标准化、数据结构与主成分分析载荷及得分的恢复：代谢组学与组学数据分析的警示性说明

《Analytica Chimica Acta》：Normalisation, data structure, and the recovery of PCA loadings and scores: A cautionary note for the analysis of metabolomics and omics data

　　

论文摘要翻译 组学数据（metabolomics、proteomics、transcriptomics等）中测量的变异包含两个组成部分：相关（wanted）变异，反映研究关注的生物学或生物化学差异，可通过设计实验加以操控；以及非相关（unwanted）变异，源于与研究问题无关的因素，如样品稀释度、样品制备或仪器响应的差异。在去除非相关变异的同时保留相关变异，是数据预处理的核心目标。 在分析组学数据时，不同样品的直接比较可能受到样品大小效应（size effects）的阻碍。当在n×p维数据矩阵X的p个分子特征（基因表达计数、代谢物浓度、蛋白质丰度等）上测量1×p维样品向量xi时，大小效应使得真实量值（浓度、丰度、表达量）无法直接观测；测量值的形式为di(xi) = di(xi1, …, xip)，其中di为样品i的大小因子（size factor）。这种不可比性对下游统计和数据分析产生后果，因为非期望的样品间变异可能超过所关注的生物学/生物化学变异。因此，必须通过标准化（normalisation）——组学研究流程中一项基本的数据预处理步骤——对每个样品的大小效应进行估计和去除。 大小效应因样品类型和实验平台不同而源于不同原因。在代谢组学中，主要源于与研究问题无关的生理因素，如饮水差异导致的尿液稀释（可引起排泄量15倍的变异），以及样品制备或仪器变异。在转录组学中，则源于文库大小、测序深度、转录本长度或GC含量的差异。 已有许多标准化方法被提出并得到充分综述和比较。不同标准化程序服务于不同目标：最小化组内样品间变异、准确定量浓度或倍数变化、生物标志物发现、改进分类和回归模型、准确估计相关性，以及时间序列、多路或多变量机器学习建模；也已有专门框架用于比较标准化方法。 由于大小效应及其标准化因子的分布通常未知，标准化因子wi的估计依赖于对数据结构的假设。标准化本质上是行缩放（row-scaling），与PCA的居中（centring）步骤产生问题性交互；标准化将相关与非相关变异混淆，从而扭曲PCA模型。标准化对PCA的影响主要取决于数据结构而非方法选择；载荷和得分通过不同机制恢复，二者很少能同时保留。没有任何单一标准化方法可以事先推荐，必须对多种方法进行比较。

论文解读文章

一、研究背景与问题提出

组学数据（metabolomics、proteomics、transcriptomics等）中测量的变异包含两个组成部分：相关变异（wanted variation），反映研究关注的生物学或生物化学差异，可通过设计实验加以操控；以及非相关变异（unwanted variation），源于与研究问题无关的因素，如样品稀释度、样品制备或仪器响应的差异。去除非相关变异同时保留相关变异，是数据预处理的核心目标。

当在n×p维数据矩阵X上测量p个分子特征时，样品间大小效应（size effects）使得不同样品的直接比较受到阻碍。大小效应源于不同原因：在代谢组学中，主要来自与研究问题无关的生理因素，如饮水差异导致的尿液稀释（可引起排泄量15倍变异），以及样品制备或仪器变异；在转录组学中，则源于文库大小、测序深度、转录本长度或GC含量差异。由于非期望的样品间变异可能超过所关注的生物学变异，必须通过标准化（normalisation）对每个样品的大小效应进行估计和去除。

尽管已有大量标准化方法被提出并得到综述和比较，不同方法服务于不同目标，但标准化对下游多元分析——尤其是主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）——的影响机制尚未被充分阐明。现有研究多聚焦于标准化方法本身的比较，而对标准化与PCA内在数学结构之间的交互作用缺乏系统性认识。这正是本研究开展的动因：揭示标准化作为行缩放操作与PCA居中步骤之间的深层交互，阐明数据结构和标准化方法选择对PCA模型恢复的影响机制。

