pyrE缺失阻断布鲁氏菌嘧啶从头合成并减弱毒力，作为羊种布鲁氏菌减毒活疫苗候选株提供保护性免疫

《Frontiers in Immunology》：Deletion of pyrE disrupts pyrimidine de novo synthesis, attenuates virulence, and confers protective immunity as a live attenuated vaccine candidate against Brucella melitensis

　　

布鲁氏菌病（Brucellosis）由布鲁氏菌属（Brucella spp.）引起，是威胁公共卫生和畜牧业生产的重要人畜共患病。现有减毒活疫苗存在残余毒力和血清学诊断干扰等问题。靶向必需代谢途径构建营养缺陷型突变株是开发更安全疫苗的有前景策略。嘧啶从头合成途径对细菌在营养受限的胞内环境中存活至关重要。pyrE编码乳清酸磷酸核糖转移酶（OPRTase），该酶催化嘧啶合成的第一个关键步骤。然而，该途径在布鲁氏菌致病性中的作用尚不清楚。研究人员在羊种布鲁氏菌（B. melitensis）M5背景中构建了pyrE缺失突变株（ΔpyrE）及其互补株。体外评估了生长特性、应激敏感性、黏附、侵袭、胞内生存及含布鲁氏菌液泡（BCV）转运。以M5-90Δ26为参考，在小鼠模型中评价了毒力、免疫原性和保护效力。ΔpyrE表现出尿嘧啶依赖性生长缺陷，黏附、侵袭和胞内生存能力受损，但保留了正常的应激抵抗力和BCV转运逃逸溶酶体降解的能力。在小鼠中，ΔpyrE显著减毒，脾脏定植减少，肝脏病理减轻。ΔpyrE免疫诱导了持久的Th1偏向性免疫应答（IgG2a和IFN-γ升高），并提供了与M5-90Δ26相当的保护力，且长期效力更优。该研究表明pyrE对布鲁氏菌嘧啶合成和毒力至关重要。ΔpyrE株是一种安全、具有免疫原性和保护性的疫苗候选株，具有长期应用潜力，为布鲁氏菌病防控提供了新策略。

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属（Brucella spp.）引起的重要人畜共患病，全球分布，严重威胁畜牧业可持续发展和公共卫生安全。该病由革兰氏阴性兼性胞内病原体布鲁氏菌引起，可侵袭并持续定植于巨噬细胞等免疫细胞，通过抑制凋亡、干扰吞噬体成熟和逃避免疫清除等机制建立慢性感染。现有减毒活疫苗（如B. abortus S19、B. melitensis Rev.1、M5和B. suis S2）存在残余毒力、血清学诊断干扰或宿主范围有限等缺陷，开发安全有效且可区分感染与免疫动物的新型疫苗是迫切需求。靶向必需代谢途径构建营养缺陷型减毒疫苗已在沙门菌aroA缺失株、结核分枝杆菌leuD缺失株及布鲁氏菌purE/purK缺失株中得到验证。布鲁氏菌基因组携带完整的嘧啶从头合成基因（pyrBCDE等），前期研究表明该途径多个基因缺失可显著损害胞内生存和复制，但pyrE在布鲁氏菌致病性中的具体作用及其作为减毒疫苗靶点的潜力尚未系统报道。本研究以羊种布鲁氏菌M5为亲本株，构建了pyrE缺失突变株（ΔpyrE）及互补株（CpyrE），系统分析了体外生长特性、巨噬细胞内存活复制、小鼠模型中的毒力减毒程度及免疫应答水平，并以商业标记疫苗株M5-90Δ26为参考评估保护效力，旨在阐明pyrE在布鲁氏菌代谢和致病中的生物学功能，评价其作为新型减毒活疫苗候选株的潜力。

研究人员开展的主要关键技术方法包括：以羊种布鲁氏菌M5（CVCC 18）为亲本，通过同源重组和蔗糖负筛选构建pyrE缺失突变株，利用mini-Tn7转座子系统构建互补株；在布鲁氏菌肉汤（BB）和化学成分明确的Plommet赤藓醇（PE）培养基中测定生长曲线；采用H₂O₂、SNP、酸性pH、多粘菌素B和SDS进行应激敏感性检测；以RAW264.7巨噬细胞和HeLa细胞进行黏附、侵袭和胞内生存试验；采用间接免疫荧光分析BCV与LAMP-1共定位；以BALB/c小鼠进行毒力评估、残余毒力检测、免疫原性分析（ELISA检测IgM、IgG、IgG1、IgG2a及IFN-γ）和保护力攻毒试验；并进行肝脏组织病理学分析。

