.42%、半乳糖10.28%、甘露糖5.23%、木糖1.27%）不同，后者基于甲基糖苷三甲基硅烷化衍生物的GC-MS分析；与Ly等、Chen等、Pugh等报道的多糖糖组成亦存在差异，本研究还检出3-O-甲基-半乳糖（1.7%）。蛋白为第二大成分（25.0%），电泳显示约100、70、55、50、30、20、15、12与10 kDa的蛋白带，与Tejano等对C. sorokiniana的观察相似（其鉴定出延伸因子2、热休克蛋白70、V型H⁺ ATP酶亚基A、ATP合酶β亚基、磷酸甘油酸激酶、核酮糖二磷酸羧化酶活化酶、Fe-超氧化物歧化酶、50S核糖体蛋白L7/L12等），但仅凭分子量比较无法明确本研究制剂的蛋白组成。基于化学分析，研究人员认为该制剂为糖-蛋白复合物，与Kralovec研究中介导免疫增强作用的高分子量（>100 kDa）多糖及蛋白-多糖复合物相符；蛋白配体对多糖直接抗癌与免疫调节特性的有益影响已被多项研究证实，提取物中9%的多酚亦可增强免疫系统尤其是NK细胞对多种癌症的应答，故其治疗效力可能源于多种成分的组合，这与植物提取物比单一植物化学物抗癌作用更强、富含植物化学物的膳食比纯抗癌化合物更具健康促进作用的报道一致。

本研究还揭示水提物具有显著直接抗癌特性，以剂量依赖方式通过抑制代谢活性、诱导凋亡与降低膜完整性降低三种癌细胞活力，且效应因细胞系而异：LS180最敏感，T47D最不敏感，A549呈中间表型但膜完整性受显著影响且涉及凋亡。提取物对正常细胞无副作用，与研究人员此前在T47D与HT-29细胞中的观察一致，彼时发现其作用与抑制DNA合成（IC₅₀ BrdU 48 h HT-29 = 767 μg/ml；T47D = 1175 μg/ml）、抑制代谢活性（IC₅₀ MTT 96 h HT-29 = 25 μg/ml；T47D = 319 μg/ml）及损伤癌细胞膜（IC₅₀ LDH 48 h T47D = 1484 μg/ml）相关，且不干扰CCD841 CoN与HSF的上述过程；尽管部分研究使用相同细胞系与生化实验，但培养条件、培养基与检测时间点不同，这些差异进一步印证了该提取物选择性清除结肠癌与乳腺癌细胞而不影响正常肠上皮细胞与皮肤成纤维细胞的巨大化学预防潜力。T47D细胞结果与Kubatka等对同一原料的研究相符，后者MTT实验显示19.5–1250 μg/ml的蛋白核小球藻显著降低MCF-7细胞活力，最高浓度降低超过20%，并观察到凋亡与坏死诱导（156 μg/ml使早期凋亡细胞从0.75%升至12.87%（48 h）与31.67%（72 h），晚期凋亡/坏死细胞从3.72%升至8.48%（48 h）与16.18%（72 h）），且在N-甲基-N-亚硝基脲（NMU）诱导大鼠乳腺癌模型中，30 g/kg长期给药使乳腺癌发生率降低61%、肿瘤潜伏期延长12.5天。就肺癌细胞而言，本研究首次证明蛋白核小球藻制剂的化学预防特性。

研究结论：本研究揭示，蛋白核小球藻水提物的存在显著改善人乳腺癌、结肠癌与肺癌细胞与其NK-92细胞共培养中的清除，且在同实验条件下对人皮肤成纤维细胞与人结肠上皮细胞培养无任何副作用；所收集数据亦表明该提取物具有显著直接抗癌作用。值得注意的是，反应强度在不同癌细胞系间存在差异：LS180细胞对直接效应与NK-92介导效应均最敏感，T47D细胞相对耐受，A549细胞呈中间反应且联合处理后膜损伤显著。这些发现表明蛋白核小球藻提取物的抗癌功效可能取决于靶细胞的内在特征。提取物单独作用、尤其在NK-92细胞存在下增强癌细胞清除，而未在所考察正常细胞中引起可检测的负面变化，突显了该提取物的明显选择性，支持其作为抗癌潜在应用的依据。但须明确指出，所观察到的共培养中癌细胞死亡增加不能明确归因于提取物对NK细胞的直接作用，也可能涉及提取物存在下癌细胞对NK细胞介导清除的易感性增加。另一值得注意的问题是研究模型：体外研究数据不足以直接得出临床疗效或安全性的结论，但鉴于人NK-92细胞系已确立的治疗相关性，上述发现为进一步研究该提取物作为乳腺癌、结肠癌与肺癌治疗潜在辅助策略提供了依据。后续研究还应阐明所观察到的直接与免疫增强抗癌能力的分子机制、表征其活性成分，并在更接近生理的模型中验证这些效应。