《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Integrative transcriptomic and single-cell analyses identify Candida-responsive MMP10, CA9, and STC2 candidates in oral squamous cell carcinoma
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背景：口腔鳞状细胞癌（OSCC）发生于微生物暴露的黏膜，但肿瘤转录程序与宿主对Candida albicans反应之间的关系尚不确定。研究人员试图寻找与短期C. albicans刺激共享的方向一致性基因，并评估其诊断、细胞、通路及组织学背景。方法：研究人员将四
背景：口腔鳞状细胞癌（OSCC）发生于微生物暴露的黏膜，但肿瘤转录程序与宿主对Candida albicans反应之间的关系尚不确定。研究人员试图寻找与短期C. albicans刺激共享的方向一致性基因，并评估其诊断、细胞、通路及组织学背景。方法：研究人员将四项配对的C. albicans刺激/对照口腔上皮实验（GSE56091）与40对OSCC/癌旁组织（GSE37991）进行方向性整合。采用四种机器学习方法对候选基因进行优先级排序，并使用167例OSCC和45例对照（GSE30784）进行独立bulk验证。在发现队列中固定一个探索性ridge评分并应用于外部队列。在7例患者的配对单细胞图谱（GSE198315）及外部口腔亚组（10例癌和3例正常黏膜，GSE181919）中检查细胞定位和状态。对三组各4例存档口腔组织进行定性PAS和IHC评估。结果：Candida刺激产生508个探索性差异表达基因，OSCC产生1,850个；35个重叠基因中26个呈同向变化。四方法交集包含MMP10、CA9和STC2；外部单基因AUC分别为0.968、0.714和0.907。三基因评分外部AUC为0.959（95% CI 0.935-0.983），但在发现队列衍生截断值下敏感性为0.605、特异性为1.000；校准较差，判别能力未超过MMP10单独（DeLong P = 0.365）。在GSE198315中，配对上皮pseudobulk在预设靶向三基因校正下支持MMP10和CA9（两者FDR = 0.0455），而STC2呈方向性但无统计学意义（FDR = 0.0665）。全基因组FDR各基因约为0.892，因此单细胞发现支持定位和方向一致性而非明确的全基因组差异表达。q95判定与CopyKAT和inferCNV重叠有限（Jaccard分别为0.141和0.254）。MMP10和CA9的合并描述性定位强于STC2；CA9仍与缺氧相关。真菌元件兼容的PAS染色提供形态学背景，但既不能鉴定物种也不能量化负荷。结论：MMP10和CA9作为方向一致性Candida响应性OSCC候选基因具有最强的多层次支持，而STC2仍为探索性。三基因组合尚非校准的临床模型，26基因重叠定义了共享宿主反应模式而非C. albicans导致OSCC转录状态的证据。
口腔鳞状细胞癌（OSCC）发生于微生物暴露的黏膜，是全球重大健康问题，其发生发展涉及恶性上皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞及黏膜微生物群等构成的复杂肿瘤微环境。口腔微生物失调与口腔癌相关，但多数临床研究为观察性，无法区分因果。Candida albicans因可在上皮表面持续存在、破坏上皮屏障、产生致癌性乙醛并激活炎症信号而受到关注，实验证据提示其可能通过IL-17A/IL-17RA-巨噬细胞轴促进口腔癌变，但尚未确立其与人类OSCC的普遍因果关系。既往OSCC转录组研究已鉴定肿瘤相关表达特征，当代生物标志物开发趋向整合bulk转录组、单细胞图谱与机器学习。为此，研究人员建立方向感知分析框架，探究哪些宿主上皮基因在C. albicans刺激后发生改变且在OSCC中呈同向变化，假设该框架可鉴定与短期C. albicans刺激共享的候选宿主反应程序，而不暗示真菌暴露导致肿瘤表型。