《Frontiers in Plant Science》：Micropropagation of Scoparia dulcis L. through machine learning-assisted optimization and comparative LC-MS phytochemical profiling
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Scoparia dulcis L.（一种因具有抗糖尿病、抗炎和抗氧化特性而被广泛认可的药用草本植物）在本研究中接受了基于机器学习（ML）的微繁殖优化，随后对田间栽培和微繁殖植株进行了比较植物化学评价。叶片外植体培养于添加不同浓度植物生长调节剂（PGRs）的M
Scoparia dulcis L.（一种因具有抗糖尿病、抗炎和抗氧化特性而被广泛认可的药用草本植物）在本研究中接受了基于机器学习（ML）的微繁殖优化，随后对田间栽培和微繁殖植株进行了比较植物化学评价。叶片外植体培养于添加不同浓度植物生长调节剂（PGRs）的Murashige and Skoog（MS）培养基上。MS + BAP 1 mg/L + NAA 0.5 mg/L组合产生了最高的芽诱导效果，每外植体最多10.33 ± 1.28个芽，而添加IAA 1.5 mg/L的半强度MS培养基被证明对根诱导最为有效，产生6.93 ± 0.61条根。生根良好的小植株成功驯化并在离体条件下建立，证实了该方案对这段具有药用价值物种大规模繁殖的可重复性。芽和根诱导的实验数据集被用于训练各种机器学习算法；其中，随机森林（RF）被证明最适合芽数预测，而高斯过程回归（GPR）是根数预测的最佳选择。机器学习模型预测的实验测试最佳激素浓度在三个芽参数中的两个和所有三个根参数上优于传统浓度，RF预测的芽数10.15经实验验证为11.8 ± 0.92个芽，GPR预测的根数7.76经实验验证为7.26 ± 0.35条根。本研究还旨在对田间栽培和微繁殖的S. dulcis植株进行LC-MS代谢谱比较。两种不同来源的植物材料（即微繁殖和田间栽培）之间似乎存在共有和独特的植物化学成分。因此，这表明体外组织培养可能引起代谢物表达的变化，表明体外植物生长环境的条件可能在调节特定代谢物的生物合成中发挥作用。这些发现建立了一个经过验证的、ML辅助的S. dulcis微繁殖方案，并提供了首个比较植物化学证据支持其作为田间栽培植株可持续替代品的用途。
研究背景方面，Scoparia dulcis L.为车前科（原玄参科）药用草本植物，分布于全球热带和亚热带地区，在非洲、美洲和亚洲广泛分布。该植物在多种文化中被用作传统药物治疗胃部疾病、肾结石、高血压、糖尿病、炎症、支气管炎、痔疮等，具有抗糖尿病、抗炎、抗癌、抗菌和保肝等多种治疗活性。植物化学研究已揭示其含有生物碱、黄酮类、萜类、酚类、单宁、氨基酸和碳水化合物等复杂生物活性化合物。由于其广泛的药用用途，该植物常被过度采挖，导致可持续性问题。微繁殖技术可实现大规模生产遗传一致、无病害且生物活性化合物含量稳定的植株，同时减轻对自然种群的压力并支持保护。此前已有研究者尝试使用MS培养基结合激动素和BAP进行S. dulcis的微繁殖，并使用不同生长素进行生根。然而，传统微繁殖依赖单因子逐一优化，耗时且无法捕捉植物生长调节剂（PGRs）之间的交互作用。在S. dulcis中，基于模型的优化仅限于响应面法（RSM）。机器学习（ML）方法在其他植物物种中已用于建模和预测体外对PGRs的响应，但尚未用于预测S. dulcis微繁殖的PGR浓度。此外，尚无系统的LC-MS研究比较微繁殖与田间栽培S. dulcis的次生代谢物谱。因此，本研究旨在将传统实验与机器学习相结合，利用叶片外植体在12种PGR处理下进行芽诱导和10种处理下进行生根，将结果作为数据集训练多种ML算法（线性回归、SVR、GPR、MLP、RF和XGB），利用最佳模型预测最优PGR浓度并进行实验验证，同时对微繁殖和田间栽培植株提取物进行比较LC-MS植物化学谱分析。
