《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Elucidating mechanisms associated with endoplasmic reticulum stress at the placental and fetal brain axis in response to oxycodone exposure
编辑推荐：
产前羟考酮（Oxy）暴露与新生儿多种神经发育结局相关。然而，妊娠期Oxy诱导胎盘和胎儿脑损伤的分子机制尚不清楚。内质网（ER）应激是由未折叠蛋白蓄积触发的细胞应激反应，可激活未折叠蛋白反应。本研究假设Oxy暴露在胎儿脑-胎盘轴诱导ER应激。为验证该假设，研究人
产前羟考酮（Oxy）暴露与新生儿多种神经发育结局相关。然而，妊娠期Oxy诱导胎盘和胎儿脑损伤的分子机制尚不清楚。内质网（ER）应激是由未折叠蛋白蓄积触发的细胞应激反应，可激活未折叠蛋白反应。本研究假设Oxy暴露在胎儿脑-胎盘轴诱导ER应激。为验证该假设，研究人员采用三种模型系统：体外原代神经元、原代混合神经胶质细胞以及母体Oxy暴露的体内模型。采用定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测ER应激介质如结合免疫球蛋白蛋白（Bip）、激活转录因子4（ATF4）、剪接型X盒结合蛋白1（sXBP1）和C/EBP同源蛋白（CHOP）的mRNA表达。免疫印迹分析检测ER应激介质的蛋白表达，包括Bip、肌醇需求跨膜激酶/内切核糖核酸酶1α的磷酸化和总形式（p-IRE1α和t-IRE1α）、蛋白激酶R样内质网激酶α（p-PERKα和t-PERKα）、磷酸化真核翻译起始因子2α（p-eIF2α）以及sXBP1。此外，检测促凋亡标志物如Bcl-2相互作用细胞死亡介质（Bim）、p53上调凋亡调节因子（PUMA）和切割型聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）。Oxy暴露于大鼠原代胎儿神经元细胞可增加Bip和ATF4的mRNA表达。sXBP1和CHOP mRNA水平在大鼠原代胎儿神经元细胞和混合神经胶质细胞中均上调。产前Oxy暴露导致胎盘和胎儿脑中所有检测的ER应激标志物mRNA表达增加。研究人员还观察到Oxy暴露增加了ER应激标志物（Bip、p-IRE1α、t-IRE1α、p-PERKα、t-PERKα、p-eIF2α和sXBP1）以及促凋亡和凋亡标志物（Bim、PUMA和切割型PARP）的蛋白水平。总之，Oxy暴露增加了胎盘和胎儿脑区域的ER应激介质，可能进一步导致凋亡。
研究背景与问题：阿片类药物是用于疼痛管理的镇痛药，主要结合mu-阿片受体发挥镇痛作用，但该受体亦分布于奖赏处理脑区而导致成瘾。阿片类药物 improper、illicit 及广泛使用已导致成瘾和过量死亡。妊娠期摄入阿片类药物可导致新生儿阿片戒断综合征（NOWS）。羟考酮（Oxy）是一种源自蒂巴因的半合成阿片类药物，是1999至2016年阿片过量流行早期最常涉及的阿片类药物形式。临床病例显示Oxy暴露可导致青少年、成人和儿童脑病。研究人员此前在临床前啮齿动物模型中证实，宫内Oxy暴露至断奶可调节突触发生相关基因和通路影响子代神经发育，并诱导子代突触囊泡蛋白质组独特特征以及线粒体功能障碍和突触发生通路富集。然而，宫内Oxy暴露导致子代不良神经发育结局的分子机制尚待研究。内质网（ER）是参与蛋白折叠、合成和运输的重要细胞器，这些过程受扰可诱导ER应激反应，导致分子伴侣Bip脱离及未折叠蛋白反应（UPR）三条臂激活，包括IRE1α和PERK磷酸化及ATF6切割，进而激活下游ER应激信号级联如sXBP1、eIF2α磷酸化、ATF4和CHOP。CHOP是促凋亡转录因子，在ER应激持续激活时触发凋亡。