研究采用序贯的发现、优先级排序、验证和细胞背景设计，使用NCBI GEO公共去标识转录组数据集：GSE56091定义短期C. albicans响应性口腔上皮转录组（8个OKF6-TERT2样本构成4对匹配刺激-对照，暴露后5 h采集）；GSE37991为配对OSCC发现队列（40例患者80份标本，含40份原发OSCC及40份患者匹配癌旁非肿瘤组织）；GSE30784为独立bulk验证队列（排除口腔异型增生后212份非配对标本，含167例OSCC和45例正常口腔样本）；GSE198315为主要单细胞数据集（7例患者14份配对癌旁与肿瘤核心标本，质控后保留100,392个细胞，含19,069个上皮细胞）；GSE181919为外部单细胞评估数据集（HPV阴性口腔亚组含10例患者13份标本，即10份癌和3份正常口腔黏膜）。所有转录组数据集均为公共去标识数据，未进行新的受试者招募或干预。差异表达分析在R中完成，GSE56091采用limma配对模型评估刺激与对照差异，探索性Candida响应基因要求FDR<0.05、绝对log2倍数变化≥0.75且在两种菌株中方向一致；GSE37991采用配对limma模型比较OSCC与匹配癌旁组织，OSCC相关基因要求FDR<0.05且绝对log2倍数变化≥1。方向一致性整合按基因符号匹配两数据集，保留双向均为正效应或均为负效应的基因作为候选，方向相反的基因排除于特征选择之外。功能注释使用clusterProfiler和人类基因注释进行GO生物学过程、细胞组分和分子功能分析，KEGG结果若未通过多重校正则仅作名义探索性注释。四种机器学习特征选择方法在全部80份GSE37991样本中独立评估26个方向一致性候选基因：二项LASSO回归（glmnet::cv.glmnet，保留lambda.1se处非零系数基因）、线性SVM递归特征消除（e1071）、200棵树随机森林（保留平均降低Gini不低于平均重要性的基因）及Boruta（最多500次迭代鉴定所有相关特征），候选集为四种方法生成特征集的观察交集，未手动添加基因。为避免匹配标本间信息泄漏，五折交叉验证分配在患者水平生成。候选基因表达在GSE37991和GSE30784中评估，采用双侧配对Wilcoxon符号秩检验和双侧Wilcoxon秩和检验，P值在各队列内对MMP10、CA9和STC2进行Benjamini-Hochberg校正。单基因ROC曲线、AUC及95%置信区间用pROC计算；发现队列AUC视为表观样本内估计，GSE30784提供独立回顾性验证。联合模型中三基因在各队列内z标准化，在GSE37991中拟合ridge逻辑模型（glmnet alpha=0，患者分层10折交叉验证，lambda.1se=0.051615），固定线性预测子为-0.095 + 1.052×z(MMP10) + 1.213×z(CA9) + 0.856×z(STC2)，截断值0.4246由发现队列折外预测经Youden标准选定并原样应用于外部预测概率，报告外部判别、敏感性、特异性、校准截距和斜率、Brier评分、决策曲线净获益及与各单基因ROC的DeLong比较。免疫和基质特征在GSE37991中用ssGSEA（GSVA）估计25个精选特征，配对差异用双侧配对Wilcoxon符号秩检验并经Benjamini-Hochberg校正，解释为bulk转录估计而非细胞丰度直接测量；核心基因/特征关联用Spearman相关，在75个基因-特征组合中FDR校正，并在40份OSCC样本内重复作为预设敏感性分析。肿瘤内相关排序GSEA在40份OSCC样本中用fgsea针对MSigDB C2:CP: KEGG legacy v7.5.1集合进行，锁定高精度运行参数并分别在各核心基因分析内Benjamini-Hochberg校正；配对GSVA对12条预设KEGG通路分别进行，配对Wilcoxon符号秩检验并经Benjamini-Hochberg校正。