《Frontiers in Endocrinology》：Early-stage follicle development regulated by RGD peptide and ovarian fragment size in three-dimensional culture
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三肽Arg-Gly-Asp（RGD）是存在于多种细胞外基质（ECM）蛋白中的最小整合素结合基序。研究人员前期研究发现，与右旋糖酐水凝胶对照相比，在不含RGD的右旋糖酐水凝胶中培养的未成熟卵巢组织块可显著促进有腔卵泡发育。本研究利用新生小鼠卵巢，在三维（3D）培
三肽Arg-Gly-Asp（RGD）是存在于多种细胞外基质（ECM）蛋白中的最小整合素结合基序。研究人员前期研究发现，与右旋糖酐水凝胶对照相比，在不含RGD的右旋糖酐水凝胶中培养的未成熟卵巢组织块可显著促进有腔卵泡发育。本研究利用新生小鼠卵巢，在三维（3D）培养体系中考察了RGD肽和卵巢组织块尺寸对早期卵泡发育的影响。将一侧新生卵巢切成1/2、1/4或1/8组织块，在含或不含RGD的右旋糖酐水凝胶中培养。卵泡发育随组织块尺寸减小而逐步增加（完整<1/2<1/4<1/8）。值得注意的是，RGD处理以尺寸依赖的方式进一步促进卵泡发育。特别是，经RGD处理的1/8组织块与含或不含RGD的所有其他组相比显著促进了卵泡发育。既往研究表明，卵巢组织分割通过破坏Hippo通路刺激早期卵泡发育。研究人员发现，与不含RGD培养相比，RGD处理进一步增加了1/8组织块中Hippo通路的破坏。作为配体，RGD与整合素受体结合以诱导多种细胞功能。在新生卵巢中，卵巢特异性RGD结合整合素αvβ3和αvβ5主要定位于卵巢间质/膜细胞。为评估RGD-整合素相互作用的作用，研究人员使用Cilengitide（Ci）阻断整合素αvβ3和αvβ5。在Ci存在下，3D培养中1/8组织块的RGD诱导卵泡发育和Hippo通路破坏被完全抑制。这些结果表明，RGD-整合素相互作用对于促进3D培养中早期卵泡发育至关重要。总体而言，本研究证明卵巢组织块尺寸显著影响培养中早期卵泡发育。组织分割使表达RGD结合整合素的卵巢间质区室暴露于周围水凝胶。此外，在3D培养体系中RGD处理对卵泡发育的影响取决于卵巢组织块尺寸，其中1/8组织块产生最大增强效果。
研究背景方面，体外卵泡发育（IVFD）是保存癌症患者生育力的辅助生殖技术（ART），也是研究卵巢生物学和卵巢毒性筛查的重要模型。目前最广泛使用的IVFD方法是将分离的腔前卵泡包封在海藻酸盐水凝胶珠中，但该方法忽略了卵泡间卵巢间质细胞的作用。为重现完整卵巢微环境，研究人员建立了Matrigel支持的3D卵巢组织培养体系，但Matrigel含多种细胞外基质（ECM）蛋白和生长因子。随后研究人员开发了细菌来源的右旋糖酐水凝胶支持的3D卵巢培养体系，右旋糖酐本身具有生物惰性且缺乏细胞特异性黏附位点，为评估生物活性分子对卵泡发育的影响提供了独特平台。RGD是ECM中最小整合素结合基序，也是生物材料工程和组织再生中广泛使用的生物活性因子和细胞黏附基序。研究人员前期发现RGD修饰右旋糖酐水凝胶显著增强有腔卵泡发育和卵母细胞能力，且RGD诱导的腔形成仅发生在分割的卵巢组织中而非完整卵巢，表明RGD修饰水凝胶与卵巢间质细胞的直接接触是促进有腔卵泡发育的必要条件。既往研究已表明卵巢分割通过破坏Hippo信号通路促进卵泡发生，但卵巢组织块尺寸如何影响3D培养中早期卵泡发育，以及RGD-整合素相互作用是否参与调控Hippo通路尚不清楚。因此本研究旨在考察卵巢组织块尺寸对3D培养中早期卵泡发育的影响，进一步研究RGD与组织块尺寸的交互效应，并探讨RGD-整合素相互作用是否参与调控Hippo通路。
研究人员开展的研究及结论：本研究利用7日龄（dpp）新生小鼠卵巢，在右旋糖酐水凝胶3D培养体系中系统考察了卵巢组织块尺寸（完整、1/2、1/4、1/8）和RGD肽对早期卵泡发育的影响，并探讨了RGD-整合素相互作用与Hippo通路的关系。研究结论表明，卵巢组织块尺寸显著影响3D培养中早期卵泡发育，卵泡发育随组织块尺寸减小而逐步增加；RGD处理以尺寸依赖方式进一步促进卵泡发育，1/8组织块效果最为显著；RGD-整合素αvβ3/αvβ5相互作用通过促进Hippo通路破坏和有腔卵泡发育发挥关键作用。重要意义在于，这些发现表明最小化组织尺寸同时主动参与整合素受体可为晚期卵泡发育提供优化的生物材料微环境，为IVFD技术优化提供了新策略。
关键技术方法方面，研究人员使用7 dpp（CD-1 x B6D2F1）雌性小鼠卵巢，将卵巢切成不同尺寸组织块后在含或不含RGD的右旋糖酐水凝胶中进行3D培养8天；采用RT-PCR分析RGD结合整合素亚基mRNA表达，免疫荧光染色检测整合素亚基和活性YAP1定位；使用Cilengitide（Ci）作为αvβ3和αvβ5整合素拮抗剂进行阻断实验；通过RT-qPCR分析类固醇合成标记基因和Ccn2基因表达；测量卵泡直径评估发育情况。
