《Frontiers in Microbiology》：A glycosylation-associated hemagglutinin substitution improves the breadth of an influenza B mRNA vaccine
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引言：乙型流感病毒（Influenza B virus）是季节性流感的重要病原体，其贡献随地区和季节而变化。历史上，乙型流感病毒被分为B/Victoria（BV）和B/Yamagata两大谱系。2020年3月后未确认到自然循环的B/Yamagata谱系病毒，使
引言：乙型流感病毒（Influenza B virus）是季节性流感的重要病原体，其贡献随地区和季节而变化。历史上，乙型流感病毒被分为B/Victoria（BV）和B/Yamagata两大谱系。2020年3月后未确认到自然循环的B/Yamagata谱系病毒，使针对BV的保护成为当前乙型流感疫苗接种的优先事项。研究人员前期研究表明，T214A突变显著改变该抗原的交叉中和能力，可能通过改变糖基化实现。值得注意的是，WHO推荐的当季疫苗株B/Austria/1359417/2021（BV21）缺乏相关糖基化位点。方法：研究人员利用mRNA平台比较B/Wyoming/06/2014（BW06）和BV21在B/Victoria谱系内提供的交叉亚分支保护，并将D212N替换引入BV21作为最小抗原修饰。结果：D212N替换恢复了BV21中的糖基化基序，增强了对所测试异源毒株的交叉中和应答。用高剂量D212N修饰疫苗接种的小鼠在受到不同亚分支测试病毒攻击后显示100%存活。讨论：研究结果为广谱保护性乙型流感疫苗的开发提供了有价值的见解。
研究背景方面，流感是急性呼吸道感染，仍是全球重大公共卫生挑战，据WHO统计每年约导致300万至500万重症病例和29万至65万呼吸道相关死亡。乙型流感病毒与甲型流感病毒同为人类最常见病原体之一，每2至4年引起一次流行，其高内在突变率加之冬春季季节性高峰使疫苗及时更新复杂化。传统流感疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，主要通过诱导体液中和抗体和刺激细胞免疫应答发挥作用，但难以跟上病毒快速抗原漂移，导致疫苗株与流行株频繁不匹配，显著降低疫苗效力，亟需可快速生产并提供广谱交叉保护的新一代疫苗。mRNA疫苗因快速可扩展的生产工艺和诱导保护性免疫的能力而成为有前景的替代方案，其生产基本不依赖序列，可迅速适配新出现毒株。研究人员前期研究发现血凝素（HA）蛋白中T214A突变显著影响乙型流感疫苗的交叉中和活性，推测可能涉及糖基化模式改变。研究人员还注意到WHO推荐的疫苗株BV21在第214位为苏氨酸，但与广反应性毒株BW06在第212位存在差异，BV21为天冬氨酸（D）而非天冬酰胺（N）。由于第212位也可能影响糖基化，研究人员假设D212N替换可通过改变HA糖基化拓宽BV21诱导的抗体应答。本研究设计了编码BW06或BV21 HA蛋白的mRNA疫苗构建体，并将D212N突变引入BV21背景，结果表明该D212N修饰疫苗诱导了强效交叉中和应答，为广谱保护性乙型流感疫苗候选株的开发提供了有价值的参考。
在关键技术方法方面，研究人员采用mRNA-LNP平台制备疫苗，将编码HA的序列克隆至pUC57质粒，经BsaI线性化后体外转录合成含5′帽结构和120个核苷酸多聚腺苷酸尾的mRNA，采用SM-103脂质配方进行脂质纳米颗粒（LNP）包封。免疫原性评价采用假型病毒中和试验，以HEK-293T细胞共转染HA、NA和人气道胰蛋白酶样蛋白酶（HAT）质粒后感染G*ΔG-VSV假病毒制备假型病毒，在稳定过表达人ST6GAL1的293T-α2-6细胞上测定ID50。攻毒保护实验使用BALB/c小鼠，以5×LD50剂量滴鼻攻击B/Austria/1359417/2021、B/Washington/02/2019和B/Brisbane/60/2008三株病毒，监测体重和存活率。采用超高效液相色谱-高分辨质谱分析糖基化修饰，并以RT-PCR定量肺组织病毒载量及H&E染色评估组织病理学变化。疫苗株B/Austria/1359417/2021、B/Washington/02/2019和B/Brisbane/60/2008由华兰生物工程股份有限公司提供。