GSE198315用Seurat处理可视化，在簇水平用预设经典标记集注释宽细胞类别；配对上皮pseudobulk分析在患者-区域水平聚合原始计数后用edgeR配对设计检验，靶向Benjamini-Hochberg校正针对三个预设基因并与全基因组校正分开报告。描述性上皮状态关联分析将三基因表达与四个状态模块评分（增殖、炎症、上皮-间质转化、缺氧）在每例患者肿瘤核心上皮细胞中汇总为均值（n=7），计算患者间Spearman相关，计算AddModuleScore前从相应模块基因集中移除被测基因以防自相关。探索性表达衍生CNV评分分析在GSE198315上皮细胞中进行，基因按染色体位置排序并以连续50基因 bins汇总，以每例患者癌旁非肿瘤上皮细胞定义参考分布，主要描述性阈值为患者特异性第95百分位数，高于阈值肿瘤核心上皮细胞称为高CNV评分细胞，其余为不确定；敏感性分析在第90、97.5和99百分位数重复分类。跨算法稳健性评估分别对每例患者从原始上皮细胞计数运行CopyKAT v1.2.5和inferCNV v1.28.0，以该患者癌旁非肿瘤上皮细胞为参考；因inferCNV未启用HMM不提供通用恶性细胞标签，每细胞负荷定义为最终去噪表达比值矩阵偏离1的平均绝对偏差，高于患者特异性癌旁组织第95百分位数的肿瘤核心细胞称为高负荷。候选基因定位使用原始Seurat标准化表达值而非inferCNV过滤位点值。GSE181919独立分析未与GSE198315合并，保留HPV阴性口腔正常黏膜和癌样本及作者提供细胞注释，上皮表达按样本聚合用于10例癌与3例正常黏膜的全样本比较，并另在P6、P15和P21中进行配对敏感性分析。病理学部分为福建医科大学附属口腔医院存档福尔马林固定石蜡包埋口腔组织的回顾性分析，根据组织病理学和PAS形态定义三个描述性组：组织学正常口腔黏膜（HC）、伴真菌元件兼容PAS染色的非肿瘤性口腔黏膜（FI）和组织学确诊OSCC伴真菌元件兼容PAS染色的组织（FI-OSCC），每组4例共12例独立患者，各组非重叠非配对；PAS可突出真菌细胞壁多糖但不能可靠鉴定物种、区分Candida与其他真菌或量化真菌负荷，FI和FI-OSCC标签因此表示基于形态的类别而非微生物学确认的感染。IHC中候选蛋白面板优先评估MMP10和CA9因其跨数据集支持强于STC2，STC2未行IHC评估。全切片图像用Win180数字切片扫描仪采集，两名合格病理学家在盲法下独立审阅，代表性PAS和IHC图像可定性评估，但病例级IRS或H-score、阳性细胞密度、临床协变量及定量图像分析数据不可用，病理面板仅作定性解释，未进行推断性组间比较。所有检验除特别说明外为双侧，Benjamini-Hochberg FDR<0.05视为统计学显著；单细胞靶向FDR值仅指三个预设候选基因并与全基因组FDR分开报告；单细胞分析以患者或样本而非单个细胞为推断生物学单位。研究结果如下：方向感知整合鉴定出26个在短期C. albicans刺激与OSCC间共享的基因——Candida刺激的OKF6-TERT2上皮细胞中508个基因符合探索性标准（354上调、154下调），配对GSE37991比较鉴定1,850个OSCC差异表达基因（686上调、1,164下调），35个基因存在于两集合中，方向分类保留26个同向变化基因并排除9个相反效应基因；保留候选基因的GO分析突出表皮发育、胶原代谢过程、巨噬细胞分化、生长因子受体结合和生长因子活性，无细胞组分术语达到FDR阈值，五个展示的KEGG术语为IL-17信号、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症转录失调、类风湿关节炎和急性髓系白血病，均为名义富集未通过FDR校正仅用于产生生物学假设。