《Algal Research》：Lab-scale investigation of the potential of online chlorophyll
a PAM fluorescence in monitoring solar photobioreactors
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研究人员在实验室规模的环形光生物反应器（PBR）中培养普通小球藻（Chlorella vulgaris），评估了在线脉冲振幅调制（PAM）叶绿素a荧光在太阳光生物反应器监测中的有效性。研究人员将安装在PBR光学表面的PAM传感器获得的在线测量值与离线测量值进行
研究人员在实验室规模的环形光生物反应器（PBR）中培养普通小球藻（Chlorella vulgaris），评估了在线脉冲振幅调制（PAM）叶绿素a荧光在太阳光生物反应器监测中的有效性。研究人员将安装在PBR光学表面的PAM传感器获得的在线测量值与离线测量值进行比较。通过将在线测量与能够确定培养物体积内光衰减条件的辐射传递模型相结合，PAM叶绿素a荧光被用于估算光学密集培养物中的动力学参数，如与生物量生产直接相关的光合速率（例如光合生长速率）。研究结果表明，在线Y[PSII]与离线Y[PSII]在光化光等于PBR培养物体积平均注量率Gmean时相当，证实了PBR光学表面的测量反映了其内部Y[PSII]的平均值。研究还证明了在线Y[PSII]能够快速检测不利生长条件（如无机碳限制和高溶解氧浓度），突出了基于PAM叶绿素a荧光的控制程序优化培养性能的潜力。此外，研究人员发现Y[NPQ]、叶绿素a含量和氧生产率等参数的准确性依赖于Fm和Fo的准确测量，这需要足够长的暗适应期。研究人员还观察到，从在线PAM荧光估算的PSII相对电子传递速率rETRPSII与从气体质量平衡测得的氧生产率rO2gas之间存在相似的变化趋势，尽管O2与电子产生之间的产率Φe并非常数，在高光下会降低。研究人员建议在太阳光生物反应器中增加暗室以进行固定暗适应期后的PAM荧光测量，并开发基于叶绿素a浓度估算辐射特性（Ea）和Gmean的理论模型，以实现从在线叶绿素a PAM荧光实时确定光传递条件和精炼氧生产率计算，进而估算生长速率（生产力）等动力学数据。
研究背景：微藻的大规模培养通常在太阳能条件下进行，包括开放池或封闭光生物反应器（PBRs），以限制生物污染。无论使用何种系统，微藻都受到动态环境条件的影响：阳光在一天中不断变化，细胞可能暴露于过量的光照下，尤其是在正午太阳辐照度最高时。微藻已发展出多种驯化过程和光保护机制来响应这些光照变化，如替代电子循环和调节性能量耗散为热。太阳能培养系统中的温度也可能显著变化，白天高温而夜间低温。已知低温会加剧光抑制，而高温会降解蛋白质导致细胞死亡。此外，高浓度溶解氧可能发生，对细胞有毒，因为其诱导光呼吸机制，可导致生长速率和生产力降低。优化太阳能培养操作以在给定户外条件下保持最佳生产力至关重要，监测工具具有首要相关性。PAM叶绿素a荧光是一种非侵入性技术，用于测量各种光合作用参数。光合系统（PS）光捕获复合体（LHCs）捕获的光能要么导向光化学，要么以热形式释放，要么作为荧光重新发射。通过测量体内发射的荧光量，可以收集关于光系统II（PSII）中电子受体氧化状态的信息，然后该信息可用于计算PSII中光化学能量转换的量子产率（Y[PSII]）或PSII中调节性非光化学能量损失的量子产率（Y[NPQ]）。Y[PSII]受光捕获天线、PSII反应中心以及PSII下游发生的过程影响。Y[PSII]通常随光照增加而降低，当光合生物经历非最佳条件时也会降低。脉冲振幅调制（PAM）叶绿素a荧光还可用于估算叶绿素a浓度和相对电子传递速率，后者通常与氧生产力相关。PAM叶绿素a荧光主要用于生理学研究，但也已成功用于研究在太阳能条件下生长的藻类培养物。例如，Masojidek等人在跑道池的两个培养深度使用它原位监测荧光，以研究光衰减对太阳能条件下生长的栅藻（Scenedesmus sp.）生理状态的作用。所揭示的培养深度、生物量浓度和光动态之间的复杂相互作用表明，不同深度的实际PSII量子产率遵循日光模式，无论培养深度如何，因此非光化学淬灭的松弛机制可能不够快，无法匹配细胞通过培养深度的位移速率。与这些研究一致，本工作的目的是评估PAM叶绿素a荧光在优化太阳能PBRs中微藻培养的有效性。研究人员比较了从安装在PBR光学表面的PAM传感器获得的离线和在线测量值。通过将在线测量与能够确定培养物体积内光衰减条件的辐射传递模型相结合，PAM叶绿素a荧光还被用于估算光学密集培养物中的动力学值，如光合速率，这与PBRs中的生物量生产（例如光合生长速率）直接相关。绿色微藻普通小球藻（Chlorella vulgaris）被用作模型物种。