既往研究表明ER应激介质在神经退行性疾病中调控突触蛋白表达和功能，吗啡和Oxy可在成年啮齿动物脑中诱导ER应激激活，宫内丁丙诺啡暴露可导致新生大鼠脑ER应激激活。然而，宫内阿片类药物（包括Oxy）暴露 gestational 期胎儿脑ER应激激活研究尚 largely 未探索。胎盘是妊娠期发育的关键器官，通过运输氧气、营养和激素促进胎儿发育，且已知Oxy可穿过胎盘和血脑屏障。因此，除研究胎儿脑ER应激激活外，检测胎盘ER应激激活亦至关重要。本研究目的是确定产前Oxy暴露是否在Nulliparous Sprague–Dawley大鼠 gestational 期诱导胎儿脑和胎盘ER应激激活。研究意义：揭示Oxy暴露在胎盘和胎儿脑轴诱导ER应激并可能进一步导致凋亡，为理解宫内阿片暴露相关神经发育毒性的早期分子信号提供依据，并提示胎盘-胎儿脑轴易感性的潜在机制。
关键技术方法：研究人员采用三种模型系统：体外大鼠原代胎儿神经元细胞、原代胎儿混合神经胶质细胞和母体Oxy暴露体内模型。体内实验采用Nulliparous Sprague–Dawley大鼠（雄性5–6月龄，雌性2月龄），Oxy经口灌胃递增给药（前5天10 mg/kg/天，随后10天每日递增0.5 mg/kg/天至15 mg/kg/天，之后合笼交配并在交配和妊娠全程维持15 mg/kg/天），于胚胎第20.5天（E20.5）收集胎儿脑和胎盘；体外实验于E18分离胎儿皮层原代神经元和混合神经胶质细胞，培养14天后以Oxy 100 μM处理24 h。采用qRT-PCR检测Bip、ATF4、sXBP1和CHOP mRNA表达（以18S为参照），免疫印迹检测ER应激介质和凋亡标志物蛋白表达，统计分析采用ROUT分析（Q=10%）和非参数Mann–Whitney检验。
研究结果：（1）Oxy exposure induces ER stress in the rat primary fetal neuronal cell：大鼠原代胎儿神经元细胞暴露于100 μM Oxy 24 h后，Bip、ATF4、sXBP1和CHOP mRNA表达较对照组显著增加，表明Oxy暴露诱导大鼠原代胎儿神经元细胞ER应激激活。（2）Oxy exposure induces ER stress in the rat primary fetal mixed neuroglial cell：大鼠胎儿混合神经胶质细胞Oxy暴露后sXBP1和CHOP mRNA水平较对照组显著增加，与神经元细胞结果一致，但Bip和ATF4 mRNA水平无显著差异，表明Oxy暴露激活混合神经胶质细胞ER应激第一和第二臂。（3）Prenatal oxy exposure induces ER stress in the fetal brain：E20.5胎儿脑分析显示，产前Oxy暴露组Bip、ATF4、sXBP1和CHOP mRNA表达较对照组显著上调，支持妊娠期Oxy暴露诱导胎儿脑ER应激信号通路的假设。（4）Prenatal oxy exposure induces ER stress in the placenta：产前Oxy暴露胎盘Bip、ATF4、sXBP1和CHOP mRNA表达较对照胎盘显著上调，表明胎盘-胎儿脑轴ER应激激活。（5）Oxy exposure induces protein expression of ER stress mediators and pro-apoptotic mediators in rat-derived primary fetal mixed neuroglial cells：免疫印迹显示Oxy暴露增加IRE1α和PERK磷酸化及总形式蛋白水平，下游p-eIF2α和sXBP1增加，ER驻留分子伴侣Bip蛋白水平增加；同时促凋亡BH3结构域蛋白PUMA和Bim所有亚型（EL、L、S）增加，凋亡生化标志物切割型PARP增加，表明Oxy暴露可诱导持续ER应激导致促凋亡蛋白增加并激活凋亡。