研究结果方面，第一，BV21与BW06糖基化位点比较：研究人员从GISAID数据库下载两株HA全长氨基酸序列进行比对，发现两株在HA多个位点存在差异，与前期观察不同，第214位在BV21和BW06中相同，但BV21第212位为天冬氨酸而BW06为天冬酰胺，该D/N差异预测导致糖基化位点丢失，糖基化位点预测分析进一步支持这一结论。第二，mRNA-BV21与mRNA-BW06交叉中和活性比较：加强免疫后血清中和能力显著高于初免后，低剂量接种即诱导与高剂量组相似的中和滴度；BV21对同源V1A.3a.2亚分支诱导强效中和但对B/Victoria谱系其他亚分支活性较弱；以异源与同源ID50比值归一化分析证实，BW06虽对V1A.3a.2中和略低于BV21，但对异源亚分支中和 consistently优于BV21，显示更广更均衡的交叉保护潜力。第三，mRNA-BW06和mRNA-BV21疫苗保护效力：以5×LD50三株系统发育不同病毒攻击后，B/Brisbane/60/2008攻击中阴性对照组第6天全部死亡，BW06和BV21高低剂量组均100%存活，四价流感疫苗（QIV）组最终存活率42.9%；B/Washington/02/2019攻击中BV21高低剂量组存活率均为62.5%，BW06低高剂量组分别为75.0%和100%，QIV组28.6%；B/Austria/1359417/2021攻击中所有免疫组及QIV组均100%存活。第四，攻毒后肺部病毒载量和组织病理学：B/Brisbane/60/2008感染后阴性对照组病毒载量显著高于BW06或BV21组，高剂量BW06免疫导致极低肺病毒滴度和轻微病理改变，肺泡结构清晰仅轻度粒细胞浸润，QIV组相对肺病毒NP RNA水平数值上高于BW06和BV21组；B/Washington/02/2019攻击中阴性对照组肺病毒滴度和病理改变较免疫组更严重；B/Austria/1359417/2021攻击中阴性对照组病毒载量最高，BW06、BV21和QIV组病毒载量降低且组织学表现较轻，与存活数据一致。第五，mRNA-D212N疫苗设计与表征：研究人员将D212N突变引入BV21 HA背景，基于GISAID数据库至2026年序列分析显示N212在早期流行株中高度流行但2020年后显著下降，伴随D212及随后E212变异增加，2022至2024年E212占主导但2024年后N212比例再次上升；第212位位于HA主要抗原区190螺旋内，该位置突变可显著影响疫苗诱导保护；质谱分析证实D212N突变位点存在糖基化；加强免疫后D212N修饰疫苗显著提高中和抗体滴度，低剂量即达高剂量相似水平，BV21对V1A.3a.2亚分支保持强中和但对其他亚分支显著弱于D212N，后者显示更广交叉中和；归一化ID50分析显示D212N修饰疫苗较原始BV21显示更均衡一致的交叉中和谱。第六，mRNA-D212N疫苗体内保护效力：B/Washington/02/2019攻击中D212N组实现完全保护，超过BV21组62.5%的保护率；B/Brisbane/60/2008攻击中低剂量D212N组存活率87.5%，低剂量BV21组为100%；所有测试攻击株中高剂量D212N免疫均达100%存活，高剂量BV21对B/Brisbane/60/2008和B/Austria/1359417/2021亦达100%存活但对B/Washington/02/2019为62.5%，结果支持D212N替换对BV21疫苗交叉中和活性和保护广度的有益作用。
讨论部分总结：WHO通过全球流感监测和应答系统（GISRS）每年9月为南半球、2月为北半球推荐疫苗株，但由于流感病毒快速抗原进化，疫苗株不匹配常见，新一代流感疫苗需同时提高生产速度和保护广度。研究人员前期研究表明HA蛋白T214A突变显著损害乙型流感病毒交叉保护，由此提出基于最小抗原修饰增强交叉中和广度而不损害抗原完整性的策略。乙型流感病毒HA有四个公认主要抗原区：120环、150环、160环和190螺旋，其中190螺旋构成受体结合位点的一部分，是最具免疫学意义的区域之一，含潜在N连接糖基化位点。研究人员在SARS-CoV-2研究中显示刺突糖基化位点替换可改变抗体介导中和敏感性，既往研究也探索了糖基化工程改善流感疫苗免疫原性和交叉保护。本研究中BW06对代表多个乙型流感亚分支的假病毒显示更均衡更广的中和活性，而BV21主要对V1A.3a.2亚分支显示强效中和但对其他亚分支弱得多；BV21背景中D212N替换增强交叉中和应答并改善对选定异源株的小鼠保护。既往研究强调B细胞竞争对保守表位抗体应答的影响，甘露糖结合凝集素（MBL）对聚糖的识别也可能影响抗原与先天免疫系统相互作用，但上述机制本研究均未检验，仍属假设。本研究在匹配mRNA剂量下评价疫苗免疫原性，以细胞实验确认抗原表达，这些比较评估测试条件下免疫原性但未分离抗原丰度或三聚体稳定性差异的潜在贡献；此外D212N同时改变氨基酸侧链和糖基化状态，所加聚糖的具体贡献尚未阐明，未来结合雪貂模型和有既往流感感染或接种史个体血清可进一步评估抗原广度和预存免疫影响。
研究结论翻译：总之，D212N修饰的BV21 mRNA疫苗增强了对所测试B/Victoria谱系病毒的交叉中和应答，而观察到的存活获益仅见于高剂量组受到B/Washington/02/2019攻击时。在监测病毒株流行时值得注意的是，研究人员更新的序列分析揭示2024年后N212比例再次上升，突显N212在循环乙型流感病毒中的持续相关性。这些发现支持进一步探索糖基化位点工程作为拓宽乙型流感疫苗保护广度的策略。