四种独立算法汇聚于MMP10、CA9和STC2——26个候选基因经四种互补特征选择程序评估，患者分层五折交叉验证用于LASSO和SVM-RFE，LASSO在lambda.1se处保留6个基因，SVM-RFE在3个基因时达到最佳合并留出准确率（0.963），Boruta确认25个所有相关特征，200棵树随机森林保留8个重要性不低于平均的基因，四输出报告交集恰含CA9、MMP10和STC2三个基因；三基因发现阶段效应为MMP10在Candida刺激后升高（log2FC=1.876，FDR=0.0287）且在OSCC中升高（log2FC=3.334，FDR=2.97×10?16），CA9在Candida刺激后升高log2FC=1.857（FDR=9.18×10?4）且在OSCC中升高log2FC=4.797（FDR=3.88×10?16），STC2在Candida刺激后升高log2FC=1.756（FDR=0.00538）且在OSCC中升高log2FC=1.223（FDR=4.26×10?12）。单基因及探索性三基因评分显示回顾性判别——三基因在两队列中OSCC表达均高于对照，GSE37991中CA9、MMP10和STC2中位表达差异分别为5.206、2.788和1.276（分析log2尺度），三个配对比较FDR均为4.00×10?8；独立GSE30784队列中CA9（0.093）和STC2（0.681）中位差异较小但MMP10较大（6.603），均在FDR校正后显著。发现队列表观样本内AUC为MMP10 0.993（95% CI 0.979-1.000）、CA9 0.985（95% CI 0.963-1.000）、STC2 0.942（95% CI 0.894-0.989），因特征选择和ROC评估使用同一队列这些估计偏乐观不代表性交叉验证性能；独立GSE30784队列中AUC为CA9 0.714（95% CI 0.645-0.783）、MMP10 0.968（95% CI 0.947-0.989）、STC2 0.907（95% CI 0.863-0.951），CA9性能衰减强调队列特异性分布和独立评估的重要性。探索性ridge评分外部AUC为0.959（95% CI 0.935-0.983），在发现折外截断值0.4246处外部敏感性0.605、特异性1.000，校准较差（截距=9.659，斜率=3.858，Brier评分=0.243），评分判别未优于MMP10单独（DeLong P=0.365）但超过CA9（P=1.59×10?14）和STC2（P=0.00722）；因回顾性病例-对照采样和队列水平z标准化，不能声称群体水平临床效用，可用元数据不支持与临床变量模型比较，故三基因评分提供探索性跨平台判别但既不优于MMP10单独也不足以构成外部验证的临床特征。肿瘤内GSEA和配对GSVA表征互补通路背景——40份OSCC样本中186个存档KEGG基因集中183个符合预设大小标准并对每个核心基因检验，锁定高精度运行且基因内FDR<0.05时MMP10有28条通路显著、CA9有11条、STC2有10条，无通路对三基因均显著，MMP10与CA9重叠8条、MMP10与STC2重叠2条、CA9与STC2无重叠，共39条不同显著通路；MMP10正向标准化富集评分包括黏着斑、ECM受体相互作用、细胞周期和癌症通路，负向包括花生四烯酸、亚油酸、视黄醇和异源物/药物代谢基因集；CA9正向包括细胞周期、DNA复制、剪接体和核苷酸代谢基因集，负向包括血管平滑肌收缩、钙信号、神经活性配体受体、细胞黏附分子及部分脂质/药物代谢基因集；STC2显示一个FDR显著正关联（嗅觉转导）和九个负关联（趋化因子信号、原发性免疫缺陷、抗原加工提呈、B细胞受体信号和NK细胞介导细胞毒等），这些模式表明通路成员基因与各靶标在bulk肿瘤中共变而非靶标驱动通路调控。配对GSVA对12条选定通路提供直接肿瘤-癌旁比较，11条FDR校正后显著，最大中位配对升高为NOD样受体信号（delta=0.372，FDR=6.31×10?6）、ECM受体相互作用（delta=0.361，FDR=1.89×10?6）、Toll样受体信号（delta=0.299，FDR=1.47×10?5）、黏着斑（delta=0.254，FDR=1.89×10?6）和Fcγ受体介导吞噬（delta=0.225，FDR=3.85×10?6），趋化因子、T细胞受体、B细胞受体、白细胞跨内皮迁移、肌动蛋白骨架和凋亡通路亦升高，细胞黏附分子是唯一校正后不显著的预设通路。