研究人员开展了以下研究：在实验室规模的环形PBR中培养普通小球藻CCAP 21.119，该PBR配备脉冲振幅调制（PAM）叶绿素a荧光传感器（MicroPAM，Walz，德国），通过接触PBR光学前表面的光纤进行在线测量。培养物在连续恒化器模式下生长，使用LED面板提供人工入射光子通量密度（PFD），温度维持在25°C，pH维持在7.5，溶解氧浓度受控。研究人员设置了两种不同的光照方案：两次连续的光照阶跃转换（75至765 μmol photons m?2 s?1再回到75 μmol photons m?2 s?1）以建立整体方法，以及模拟太阳周期的典型日/夜循环以评估PAM叶绿素a荧光在线监测太阳培养关键参数的能力。离线分析包括测定无机碳、生物量、叶绿素a、叶绿素b和总类胡萝卜素浓度。使用双通量辐射传递模型确定给定培养深度z的光谱注量率Gλ(z)，并计算平均注量率Gmean。在线PAM测量每5分钟记录一次光适应状态下的有效荧光产率（F），并施加饱和闪光测量光照下的最大荧光产率（Fm‘）。每次采样后关灯10至15分钟以完全氧化PSII反应中心，测量暗适应下的最小荧光产率（Fo）和最大荧光产率（Fm）。离线PAM测量使用WaterPAM荧光仪，在暗适应后施加快速光曲线（RLC）。计算Y[PSII]、Y[NPQ]、相对电子传递速率rETRPSII和绝对ETRPSII。氧生产率rO2通过两种方法估算：从PAM荧光测量（rO2PAM）和从PBR中的气体质量平衡（rO2gas）。叶绿素a浓度通过Fo的校准曲线在线估算。研究人员还比较了在线和离线PAM荧光测量值，并进行了数据分析（Spearman相关和p值）。
研究结果：
3.1 在线和离线PAM叶绿素a荧光测量的比较
3.1.1 Y[PSII]测量：在两次连续PFD阶跃转换中比较在线和离线Y[PSII]测量值。在75 μmol photons m?2 s?1的第一个稳态下，在线Y[PSII]为0.648（±0.022，n=123）。在765 μmol photons m?2 s?1下，在线Y[PSII]降至0.394。在线Y[PSII]在765 μmol photons m?2 s?1下31小时后达到最小值0.22，然后波动并在400小时后稳定在约0.397（±0.027，n=807）。在线和离线值显示Spearman相关系数为0.80，p值为1.0×10??。在典型太阳光周期实验中，两种测量之间观察到密切相关性，Spearman相关系数为0.93，p值为4.6×10?12，在三天实验期间计算。基于此，在线Y[PSII]测量被认为是令人满意的。在线Y[PSII]测量被发现对入射光水平的变化反应良好，Y[PSII]遵循预期模式，随入射光增加而降低，随光照水平降低而增加。结论是在线PAM荧光传感器对于测量Y[PSII]值是有效的，并且非常适合本研究中使用的PBR在光学密集培养条件下操作。
3.1.2 Y[NPQ]测量：在线Y[NPQ]在PFD增加阶跃转换前为0.028（±0.004，n=123），然后在13小时后增加至最大值0.144，随后下降并在接下来150小时内波动于0至0.060之间。在线和离线Y[NPQ]测量在同一时期遵循相似趋势，但仅观察到中等相关性（Spearman因子0.42，p值0.011）。在典型光照周期实验中，在线Y[NPQ]从早上8：00（PFD为181 μmol photons m?2 s?1）开始增加，在下午3：00（692 μmol photons m?2 s?1）达到最大值0.21。离线Y[NPQ]最大值0.16在下午1：00（771 μmol photons m?2 s?1）达到。在线和离线测量之间发现Spearman相关系数为0.93，p值为7.5×10??。结论是准确的在线Y[NPQ]测定依赖于Fm参数的准确测量，这需要足够长的暗适应期。