结果部分：（1）构建了羊种布鲁氏菌pyrE缺失突变株及互补株：通过PCR和Sanger测序确认pyrE精确缺失及互补株正确插入，10代传代证实遗传稳定性。（2）pyrE缺失阻断嘧啶从头合成途径：ΔpyrE在BB中生长显著减慢，在PE中几乎不生长，外源尿嘧啶（1、2、5 mM）可浓度依赖性恢复生长，证实pyrE是嘧啶从头合成的关键基因。（3）嘧啶合成缺陷不影响布鲁氏菌对环境应激的抵抗力：ΔpyrE在H₂O₂、SNP、酸性条件和多粘菌素B、SDS处理下存活率与亲本株和互补株无显著差异。（4）嘧啶合成缺陷减弱黏附、侵袭和胞内生存但不影响胞内转运：ΔpyrE对HeLa和RAW264.7细胞的黏附和侵袭显著降低，胞内生存和增殖显著减少，外源尿嘧啶可部分恢复胞内生存；BCV与LAMP-1共定位率与亲本株相当，而ΔvirB123阳性对照共定位率约80%，表明ΔpyrE保留逃逸溶酶体降解的核心毒力机制。（5）嘧啶合成途径破坏显著减弱小鼠体内毒力：ΔpyrE感染小鼠脾脏重量和脾脏细菌负荷显著低于亲本株和互补株感染组，肝脏肉芽肿数量和直径显著减少。（6）ΔpyrE作为嘧啶营养缺陷型减毒活疫苗候选株显示低残余毒力：免疫后2和4周脾脏重量高于M5-90Δ26组，6和8周无显著差异；2周时脾脏细菌负荷高于M5-90Δ26，4、6、8周无显著差异；主要器官无明显的组织病理学改变。（7）ΔpyrE免疫诱导持久且平衡的特异性免疫应答：IgM在2、4、6周显著高于M5-90Δ26组，8周无差异；IgG在各时间点显著高于PBS组，2、4周显著高于M5-90Δ26组；IgG2a/IgG1比值大于1.0，呈Th1偏向性；IFN-γ在各时间点显著高于PBS组，两疫苗组间无显著差异。（8）ΔpyrE免疫提供强保护效力：攻毒后45和56天，ΔpyrE组脾脏重量显著低于PBS组，与M5-90Δ26组相当；56天时脾脏细菌负荷显著低于M5-90Δ26组和PBS组；肝脏肉芽肿数量和直径显著低于PBS组，与M5-90Δ26组无显著差异。

讨论部分总结：本研究系统表征了pyrE在羊种布鲁氏菌M5中的生物学功能，证实其缺失导致嘧啶合成障碍，严重损害体外生长、胞内增殖和体内定植，但不影响应激耐受性。生长曲线分析表明布鲁氏菌对嘧啶补救利用效率远低于嘌呤补救；ΔpyrE胞内增殖缺陷归因于嘧啶核苷酸匮乏而非溶酶体靶向增强；嘧啶代谢紊乱可能通过全局信号途径影响表面黏附素表达。小鼠模型证实嘧啶从头合成途径是布鲁氏菌体内毒力的关键决定因素，减毒并非源于应激抵抗受损。ΔpyrE早期脾脏定植后至第4周降至M5-90Δ26水平，第8周清除，主要器官无病理异常；诱导Th1偏向性免疫应答，保护力与M5-90Δ26相当，56天时细菌清除更优，提示更持久的保护性免疫。研究局限性包括：ΔpyrE黏附侵袭减弱的分子基础尚未阐明；评价仅限于BALB/c小鼠模型；尚未开发配套的血清学鉴别诊断方法；免疫缺陷宿主和妊娠动物的安全性有待考察。研究结论翻译：本研究确立了pyrE是羊种布鲁氏菌嘧啶从头合成途径的必需基因，并证明其缺失通过代谢限制赋予强减毒作用而不损害应激耐受性。ΔpyrE突变株兼具良好的安全性、强免疫原性和保护效力，尤其在长期保护方面显示潜力。该工作填补了嘧啶代谢如何调控布鲁氏菌胞内寄生和毒力认识的关键空白，既提供了候选疫苗株，也为开发更安全、可鉴别诊断的下一代布鲁氏菌病疫苗提供了概念基础。