OSCC与协调免疫和基质特征改变相关——25个ssGSEA特征中13个在配对OSCC与癌旁组织间FDR<0.05差异，最大正向中位配对差异为髓源性抑制细胞（MDSCs；delta=0.192，FDR=9.27×10?7）、调节性T细胞（Treg；delta=0.118，FDR=8.01×10?6）、细胞毒性细胞（delta=0.077，FDR=0.0195）、辅助性T细胞（delta=0.076，FDR=0.00357）和成纤维细胞（delta=0.056，FDR=6.91×10?6），肿瘤中Th17细胞、未成熟树突状细胞和树突状细胞特征较低而单核细胞、滤泡辅助性T细胞、内皮细胞、浆细胞样树突状细胞和NK细胞评分较高，保留全部25个特征的热图显示显著患者间异质性，这些配对变化表明广泛重塑而非所有免疫区室一致增加。全部80份样本中75个核心基因/免疫特征相关有25个FDR<0.05，其中24个涉及图4C、D展示的13个配对差异特征，MMP10、CA9和STC2各与MDSC、Treg和成纤维细胞特征正相关并与Th17细胞特征负相关；因这些密集关联可能反映肿瘤-癌旁分离，分析在40份OSCC样本内重复，仅三个关联仍显著：MMP10与单核细胞（rho=-0.635，FDR=8.16×10?4）和中性粒细胞（rho=-0.569，FDR=0.00318），CA9与内皮细胞（rho=-0.589，FDR=0.00241），STC2无肿瘤内FDR<0.05关联，故合并队列主网络视为描述性。配对单细胞分析优先支持MMP10并将CA9与缺氧关联——GSE198315图谱含7例患者配对NT和TC组织100,392个质控细胞，解析为8个宽细胞区室，NT和TC细胞占据部分重叠但组成不同的UMAP区域；特征图在全集图谱中定位三基因，细胞类型和区域分辨点图汇总平均表达和表达细胞百分比，这些展示用于细胞定位而非细胞水平推断检验。配对上皮pseudobulk分析显示三个预设候选基因均有NT至TC正向效应，MMP10 log2FC=2.106（名义P=0.0166；靶向FDR=0.0455），CA9 log2FC=1.189（P=0.0303；靶向FDR=0.0455），STC2 log2FC=1.634（P=0.0665；靶向FDR=0.0665），这些靶向FDR仅适用于预设三基因检验族并与全基因组发现显著性不同，全基因组FDR各基因约0.892，均未达全基因组显著性，故单细胞结果支持定位和方向一致性但不构成明确全基因组差异表达证据。7例患者水平TC上皮谱中CA9与不含CA9计算的缺氧模块显示最强描述性关联（Spearman rho=0.96），MMP10与缺氧（rho=0.54）和增殖（rho=0.57）正相关；因仅7例患者贡献这些相关，解释为描述性状态关联而非因果或精确群体水平效应证据。10,344个肿瘤核心上皮细胞中患者参考第95百分位规则鉴定691个高CNV评分细胞（6.7%），9,653个为不确定；阈值敏感性分析在q90鉴定1,359个细胞（13.1%）、q97.5鉴定432个（4.2%）、q99鉴定263个（2.5%），表明绝对计数依赖阈值。691个q95高评分细胞中表达图显示，与8,289个较低评分癌旁非肿瘤上皮细胞描述性比较，MMP10对比最明显：可检测表达从6.9%升至35.7%，平均标准化表达从0.117升至0.369；CA9变化 modest（4.4%至6.1%；均值0.019至0.024）；STC2可检测细胞比例较高（4.8%至12.7%）但平均表达几乎不变（0.040 vs 0.042），这些结果仅支持描述性定位不确立恶性细胞身份或患病率。跨算法分析中CopyKAT对6,937个肿瘤核心细胞（67.1%覆盖）返回明确判定，含3,039个非整倍体判定，3,407个未定义；inferCNV衍生患者特异性负荷阈值鉴定970个肿瘤核心细胞为高负荷。q95与CopyKAT可评估细胞合并一致性62.2%，Cohen kappa 0.152，正集Jaccard 0.141；CopyKAT回收441个可评估q95高细胞中429个（97.3%），但全部691个q95高细胞中250个（36.2%）未定义，故429/691（62.1%）全部q95高细胞为CopyKAT非整倍体，仅3,039个CopyKAT阳性细胞中429个与q95重叠（14.1%），表明CopyKAT阳性集更广；CopyKAT还将6,903个明确癌旁参考细胞中1,172个（17.0%）标记为非整倍体并对P01、P09和P10发出低数据质量警告，P09肿瘤核心覆盖40.3%且可评估肿瘤核心细胞中99.1%为非整倍体。