《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide analysis reveals tissue-specific responses of class III peroxidase genes to PEG-induced osmotic stress in Pennisetum glaucum
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III类过氧化物酶（PRXs）是植物特有的氧化还原酶，参与活性氧（ROS）稳态维持与非生物胁迫响应。珍珠粟（Pennisetum glaucum）是一种抗旱性强的粮食与饲草作物，但其PRX基因家族尚未得到系统表征。本研究通过整合生物信息学分析，鉴定出120个推
III类过氧化物酶（PRXs）是植物特有的氧化还原酶，参与活性氧（ROS）稳态维持与非生物胁迫响应。珍珠粟（Pennisetum glaucum）是一种抗旱性强的粮食与饲草作物，但其PRX基因家族尚未得到系统表征。本研究通过整合生物信息学分析，鉴定出120个推定的PgPRX家族成员。这些基因不均匀分布于7条染色体上，其中54个编码蛋白（45%）被预测定位于叶绿体。系统发育与结构分析将该家族划分为4个亚家族。研究识别出4个串联重复簇，支持串联重复在PgPRX家族扩张中的作用。比较共线性分析在珍珠粟与水稻之间检测到98对共线基因对，而在珍珠粟与拟南芥（Arabidopsis thaliana）之间仅检测到3对，表明该家族在单子叶植物中保守性更高。启动子分析揭示大量与植物激素信号传导及非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。在20% PEG-6000诱导的渗透胁迫下，转录组分析显示明显的组织与时间特异性表达模式，共有108个PgPRX基因在至少一项比较中显著差异表达。对6个选定基因的RT-qPCR分析进一步揭示了PEG处理下不同的组织与时间依赖性响应，其中PgPRX22与PgPRX41在叶片与根之间呈现相反的表达趋势，PgPRX74表现出明显的组织依赖性响应。上述结果为PgPRX家族提供了基因组与表达框架，并为进一步开展珍珠粟胁迫响应功能研究优先筛选了候选基因。
研究背景与问题：过氧化物酶广泛分布于动物、植物与微生物中，按氨基酸序列特征与催化特性，非动物血红素过氧化物酶可分为三类，其中III类过氧化物酶（PRXs）为植物特有的分泌型氧化还原酶，参与有毒过氧化物清除、细胞壁形成、伤口愈合以及生长素合成与代谢等生理过程。已有研究表明，III类PRX基因兼具调控植物发育与维持非生物胁迫下活性氧（ROS）稳态的双重作用，如在鹰嘴豆（Cicer arietinum）中CaPRX8在干旱与盐处理48 h内显著上调，在甘薯（Ipomoea batatas）中IbTOE3过表达可通过促进ROS清除提高烟草耐盐耐旱性。珍珠粟为C4禾谷类作物，对干旱、高温与贫瘠土壤具有突出耐受性，可在年降雨量不超过250 mm的地区维持生产，耐旱性强于玉米与水稻，但干旱等非生物胁迫仍限制其产量与品质。III类PRX基因家族已在多个物种中系统鉴定，但珍珠粟中该家族尚未得到全面表征，其进化特征与干旱胁迫下的表达模式仍不清楚。基于珍珠粟突出的抗旱性及III类PRXs在ROS稳态中的作用，研究人员提出假说：基因复制促进了PgPRX家族的扩张与功能分化，部分PgPRX基因在PEG诱导渗透胁迫下呈现组织与时间特异性表达模式，可能参与胁迫适应。
研究内容与意义：研究人员系统鉴定了PgPRX家族成员，解析了其系统发育关系、基因结构、保守基序、染色体分布、复制模式及启动子顺式作用元件，并利用RNA-seq差异表达分析与RT-qPCR研究了20% PEG-6000诱导渗透胁迫下的组织与时间特异性表达模式。该研究首次对PgPRX基因家族进行了全面表征，鉴定出可能参与珍珠粟渗透胁迫响应的候选基因，为后续功能研究提供了基因组与表达框架。
关键技术方法：以珍珠粟品种'宁杂4号'为材料，在二叶一心期用含20% PEG-6000的1/2强度Hoagland营养液处理，分别于处理后24、48、96与144 h采集叶片与根，设3个生物学重复。基于四川农业大学发布的珍珠粟PI526529基因组，采用HMM（隐马尔可夫模型）结构域PF00141搜索、BLASTP同源检索与NCBI保守结构域数据库（CDD）验证相结合的策略鉴定家族成员，利用ExPASy ProtParam与WoLF PSORT预测理化性质与亚细胞定位。系统发育分析纳入6个物种共696条PRX蛋白序列，采用MAFFT比对、trimAl修剪，以最大似然法（ML）与邻接法（NJ）建树。另用MEME预测保守基序，PlantCARE预测启动子顺式元件，TBtools进行共线性分析与Ka/Ks计算。表达分析使用NCBI序列读取存档（SRA）公共转录组数据（PRJNA766308与PRJNA850645，品种'Tifleaf 3'），以DESeq2进行差异表达分析；RT-qPCR以UBC-E2为内参基因，采用2?ΔΔCt法计算相对表达量。