二、研究内容与核心结论

研究人员系统分析了标准化对PCA载荷（loadings）和得分（scores）恢复的影响，得出以下核心结论：标准化是行缩放操作，与PCA的居中步骤产生问题性交互；标准化混淆相关与非相关变异，扭曲PCA模型；标准化对PCA的影响主要取决于数据结构而非方法选择；载荷和得分通过不同机制恢复，二者很少能同时保留；没有任何单一标准化方法可以事先推荐，必须对多种方法进行比较。

三、主要技术方法

研究人员采用了理论推导与数值模拟相结合的研究策略。在理论层面，从数学上解析标准化操作与PCA居中步骤的交互机制，推导不同数据结构下载荷和得分恢复的条件。在数值模拟层面，构建具有不同数据结构特征（如相关变异与非相关变异的比例、特征值分布形态等）的模拟数据集，系统比较多种标准化方法（包括总和标准化、中位数标准化、分位数标准化、基于参考样品的标准化等）对PCA结果的影晌。研究还使用了实际组学数据案例进行验证，以确认理论分析在真实数据场景中的适用性。

四、研究结果

标准化与PCA居中步骤的问题性交互

研究发现，标准化本质上是行缩放操作，即对每个样品（行）乘以一个缩放因子。PCA的第一步是居中（centring），即减去各变量的均值。行缩放与列居中之间存在结构性冲突：行缩放改变了每个样品的整体量级，而列居中依赖于各变量的均值结构。当标准化因子与数据结构中的相关变异或非相关变异存在关联时，居中步骤会将这些缩放效应重新分配至各变量，从而扭曲PCA所提取的主成分方向。

标准化混淆相关与非相关变异

标准化旨在去除非相关变异（如稀释效应），但研究发现，标准化操作本身可能将非相关变异与相关变异混淆。当非相关变异与相关变异在数据结构中不可分离时，标准化因子估计会同时受到两类变异的影响，导致标准化后的数据矩阵中相关变异被部分消除或非相关变异被部分保留，最终扭曲PCA模型所揭示的生物学结构。

数据结构决定标准化影响

研究的关键发现是：标准化对PCA的影响主要取决于数据结构，而非标准化方法的选择。具体而言，当数据中相关变异占主导且与非相关变异方向正交时，多数标准化方法能较好地恢复PCA载荷和得分；当非相关变异占主导或两类变异方向非正交时，不同标准化方法的性能差异显著，且没有任何方法能同时保留载荷和得分。

载荷与得分的恢复机制不同

研究揭示了载荷和得分恢复的差异性机制。载荷的恢复主要依赖于标准化后变量间的相对关系保持，而得分的恢复则依赖于样品间相对量级的正确重建。由于标准化同时改变变量间关系和样品间量级，且这两种改变不可同时完全校正，因此载荷和得分很少能同时被完整恢复。这一发现对依赖PCA进行生物标志物解释（载荷）和样品分类聚类（得分）的研究具有重要警示意义。

多种标准化方法必须比较

基于上述发现，研究人员强调：没有任何单一标准化方法可以事先推荐。标准化方法的选择必须结合具体数据结构特征，通过比较多种方法的PCA结果来确定最合适的方案。这一结论挑战了实践中常见的"默认使用某一种标准化方法"的做法。

五、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，标准化方法的选择不应仅基于其去除大小效应的统计性能，还必须考虑其对下游多元分析——特别是PCA——的结构性影响。研究结果对代谢组学和更广泛的组学数据分析实践提出了警示：标准化与PCA之间的交互作用可能导致对生物学结构的错误解读，尤其是在载荷解释和样品分群方面。研究人员建议，在实际分析中应系统比较多种标准化方法，并结合数据结构的先验知识进行选择。

研究结论可概括为：标准化是组学数据分析中不可或缺的预处理步骤，但其与PCA的交互作用具有数据结构依赖性，且载荷和得分的恢复机制不同，二者很少能同时保留。因此，不存在普适的最优标准化方法，研究人员必须在具体数据背景下比较多种方法，以避免对PCA结果的错误解读。这一结论为组学数据标准化方法的选择提供了理论指导，并对现有分析实践提出了重要的方法学警示。