q95与inferCNV合并一致性90.4%但主要由共同非阳性/非q95高判定驱动，kappa 0.354，正集Jaccard 0.254，inferCNV衍生负荷规则回收691个q95高细胞中336个（48.6%），三种方法在332个细胞中均为阳性；Jaccard值患者间差异大，P06汇聚最强，P10仅22个肿瘤核心细胞视为探索性。合并描述性细胞水平总结中，MMP10和CA9在q95、CopyKAT和inferCNV定义下阳性组平均表达和可检测细胞百分比更高，但患者内方向异质；STC2在q95和inferCNV阳性组较高但在CopyKAT阳性细胞中平均表达低于CopyKAT阴性细胞，表明定位混合；这些RNA衍生比较仅支持描述性定位和跨算法稳健性，不确立恶性细胞身份、患病率或DNA水平CNV。GSE181919 HPV阴性口腔亚组17,547个质控细胞独立分析为MMP10提供最清晰外部支持：10例癌与3例正常黏膜样本比较中MMP10 log2FC=11.54，靶向FDR=0.0918；三患者配对敏感性分析中MMP10 log2FC=10.60，靶向FDR=0.00288；CA9呈正向变化但未达统计学显著（全样本靶向FDR=0.288；配对靶向FDR=0.498），STC2外部证据弱。因存档材料有限，STC2外部支持较弱是MMP10和CA9而非STC2优先用于探索性IHC的原因，STC2因此未行蛋白水平评估，故GSE181919未独立验证全部三基因。比较q95高CNV评分肿瘤核心上皮细胞与较低评分癌旁非肿瘤上皮细胞的配对pseudobulk敏感性分析仅在4例GSE198315患者中可行（每类至少20个细胞），MMP10、CA9和STC2均未达显著（靶向FDR各基因0.822712），该阴性结果保留透明报告未用作主要阳性证据。代表性病理学提供定性组织背景但无病例级验证——病理系列含HC、FI和FI-OSCC组织（每组4例），代表性PAS面板显示FI和FI-OSCC展示视野中箭头指示的浅表结构具丝状和隔膜/缢缩特征，分类为真菌元件兼容PAS染色；因PAS可突出真菌细胞壁多糖但非物种特异，图像不能鉴定微生物、区分Candida与其他真菌或量化负荷。MMP10和CA9染色在展示的HC、FI和FI-OSCC视野中可检测，两种蛋白FI均显示比HC更广的上皮染色而FI-OSCC显示异质性上皮和基质染色而非一致进一步增加，这些代表性图像仅支持组织定位不证明肿瘤特异性、单调HC至FI至FI-OSCC趋势或病例级差异。免疫标记面板显示FI和FI-OSCC视野中CD8阳性淋巴细胞浸润视觉上多于代表性HC视野，CD68/CD163阳性髓系染色更显著，而FOXP3阳性细胞相对稀疏和异质；NLRP3、caspase-1和GSDMD染色三组间变化且常以FI而非FI-OSCC最强，E-cadherin膜染色在FI-OSCC视野中较HC和FI视觉上降低；因病例级定量评分和统计比较不可用，这些观察为描述性不能确立显著性、组间排序、通路激活或因果进展。讨论部分指出，方向感知整合鉴定了短期C. albicans刺激与配对OSCC组织间共享宿主反应候选集，但各候选基因及各证据层支持不同。四种特征选择方法均汇聚于MMP10、CA9和STC2，两个bulk队列支持差异表达和回顾性判别；探索性联合评分未优于MMP10单独且外部校准差，不应视为已验证临床特征；患者感知单细胞和组织分析为MMP10和CA9提供最强多层次支持而STC2仍为探索性，此证据梯度与将三基因视为同等验证不一致。26个同向改变基因提示短期C. albicans刺激可激活在OSCC中保留或重激活的上皮程序；肿瘤背景中类似程序可能反映真菌接触或浅表定植、上皮损伤修复信号、缺氧和代谢适应、细胞外基质重塑、炎症或创伤样基质激活或独立于持续真菌感染的肿瘤内在转录重编程，重叠因此表明转录汇聚而非C. albicans导致OSCC转录状态。