研究结果：
3.1 PgPRX基因家族成员的鉴定与理化性质分析：通过HMM筛选、BLASTP同源检索与CDD验证，保留120个推定PgPRX基因，依染色体分布命名为PgPRX1–PgPRX120。编码蛋白长度为208–609个氨基酸，平均342.53 ± 57.90 aa；分子量为22.72–64.53 kDa，平均36.56 ± 6.17 kDa；理论等电点为4.40–9.99，平均6.85 ± 1.63，其中69个为酸性蛋白、51个为碱性蛋白；不稳定指数为23.44–54.23，平均38.20 ± 5.55，75个蛋白被预测为稳定蛋白；脂肪族指数为72.38–95.80，平均85.34 ± 5.01；总平均亲水性为?0.493至0.318，平均?0.049 ± 0.160，69个蛋白具负值，整体偏亲水。亚细胞定位预测显示，蛋白主要定位于叶绿体（54个），其次为细胞外区域（32个），另有液泡膜（9个）、质膜（8个）、线粒体（7个）、细胞质（5个）、内质网（4个）与细胞核（1个）。
3.2 PgPRX基因家族的系统发育分析：基于696条PRX蛋白序列的最大似然法与邻接法构建的系统树主要聚类模式基本一致，支持主要系统发育关系的稳健性。120个PgPRX蛋白被划分为4个亚家族，亚家族I、II、III、IV分别含22、50、39与9个成员，亚家族II最大，亚家族IV成员最少。
3.3 PgPRX基因的基序、保守结构域与基因结构分析：基序分析鉴定出10个保守基序，基序7与基序10最为保守，除PgPRX62外存在于全部成员中且位置模式相似；基序2与基序4分别检测到117与116个蛋白中。94个蛋白含全部10个基序，20个含多个基序的不同组合，6个仅含有限基序，其中PgPRX17、PgPRX42、PgPRX50、PgPRX55与PgPRX69属亚家族I，PgPRX62属亚家族III。
3.4 染色体分布、基因复制与共线性分析：PgPRX基因不均匀分布于7条染色体，鉴定出4个串联重复簇，支持串联重复在家族扩张中的作用。比较共线性分析在珍珠粟与水稻间检测到98对共线基因对，而与拟南芥间仅3对，表明该家族在单子叶植物中保守性更高。对20对片段重复基因对及4个串联重复簇衍生的6组配对进行了Ka/Ks分析，并依据序列分化程度、Ks饱和情况及三种方法间的一致性评估估计可靠性。
3.5 启动子顺式作用元件分析：提取各PgPRX基因起始密码子上游2 000 bp序列作为推定启动子区，经PlantCARE预测并归纳为18个功能类别，发现大量与植物激素信号传导及非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。进一步将顺式元件丰度与DESeq2获得的log2倍数变化值整合，计算各元件类别与叶片、根在24、48、96与144 h表达响应间的Spearman秩相关系数，并采用Benjamini-Hochberg法校正；同时以Fisher精确检验评估6个表达响应簇（C1–C6）中顺式元件的簇特异性富集，以log2（OR）表示富集强度。
3.6 渗透胁迫下的差异表达与功能富集分析：基于公共RNA-seq数据，以|log2倍数变化| ≥ 1且校正FDR < 0.05为标准，108个PgPRX基因在至少一项比较中显著差异表达，呈现明显的组织与时间特异性模式。基于eggNOG-mapper注释的GO与KEGG富集分析以超几何检验评估显著性并经Benjamini-Hochberg校正，FDR < 0.05的条目视为显著富集。
3.7 PgPRX基因的表达分析：RT-qPCR分析6个选定基因，揭示PEG处理下不同的组织与时间依赖性响应，其中PgPRX22与PgPRX41在叶片与根之间呈现相反的表达趋势，PgPRX74表现出明显的组织依赖性响应。
讨论与结论：本研究首次对珍珠粟III类PRX基因家族进行了全基因组系统鉴定与表征，明确了120个家族成员的系统发育分群、基因结构、保守基序组成、染色体分布、串联与片段重复模式、种间共线性关系及启动子顺式元件特征，揭示了串联重复在家族扩张中的作用以及该家族在单子叶植物中较高的保守性。渗透胁迫下的转录组与RT-qPCR分析表明，PgPRX基因对PEG诱导的渗透胁迫呈现显著的组织与时间特异性响应，PgPRX22、PgPRX41与PgPRX74等基因在叶片与根间表现出相反或明显的组织依赖性表达趋势。上述结果为PgPRX家族提供了基因组与表达框架，并为进一步开展珍珠粟胁迫响应功能研究优先筛选了候选基因。需要指出的是，基于序列同源性与保守结构域的鉴定属于全基因组生物信息学分类，并不构成对每个蛋白催化活性的实验验证。