讨论与结论：本文关键发现包括：Oxy暴露激活大鼠原代胎儿神经元细胞ER应激（Bip、ATF4、sXBP1、CHOP mRNA增加）；Oxy暴露触发大鼠原代混合神经胶质细胞ER应激（sXBP1和CHOP增加）；产前Oxy暴露促进大鼠胎盘和胎儿脑ER应激（两者Bip、ATF4、sXBP1、CHOP mRNA增加）；Oxy暴露增加混合神经胶质细胞ER应激标志物蛋白水平（Bip、p-IRE1α、p-PERK、p-eIF2α、t-IRE1α、t-PERK、sXBP1）；Oxy暴露引起凋亡（切割型PARP、Bim、PUMA增加）。讨论指出，神经元Bip和ATF4 mRNA增加提示PERK/eIF2α/ATF4信号可能激活，而混合神经胶质细胞中Bip和ATF4 mRNA无显著差异可能与胶质细胞 masking 神经元ER应激反应有关，但蛋白水平Bip和p-eIF2α增加提示PERK/eIF2α/ATF4臂潜在激活；sXBP1和CHOP上调提示IRE1α/sXBP1轴 robust 激活及向细胞死亡转变。既往研究显示阿片暴露可增加凋亡和线粒体损伤，与本研究发现切割型PARP增加一致；Bim增加有助于启动Bax激活所需构象变化，PUMA增加进一步支持凋亡激活，但Oxy诱导线粒体内在通路相关凋亡和损伤仍需进一步研究。临床研究显示宫内阿片暴露 reduced 胎儿脑大小并改变胎儿生理，临床前研究显示宫内Oxy暴露改变子代社会新颖性、社会偏好和脑代谢物谱，但阿片诱导胎儿脑损伤的分子机制仍不清楚。既往非妊娠临床前研究显示阿片暴露改变重要细胞应激信号通路，Oxy可 drastic 增加大鼠脑Bip、HSP70和phospho-eIF2α；吗啡暴露大鼠海马和原代海马神经元通过mu-阿片受体激活及ROS增加介导ER应激和自噬级联；阿片拮抗剂纳洛酮或纳曲酮预处理可减少Oxy或吗啡诱导的ER应激激活，提示阿片受体在ER应激激活中起重要作用，本研究中Oxy诱导的ER应激激活和凋亡可能由阿片受体介导，但需进一步研究证实。宫内Oxy暴露相关神经毒性机制了解甚少，既往研究显示宫内和生后Oxy暴露对子代有不同结局，Oxy对发育脑的影响取决于暴露时间。Oxy可穿过胎盘屏障影响胎盘，人胎盘阿片暴露显示与神经元发育和功能相关的差异表达基因，小鼠胎盘转录组分析显示Oxy暴露导致 junctional zone 海绵滋养层代谢应激，小鼠产前Oxy暴露改变胎盘基因表达谱、减少滋养层巨细胞面积和迷路母体血管。本研究证明产前Oxy暴露激活大鼠胎盘ER应激信号通路，但阿片诱导胎盘损伤的其他分子机制需进一步研究。本研究在生理和病理条件下神经元和胶质细胞双向通讯基础上，证明Oxy暴露激活胎儿原代神经元和混合神经胶质细胞ER应激，研究宫内Oxy暴露影响有助于理解胎儿脑发育早期分子信号扰动，并提示胎盘ER应激激活可能构成妊娠期胎盘-胎儿脑轴易感性。结论：Oxy暴露激活大鼠原代胎儿神经元细胞、原代胎儿混合神经胶质细胞以及母体Oxy暴露体内模型胎盘和胎儿脑的ER应激；Oxy增加原代胎儿神经元细胞Bip、ATF4、sXBP1和CHOP mRNA水平，而混合神经胶质细胞sXBP1和CHOP mRNA水平增加；宫内Oxy暴露增加胎儿脑和胎盘Bip、ATF4、sXBP1和CHOP mRNA表达；Oxy暴露增加混合神经胶质细胞ER应激蛋白（Bip、p-IRE1α、t-IRE1α、p-PERKα、t-PERKα、p-eIF2α和sXBP1）和凋亡标志物（切割型PARP、Bim和PUMA）水平。局限性包括未研究 gestational 期ER应激激活是否与子代后期神经发育延迟相关，需未来研究证明ER应激与神经发育功能障碍的因果联系；需更全面评估ER关键功能如钙稳态/动力学及药理学抑制剂或基因敲低策略；未直接测量ER特异性转录活性如DNA结合或报告基因 assay；细胞培养实验使用技术重复作为个体观察，体内实验仅使用两个独立孕鼠，需增加独立孕鼠数量以确定可重复性。