从Candida响应性上皮基因出发使本研究区别于纯肿瘤生物标志物筛选；Candida可通过主动穿透或诱导内吞进入上皮细胞、激活先天和黏膜免疫程序并产生乙醛，实验和前瞻性研究提示与巨噬细胞炎症、免疫逃逸和口腔恶性转化的背景依赖联系，这些观察使感染相关与肿瘤相关程序重叠具生物学合理性；然而异型增生或癌症本身可能通过改变组织架构、免疫和营养增加真菌负荷，因数据集为横断面且背景不同，无法解决时间方向或区分因果，共享程序应指导受控机制研究。MMP10在各证据层是最强候选，在Candida刺激后和配对OSCC中同向变化、被四算法选中、独立bulk数据中仍升高、外部AUC 0.968，探索性三基因评分未显著改善此单基因判别；GSE198315中配对上皮pseudobulk在靶向校正下支持MMP10升高，表达-CNV总结在q95高评分亚组显示最清晰对比，合并描述性总结中MMP10在CopyKAT非整倍体和inferCNV高负荷组表达也高于各自比较组，GSE181919提供最强外部单细胞支持；MMP10可重塑细胞外基质和肿瘤-基质相互作用，既往OSCC研究报告组织和唾液表达及与转移联系，这些数据支持空间和功能验证但持久Candida诱导MMP10依赖性侵袭表型尚未检验。CA9和STC2证据更有保留：CA9在方向一致性集中OSCC倍数变化最大但外部bulk AUC从0.985降至0.714，GSE198315配对上皮pseudobulk在靶向校正下支持CA9且患者水平表达紧密追踪不含CA9计算的缺氧模块（rho=0.96），相反仅小部分q95高CNV评分细胞表达CA9、与较低评分癌旁上皮细胞对比 modest 且GSE181919呈非显著上升方向；此模式符合CAIX作为缺氧诱导pH调节酶，支持CA9为空间受限的缺氧相关组织状态标志物而非普遍恶性上皮或直接真菌反应标志物。STC2在两bulk队列升高且外部AUC 0.907，但未达靶向配对pseudobulk FDR阈值且外部单细胞支持弱；诊断判别与机制或细胞验证回答不同问题，高外部AUC单独不足以验证；尽管STC2为应激响应糖蛋白且报道有HNSCC致癌功能，应保持探索性待更大患者水平和空间研究；因存档材料有限，STC2外部支持较弱是其未优先用于探索性IHC的原因，STC2因此在本研究中缺乏蛋白水平评估。免疫和通路分析将候选集置于更广泛多细胞重塑中，配对bulk谱提示髓系、Treg、成纤维细胞和内皮改变与当前OSCC微环境功能障碍模型一致，单细胞研究类似描述CAF介导信号、免疫抑制性肌成纤维细胞、异质免疫状态和部分EMT肿瘤-CAF通讯；肿瘤内仅三个基因-特征关联仍显著，阻止密集合并队列网络被解释为基因特异性免疫调控；肿瘤内GSEA同样产生基因特异性而非共同通路关联，MMP10与黏着斑/ECM和细胞周期状态共变最明显，CA9与增殖和部分代谢状态，STC2主要与负向免疫通路状态；无通路在三分析中均通过FDR校正；配对GSVA单独估计肿瘤-癌旁在基质、黏附、先天感知、趋化因子和淋巴细胞程序差异，与上皮可塑性、细胞-基质相互作用和侵袭既定联系一致；因两分析估计不同对比，主题重叠为背景性而非独立机制确认；ssGSEA不测量细胞计数，肿瘤内GSEA仍易受肿瘤纯度、细胞组成和临床异质性影响，图1D KEGG注释为名义探索性发现，这些分析不确立特定Candida-免疫机制。配对GSE198315设计通过患者内比较癌旁非肿瘤与肿瘤核心组织并以患者而非每细胞为推断单位改善细胞解释，也区分候选基因：MMP10具最清晰高CNV评分上皮定位，CA9追踪缺氧，STC2患者水平支持有限；GSE181919独立口腔亚组最清晰重现MMP10方向。表达-CNV评分仍为广泛染色体偏差的RNA基启发式而非DNA水平CNV测定或标准恶性细胞分类器，q90-q99敏感性分析显示高评分肿瘤核心上皮细胞数依赖阈值；患者匹配CopyKAT和inferCNV比较提供部分但异质跨算法支持：q95阳性细胞在CopyKAT返回明确判定时通常包含于更广CopyKAT阳性集，但全部q95阳性细胞36.2%无明确CopyKAT判定且癌旁参考自身含大量CopyKAT非整倍体分数，inferCNV衍生负荷规则回收约半数q95阳性细胞；低合并Jaccard值、CopyKAT质量警告和显著患者变异表明无调用器提供可互换恶性细胞标签，这些分析支持定位和方向一致性但不替代组织病理学、DNA谱分析、空间验证或独立大临床队列。