研究结果方面，第一，关于RGD对完整卵巢培养中早期卵泡发育的影响，研究人员通过形态学分析发现，7 dpp完整卵巢在含RGD条件下培养时卵巢表面出现成纤维细胞样延伸，髓质区多层次级卵泡发育更为先进，但无论是否含RGD，原始卵泡池均稳定维持于皮质区，表明在3D完整卵巢培养中水凝胶基质未与髓质区直接接触，早期卵泡发育在有无RGD条件下均适度发生。第二，关于卵巢组织块尺寸和RGD对卵泡发育的影响，研究人员通过测量卵泡直径发现，在无RGD条件下卵泡平均直径随组织块尺寸减小而逐渐增加（1/2为130.8±31.8 μm，1/4为139.2±26.0 μm，1/8为148.2±27.4 μm）；在含RGD条件下同样呈尺寸依赖性增加（1/2为137.9±35.2 μm，1/4为152.4±34.1 μm，1/8为202.1±22.8 μm），且RGD处理在各尺寸组织块中均产生更高发育率；双因素方差分析显示组织块尺寸和RGD处理的主效应及交互效应均显著（p<0.0001），RGD处理的1/8组织块显著优于所有其他组。第三，关于卵巢组织块尺寸和RGD对类固醇合成的影响，研究人员通过RT-qPCR分析发现，在无RGD条件下Cyp17a1 mRNA水平随组织块尺寸减小呈上升趋势但组间无显著差异；在含RGD条件下Cyp17a1表达呈更明显的尺寸依赖性上升，RGD处理的1/8组织块显著上调Cyp17a1表达；Cyp11a1表达模式与Cyp17a1相似；Cyp19a1仅在含RGD组中随尺寸减小而逐步上调，RGD处理的1/8组织块表达最高。第四，关于新生卵巢中RGD结合整合素的表达，研究人员通过RT-PCR和免疫荧光发现，九个RGD结合整合素亚基中αv、β1、β3和β5在新生卵巢中优势表达；αv主要定位于卵巢间质区室和膜细胞层，β1分布于整个卵巢包括颗粒细胞和卵母细胞，β3和β5检测于间质和膜细胞及卵母细胞，表明整合素αvβ3和αvβ5主要定位于新生卵巢间质和膜细胞层。第五，关于RGD-整合素相互作用对卵巢组织块培养中卵泡发育的影响，研究人员通过Cilengitide阻断实验发现，RGD处理的1/8组织块平均卵泡直径显著大于无RGD组（210.9±29.0 vs 135.2±24.0 μm，p<0.05）；Ci处理以剂量依赖方式显著降低RGD诱导的卵泡发育（1、3、10 μM Ci分别为176.6±29.3、172.0±38.3和137.8±30.0 μm），10 μM Ci时卵泡直径与无RGD组相当；RGD处理显著上调三个类固醇合成标记基因表达，Ci处理后明显下调至与无RGD组相当水平。第六，关于RGD-整合素相互作用对Hippo通路失活的影响，研究人员通过RT-qPCR和免疫荧光发现，RGD处理的1/8组织块Ccn2表达显著高于无RGD的1/8组织块及完整卵巢（p<0.05），10 μM Ci显著抑制RGD诱导的Ccn2表达升高；在新鲜卵巢中活性YAP见于膜细胞核和卵母细胞质，RGD处理的1/8组织块中颗粒细胞YAP核转位显著增加，而Ci处理显著减少RGD诱导的YAP核转位，与无RGD组模式相似。
讨论部分总结：本研究证实卵巢组织块尺寸影响3D培养中早期卵泡发育，卵泡发育随组织块尺寸减小而进展，这可能反映分割后卵泡周围物理环境的变化如组织压力和间质密度降低。RGD修饰右旋糖酐水凝胶显著促进分割卵巢中的卵泡发育，1/8组织块效果最为显著，表明RGD与卵巢间质区室的直接接触对促进早期卵泡发育至关重要，较小组织块使更高比例的卵巢间质暴露于水凝胶固定的RGD肽。关于机制，整合素作为细胞表面受体感知细胞外机械信号并与ECM结合，RGD是ECM蛋白中最常见的整合素结合基序，在7 dpp新生卵巢中RGD结合整合素αvβ3和αvβ5主要表达于卵巢间质/膜细胞，Cilengitide显著抑制RGD诱导的卵泡发育。Hippo通路是高度保守的机械敏感级联通路，既往研究表明卵巢分割增加肌动蛋白聚合导致Hippo通路破坏和YAP核转位，上调Ccn2和Birc等下游元件诱导卵泡激活或早期卵泡发育。本研究发现RGD处理显著增加卵巢组织块中Ccn2 mRNA表达和YAP蛋白核积累，而Cilengitide显著抑制RGD诱导的Ccn2表达和YAP核积累，表明RGD-整合素相互作用可能触发下游信号级联最终破坏颗粒细胞中Hippo通路以促进卵泡发育。然而卵巢间质/膜细胞与颗粒细胞被卵泡基底膜物理分隔，间质/膜细胞中RGD-整合素相互作用如何间接调控颗粒细胞Hippo信号尚不清楚。研究人员推测RGD-整合素相互作用触发下游级联物理和生物学重塑间质和膜细胞区室，这种结构转化可能传递关键机械和生化信号调控颗粒细胞和Hippo通路最终驱动3D体系中卵泡发育。研究结论翻译：总之，本研究证明卵巢组织块尺寸调控3D培养中早期卵泡发育。值得注意的是，在3D培养体系中RGD处理对卵泡发育的影响取决于卵巢组织块尺寸，其中1/8组织块产生最大增强效果。进一步研究将阐明3D培养体系中RGD-整合素相互作用在卵泡发育过程中触发的分子信号级联。
