基于工程化免疫蛋白酶体（immunoproteasome）重编程间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSC）的免疫肽组学（immunopeptidomics）初步分析：预测不可见肽段的定位与表征

《Frontiers in Immunology》：Mapping the prediction-invisible fraction of an engineered immunopeptidome: a pilot analysis of immunoproteasome-reprogrammed mesenchymal stromal cells

　　

预测免疫系统可识别哪些肽段的算法是癌症疫苗设计的核心，然而这些算法几乎完全基于结合亲和力（binding affinity）训练，对决定何种肽段最终呈递至细胞表面的抗原加工机制（antigen-processing machinery）在很大程度上仍缺乏感知能力。经工程化改造表达免疫蛋白酶体的间充质基质细胞（MSC-IPr）是一种全细胞疫苗平台，其呈递的肽段库较树突状细胞（dendritic cells, DC）更大且化学性质不同。本研究利用该平台产生的初步免疫肽组学数据集，探讨当前预测模型能够识别多少经加工重编程后的肽段库。在肿瘤裂解物脉冲后仅检测到的234条肽段中，有34条（14.5%）虽经MHC I类分子（MHC class I）实际洗脱，却被NetMHCpan-4.1、MHCflurry亲和力模型与MHCflurry呈递模型同时判定为非结合肽（non-binders）。该比例是对独立生成的C57BL/6免疫肽组图谱（0.65%）应用相同判定标准所得结果的二十倍。这些肽段属于弱结合肽（weak binders）而非真正的非结合肽，且正交免疫原性模型（orthogonal immunogenicity model）对其排序略高于可预测的多数肽段。它们与一种候选非经典锚定模式（non-canonical anchor pattern）相关：P2位点的天冬氨酸（aspartate）呈位置依赖性而非组成依赖性（较保持氨基酸组成的零模型高3.4倍），且未见于已收录的H2-Db表位空间。由于该数据集由单次质谱检测（mass-spectrometry runs）构成且缺乏蛋白酶体匹配对照，研究人员将这些结果作为初步观察而非既定效应呈现。研究人员提出其所例证的工程化加工策略，即具有明确非经典加工程序的细胞可作为表位发现的实证筛选器（empirical filter），并明确了检验该策略所需的重复实验、谱图验证（spectral validation）与对照实验组。

研究背景与问题：个性化癌症免疫治疗依赖于鉴定肿瘤蛋白质组中被加工、经MHC I类分子呈递并被CD8⁺ T细胞识别的肽段片段，而实践中这一过程几乎完全依赖计算机预测（in silico）。以NetMHCpan-4.1和MHCflurry 2.0为代表的序列预测工具虽功能强大，但其特征空间以结合化学与基序结构为主，仅部分捕捉决定肽段生成与递送的上游抗原加工机制。免疫蛋白酶体与组成型蛋白酶体（constitutive proteasome）具有不同的切割偏好，可重塑呈递肽段库，而基于结合的模型未经训练难以预判。此前研究报道，MSC-IPr与DC在相同肿瘤裂解物脉冲下产生的免疫肽组在长度分布、预测结合亲和力与结合基序上相似，但序列身份上基本不重叠，MSC-IPr肽段库约大四倍（965对224条），其序列层面差异基础尚未确立。本研究即针对该空白，在单个残基水平分析MSC-IPr裂解物诱导肽段库，比较同一细胞组成型呈递肽段及DC相应裂解物诱导肽段库，并检验这些肽段在标准结合预测器、免疫原性预测器BigMHC、免疫表位数据库（Immune Epitope Database, IEDB）及已发表C57BL/6免疫肽组图谱中的表现，提出三个问题：免疫蛋白酶体依赖性呈递是否与特定序列特征相关；该特征是否标记结合预测器遗漏的肽段；被遗漏肽段是否仍被预测为具免疫原性。由于数据为单次质谱检测且缺乏蛋白酶体匹配对照，全部结果均被界定为描述性、初步阶段的关联。

主要技术方法：本研究为对Abusarah等所生成免疫肽组学数据的二次分析，未开展新的动物实验。关键技术方法包括：基于差异检测规则将洗脱肽段划分为裂解物诱导与组成型呈递区室；采用NetMHCpan-4.1（结合亲和力与洗脱配体模式）和MHCflurry 2.0（亲和力与抗原加工/呈递模式）对H2-Kb与H2-Db进行结合与呈递预测；采用BigMHC IM模型进行免疫原性预测；开展位置特异性残基频率分析，并以肽内组成保持置换零模型、外部图谱背景及长度固定分层进行对照；与IEDB中H2-Db表位进行精确序列比对；对逃逸肽段来源蛋白进行强度、长度、定位与强结合肽密度分析。样本来源为C57BL/6小鼠骨髓来源DC与MSC，抗原源为EL4 T淋巴瘤细胞全细胞裂解物。

研究结果：

3.1 免疫蛋白酶体依赖性呈递与非经典P2天冬氨酸锚定相关：MSC-IPr裂解物诱导肽段相对同细胞组成型肽段携带非经典序列特征，以P2位点天冬氨酸为主导（13.7%对1.3%，OR=11.64，p<0.0001），并伴细胞类型×区室强交互作用（OR=40.0，p=0.001）。该富集为位置性而非组成性，观察频率较肽内组成保持置换零模型高3.35倍。C端F/I/M富集在合并8–11聚体中有统计学意义（OR=2.00，p=0.0001），但固定长度后减弱且不再显著，故研究人员将位置信号主要归因于P2天冬氨酸及复合D-P2/F-PΩ基序。MSC-IPr裂解物诱导肽段呈递率显著高于DC（34.4%对8.5%，OR=5.61，p=1.6×10^?28）。