PAS和IHC蒙太奇提供定性空间背景同时暴露验证缺口：展示的FI和FI-OSCC视野中PAS突出具丝状和隔膜/缢缩特征的浅表结构兼容真菌元件；PAS可染真菌细胞壁多糖但真菌元件兼容PAS染色不能物种水平鉴定微生物、区分Candida与其他真菌、量化负荷或确立时间优先；直接将真菌状态与基因特征连接需物种特异测定如C. albicans qPCR或ddPCR、带适当污染控制的ITS测序或物种定向FISH。MMP10和CA9染色在HC、FI和FI-OSCC中可检测，FI显示比HC更广上皮染色而FI-OSCC显示异质上皮和基质染色而非一致进一步增加，代表性视野因此未证明肿瘤特异性、单调组趋势或病例级差异；图7免疫细胞面板和补充重塑面板同样描述性，无盲法评分或可重复数字定量、预设比较和多重控制，不能从图像得出统计或因果推断。研究结合预设方向一致性规则、患者感知交叉验证、四种互补特征选择方法、独立bulk队列、配对免疫和通路分析及将配对发现与外部评估分开的单细胞分析，保留阴性敏感性结果，区分靶向三基因FDR与全基因组FDR，未将不确定上皮细胞强制归入恶性类别。重要局限仍存：Candida数据集仅含4对感染-对照、单一5 h时间点和两种菌株，限制对慢性定植、生物膜、其他菌株或患者黏膜的推广；跨平台与OSCC重叠可能反映汇聚应激而非病原特异生物学；探索性三基因模型使用队列内标准化、外部校准差、不优于MMP10单独且因无协调协变量不能与临床变量模型比较；回顾性病例-对照队列仍易受批次效应和谱偏倚影响；GSE198315含7例配对患者，GSE181919仅3例正常口腔样本和3例配对患者；表达-CNV评分间接且阈值敏感，CopyKAT仅对67.1%肿瘤核心上皮细胞返回明确二倍体/非整倍体判定，inferCNV因禁用HMM需分析特异性负荷阈值，三方法均使用同一RNA矩阵和癌旁组织参考；CopyKAT还对P01、P09和P10产生低数据质量警告并将17.0%明确癌旁参考细胞标记为非整倍体，强调参考分类不确定性和RNA衍生判定不稳定性，其一致性因此非独立DNA水平验证；P10仅贡献22个肿瘤核心上皮细胞其患者水平估计不稳定；最后病理系列每组4例但可用组织评估仍为定性，缺乏病例级临床元数据、微生物学确认、盲法定量评分、原始定量值和统计比较，组织发现因此不能支持物种水平C. albicans鉴定、统计蛋白验证、诊断性能或单调HC至FI至FI-OSCC序列。前瞻性验证应在临床注释队列评估前锁定测定平台、标准化程序、系数和截断值，检验校准、决策曲线效用及相对MMP10和临床病理变量的增量价值；单细胞验证应使用预设共识规则并将RNA衍生判定与病理及可行时匹配DNA水平CNV数据比较；机制实验应在常氧和缺氧条件下将原代口腔角质形成细胞和OSCC类器官暴露于活Candida、热灭活菌体、生物膜条件培养基和乙醛，MMP10、CA9和STC2的时间进程扰动结合侵袭、细胞外pH、基质降解、细胞因子和免疫细胞共培养测定可区分介质与标志物；空间转录组学和多路IHC应优先定位侵袭上皮区域的MMP10和缺氧或染色深度梯度的CA9，同时保留STC2为探索性待更强患者水平证据。研究结论部分译为：方向感知整合鉴定出26个与短期C. albicans刺激和配对OSCC组织共享的基因，四种机器学习方法汇聚于MMP10、CA9和STC2。MMP10和CA9作为方向一致性Candida响应性OSCC候选基因具有最强多层次支持；CA9与缺氧相关而非确立为直接真菌反应标志物，STC2仍为探索性。联合评分显示回顾性外部判别但校准差且不优于MMP10单独，故三基因尚非已验证临床特征。PAS和IHC增加定性组织背景但未确立真菌物种或病例级蛋白差异。候选集因此代表共享宿主反应假设而非C. albicans导致或维持OSCC转录状态的证据。