3.2 通过在线荧光检测负面生长条件：在线Y[PSII]在一天开始时为0.63（±0.01，n=25），随着光照增加而开始下降。约中午12：00，在线Y[PSII]在6分钟内从0.28急剧下降至0.13，PFD无变化。下午1：00至4：00之间，它保持在同一低水平，离线Fv/Fm为0.52。下午4：20，Y[PSII]在10分钟内从0.13增加至0.27，PFD无变化（613 μmol photons m?2 s?1）。在低在线Y[PSII]值的培养物中，下午3：30发现无机碳浓度为0.27 mM，低于先前确定的5 mM（避免普通小球藻生长限制所必需）。约下午4：00向培养物中添加碳酸氢钠，导致Y[PSII]立即增加。在PFD从75增加至765 μmol photons m?2 s?1后90小时，Y[PSII]从0.51降至0.26，溶解氧从12.9增加至39.4 mg L?1。当溶解氧浓度在10小时后下降时，Y[PSII]值恢复至初始值。从这两个例子可以得出结论，如果遇到对生长有负面影响的培养条件，在线Y[PSII]可用于检测它们。
3.3 利用PAM叶绿素a荧光估算生物量生产力
3.3.1 叶绿素a浓度估算：在75 μmol photons m?2 s?1下，叶绿素a浓度的离线测量为14.8（±0.6 mg L?1，n=6），在线估算为15.1 mg L?1。在765 μmol photons m?2 s?1下150小时后，离线测量为56（±5，n=7）mg L?1，在线估算为68（±5，n=5）mg L?1。当PFD返回75 μmol photons m?2 s?1后120小时，离线测量为18（±1，n=4）mg L?1，在线估算为30（±5，n=4）mg L?1。尽管存在差异，离线测量和在线估算之间观察到Spearman相关系数为0.95，p值小于2.2×10?1?。
3.3.2 ETRPSII估算——氧生产力指标：rO2gas值范围为0.5至2.0 mol O2 m?3 h?1，而rETRPSII在25至160之间变化。当仅考虑rO2gas值在0.3至2.2 μmol O2 m?2 s?1之间的数据点时，rETR与rO2gas之间获得Spearman相关系数为0.65，p值低于2.2×10?1?。rETRPSII/rO2gas比值范围在40至100之间。当光强度增加时，该比值也增加，表明在更高光输入下，每单位氧气产生在PSII内转移更多电子。当PFD返回100 μmol photons m?2 s?1时，该比值立即下降。结果表明rETRPSII/rO2gas比值并非常数，阻止了基于在线rETRPSII测量准确估算氧生产率。
3.3.3 从在线PAM叶绿素a荧光测量估算氧生产率：在75 μmol photons m?2下，rO2PAM为0.44（±0.02，n=122）mol O2 m?3 h?1，rO2gas为0.53（±0.03，n=122）mol O2 m?3 h?1。当光照增加时，rO2PAM增加至2.77（±0.63，n=125）mol O2 m?3 h?1，rO2gas增加至1.34（±0.76，n=125）mol O2 m?3 h?1。在新光照水平适应后，rO2PAM为3.33（±0.30，n=1201）mol O2 m?3 h?1，rO2gas为1.74（±0.91，n=1201）mol O2 m?3 h?1。当PFD返回100 μmol photons m?2 s?1时，rO2PAM和rO2gas分别降至0.43（±0.03，n=3447）和0.42（±0.36，n=3447）mol O2 m?3 h?1。在从75至765 μmol photons m?2 s?1转换开始时，φO2|e?处于最大值0.14（±0.01，n=122）mol O2（mole?）?1。随着光照增加，该比值下降并在约150小时内保持不稳定，然后稳定在约0.07（±0.04，n=3147）mol O2（mole?）?1。当PFD返回100 μmol photons m?2 s?1时，φO2|e?立即增加至0.13（±0.06，n=143）mol O2（mole?）?1，然后在光照变化后的前20小时内略微增加，之后再次下降并稳定在0.12（±0.10，n=2705）。本研究中φO2|e?范围在0.07至0.15之间，与已发表值一致。
3.4 在太阳光PBRs中使用PAM叶绿素a荧光测量：本研究证明叶绿素a PAM荧光参数可提供关于微藻健康和生长速率（生产力）的关键见解。然而，Y[NPQ]和Fv/Fm等参数需要估算Fo和Fm，这只能在暗适应细胞中测量。这些值在实验日过程中被发现变化，因此不能在一天开始和结束时使用相同的值。因此，如果PAM荧光要用于太阳光PBRs，必须进行调整以允许在线Fo和Fm测量。例如，部分培养物必须被转移到暗室中进行PAM荧光测量，遵循固定的暗适应期（例如15分钟）。泵可用于将培养物输送至暗室，并调整流速使培养物在黑暗中停留数分钟。测量暗中的Fo和Fm以及光中的F′和Fm‘将产生准确的Y[NPQ]测量和培养物中叶绿素a浓度的良好估算。Y[NPQ]值将提供关于细胞对太阳培养中可能遇到的高光进行光调节能力的见解，而了解叶绿素a浓度将提供关于光衰减条件的信息。Y[PSII]测量将允许检测培养物中不利的生长条件，例如营养限制。