3.2 非经典P2天冬氨酸锚定标记候选逃逸基序：D-P2/F-PΩ基序见于55.6%（10/18）H2-Db指派模型逃逸肽段，而H2-Db模型捕获肽段仅2.1%（1/48）（OR=58.75，p=1.99×10^?6）；该复合基序较组成保持零模型高9.33倍，且在IEDB已收录H2-Db表位中为零，但零假设检验显示该缺失符合基线稀有性（期望值0.74，观察到零的概率0.478），故信息性信号在于逃逸肽段内的基序富集而非其在IEDB中的缺失。携带基序肽段为弱预测结合肽（中位11,765 nM）。

3.3 预测不可见表位类别逃避全部标准结合模型：234条MSC-IPr裂解物诱导肽段中34条（14.5%）被三项预测输出同时判为非结合肽，构成模型逃逸类别；该比例显著高于MSC-IPr组成型（1.8%，OR=9.33）与DC裂解物诱导（2.2%，OR=7.65），约为Schuster等图谱6,020条洗脱配体基线（0.65%）的二十倍（OR=22.6，p=2.1×10^?25）。富集不能由肽段丰度解释，在各强度四分位及1:1丰度匹配后仍成立。逃逸肽段免疫原性轻度富集（BigMHC IM评分AUC=0.59，p=0.048；固定评分0.1时OR=2.67，p=0.013），但该富集对阈值敏感，评分≥0.15时不再显著。34条均不与IEDB表位重叠，且富集H2-Db指派（52.9%对24.0%，OR=3.56），但等位基因指派仅中度稳定（一致性70.6%）。逃逸肽段预测结合亲和力显著更高（中位5,815.9 nM对45.6 nM，p=9.4×10^?20），表明逃逸基础为弱结合而非无结合。来源蛋白五项主要属性未见大幅差异。

3.4 区室差异与结合而非加工效率相关：MSC-IPr裂解物诱导肽段IEDB重叠低于组成型（1.7%对14.3%，OR=0.104，p=1×10^?8），但该差异在1:1丰度匹配后减弱且不再显著（1.5%对3.1%，OR=0.49，p=0.34）。抗原加工评分在区室间无差异（p=0.36–0.63），故区室差异与改变的肽–MHC结合特征相关而非可检测的加工效率变化。131个来源蛋白仅向裂解物诱导区室贡献肽段（n=136），其IEDB重叠为0%，而共享蛋白来源肽段为4.1%（Fisher p=0.030）。

讨论与结论：讨论指出，本数据集为MSC-IPr免疫肽组此前未解释的独特性提供了候选描述性解释：免疫蛋白酶体依赖性呈递与非经典P2天冬氨酸及长度敏感的疏水C端偏好相关；因C端信号在固定长度后减弱而P2信号增强，非经典模式主要归因于P2锚定。由于缺乏蛋白酶体匹配的空白载体对照，且DC比较组经LPS成熟本身富含免疫蛋白酶体，该特征不能仅凭此数据因果归因于免疫蛋白酶体切割。MSC-IPr保留内源性组成型亚基，呈递肽段库预期以经典为主并叠加少数非经典群体，故所报效应量为稀释估计、属下限；中间型（混合亚基）颗粒亦可产生不匹配任一亲本复合物的切割偏好。实际意义在于提名一类候选预测不可见肽段：经质谱实际洗脱却被NetMHCpan与MHCflurry一致判为非结合肽；弱亲和肽仍可形成稳定免疫原性复合物，因肽–MHC复合物稳定性较结合亲和力更能预测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫原性；母平台MSC-IPr已在体内引发功能性保护性抗肿瘤CD8⁺ T细胞应答。局限性包括：缺乏蛋白酶体匹配对照及三类对照实验组；每区室仅单次免疫沉淀/质谱检测，单个肽段非独立实验单位；肽段鉴定未经合成肽谱图匹配验证；等位基因指派为计算机最佳二选一推断且对弱结合逃逸肽段仅中度稳定；免疫原性阈值未验证且富集温和；部分分层样本量小；结果限于小鼠输入与H2-Db、H2-Kb等位基因；同基因系统中无法追溯肽段来源。结论为：对MSC-IPr裂解物诱导免疫肽组的初步分析提名了一种与免疫蛋白酶体依赖性呈递相关的候选非经典锚定模式，主要为P2天冬氨酸伴长度敏感疏水C端偏好，并鉴定出一类以约为独立生成免疫肽组基线二十倍速率逃避全部标准结合预测器的弱结合肽段，其预测免疫原性轻度富集；由于数据为无蛋白酶体匹配对照的单次质谱检测，上述为初步观察而非既定免疫蛋白酶体特异性效应。这些结果提名了一类对癌症疫苗设计具潜在意义的已呈递、预测不可见肽段类别，更重要的是例证了一种拟议策略：以具有明确非经典加工程序的细胞作为表位发现的实证筛选器。研究人员明确了确立该策略所需的实验：生物学重复、空白载体/组成型亚基/抑制剂对照实验组、候选肽段的合成肽谱图验证及直接免疫原性测定。