讨论部分总结：本研究证实，在线测量叶绿素a PAM荧光可用于监测典型光学密集培养条件下PBR性能。在线Y[PSII]被发现等同于离线Y[PSII]，当光化光等于PBR培养物体积平均注量率Gmean时，证实了PBR光学表面的测量反映了其内部Y[PSII]平均值。还证明了快速检测负面生长条件，突出了引入基于叶绿素a PAM荧光的控制程序以优化培养性能的潜力。某些源自叶绿素a PAM荧光的参数（如Y[NPQ]、叶绿素a含量和氧生产率）的准确性依赖于Fm和Fo参数的准确测量，这需要足够长的暗适应期。这些值在实验日过程中被发现变化，因此使用夜间期后获得的第一次荧光测量是不够的。通过线性插值光照期前后立即进行的测量来估算缺失的F0和Fm值是有用的，但在太阳培养中Fm变化可能更不规则。因此，如果PAM荧光要用于实际太阳光PBRs，增加暗室以在固定暗适应期（例如15分钟）后测量PAM荧光将是有益的。还研究了在线PAM荧光获取动力学值（如氧生产，与生物量生长相关）的潜力。比较从在线PAM荧光估算的PSII电子传递速率rETRPSII与PBR中测得的氧生产率rO2gas时观察到相似模式。尽管这种比例关系允许从叶绿素a荧光测量近似估算氧生产，但准确确定氧生产率需要了解O2与电子产生之间的产率Φe，该产率被发现并非常数，而是在高光下降低。因此，结合在线PAM荧光和气体测量可以提供关于不同培养条件下Φe演变的有价值见解，为研究光合转换效率响应环境光变化（如替代电子循环）的更基础研究铺平道路，而无需干扰或采样培养物。本研究的一个关键方面是平均注量率Gmean对总色素含量和生物量浓度的依赖性，两者都随光照条件和培养时间变化。开发基于叶绿素a浓度（可从叶绿素a PAM荧光获得）而非总色素含量估算辐射特性（Ea）和Gmean的理论模型将是有用的。这将使得能够从在线叶绿素a PAM荧光实时确定有意义的参数，包括培养系统中的光传递条件（例如光胁迫，如MRPA所代表），同时也允许从叶绿素a PAM荧光测量精炼氧生产率的计算，以便随后估算生长速率（生产力）等动力学数据。
研究结论翻译：本研究证实，在线测量叶绿素a PAM荧光可用于监测典型光学密集培养条件下PBR性能。在线Y[PSII]被发现等同于离线Y[PSII]，当光化光等于PBR培养物体积平均注量率Gmean时，证实了PBR光学表面的测量反映了其内部Y[PSII]平均值。还证明了快速检测负面生长条件，突出了引入基于叶绿素a PAM荧光的控制程序以优化培养性能的潜力。某些源自叶绿素a PAM荧光的参数（如Y[NPQ]、叶绿素a含量和氧生产率）的准确性依赖于Fm和Fo参数的准确测量，这需要足够长的暗适应期。这些值在实验日过程中被发现变化，因此使用夜间期后获得的第一次荧光测量是不够的。通过线性插值光照期前后立即进行的测量来估算缺失的F0和Fm值是有用的，但在太阳培养中Fm变化可能更不规则。因此，如果PAM荧光要用于实际太阳光PBRs，增加暗室以在固定暗适应期（例如15分钟）后测量PAM荧光将是有益的。还研究了在线PAM荧光获取动力学值（如氧生产，与生物量生长相关）的潜力。比较从在线PAM荧光估算的PSII电子传递速率rETRPSII与PBR中测得的氧生产率rO2gas时观察到相似模式。尽管这种比例关系允许从叶绿素a荧光测量近似估算氧生产，但准确确定氧生产率需要了解O2与电子产生之间的产率Φe，该产率被发现并非常数，而是在高光下降低。因此，结合在线PAM荧光和气体测量可以提供关于不同培养条件下Φe演变的有价值见解，为研究光合转换效率响应环境光变化（如替代电子循环）的更基础研究铺平道路，而无需干扰或采样培养物。本研究的一个关键方面是平均注量率Gmean对总色素含量和生物量浓度的依赖性，两者都随光照条件和培养时间变化。开发基于叶绿素a浓度（可从叶绿素a PAM荧光获得）而非总色素含量估算辐射特性（Ea）和Gmean的理论模型将是有用的。这将使得能够从在线叶绿素a PAM荧光实时确定有意义的参数，包括培养系统中的光传递条件（例如光胁迫，如MRPA所代表），同时也允许从叶绿素a PAM荧光测量精炼氧生产率的计算，以便随后估算生长速率（生产力）等动力学数据。