研究人员开展了以下研究：从印度泰米尔纳德邦Siddha药用植物园采集S. dulcis植株样本（凭证编号S070825077D）， maintained于VIT温室。叶片外植体经表面消毒后培养于添加不同浓度BAP、IAA和NAA的MS培养基上进行芽诱导，40天后将芽丛切段继代培养42天，总培养期82天。生根阶段使用约3-4 cm再生芽培养于半强度MS培养基（添加NAA和IAA），7周后记录根数和根长。生根良好的小植株经30天初级驯化（椰糠:蚯蚓粪1:1）和30天次级驯化（椰糠:蚯蚓粪:土壤1:1:2）后移栽田间。实验数据用于构建ML模型：第一个数据集包含BAP、IAA、NAA在12种处理下对芽诱导天数、芽长和芽数的响应，每处理15个重复共180个数据点，取5个重复均值后为36个数据点；第二个数据集包含IAA和NAA在10种组合下对根诱导天数、根长和根数的响应，共150个数据点，取均值后为30个数据点。数据经探索性分析后，评估了六种监督回归算法（LR、SVR、GPR、MLP、RF、XGB），使用多项式特征扩展（1阶和2阶）考虑非线性关系和交互效应，对特征敏感算法进行z-score标准化，所有预处理在ML管道内执行以防止数据泄漏。超参数使用随机搜索与五折交叉验证优化，采用嵌套交叉验证框架（外层为留一交叉验证LOOCV）评估模型泛化性能，评价指标为决定系数（R2）、均方根误差（RMSE）和平均绝对误差（MAE）。最佳模型结合约束遗传算法（GA）优化植物激素组合，以芽和根诱导天数最小化、芽长和根长及芽数和根数最大化为目标，搜索空间限定在实验浓度范围内。优化的激素组合经15个重复实验验证。LC-MS/MS-QTOF分析使用Agilent 6550 Mass QTOF系统，正负离子化模式，全扫描范围126-1200 m/z，鉴定田间栽培和微繁殖植株水提物和乙醇提取物的植物化学成分。
研究结果表明：在芽器官发生、生根和驯化方面，MS + BAP 1 mg/L + NAA 0.5 mg/L产生最高芽数（10.33 ± 1.28），平均芽长5.13 ± 0.32 cm；半强度MS + IAA 1.5 mg/L产生最高根数（6.93 ± 0.61），平均根长12.42 ± 0.72 cm；生根植株驯化存活率达80%。在机器学习方面，探索性分析显示BAP在芽数据集中评估浓度范围较auxins更广，芽和根诱导天数分布较窄而长度和数量变异较大，数据无极端异常值，适合非线性回归建模。芽基础ML模型中，GPR对芽诱导天数预测最优（R2=0.648，RMSE=1.458，MAE=1.144），RF对芽长（R2=0.418，RMSE=0.758，MAE=0.621）和芽数（R2=0.686，RMSE=1.430，MAE=1.138）预测最优。根基础ML模型中，XGB对根诱导天数预测最优（R2=0.811），GPR对根长（R2=0.916）和根数（R2=0.613）预测最优。所有非线性模型均优于线性回归，MLP表现较差可能因数据集规模限制。GA优化预测最早芽诱导时间为18.85天（BAP 1.366 mg/L + IAA 0.312 mg/L + NAA 0.417 mg/L），最大芽长5.06 cm（BAP 1.194 + IAA 0.036 + NAA 0.488 mg/L），最大芽数10.15（BAP 1.196 + IAA 0.034 + NAA 0.244 mg/L）；最早根诱导时间22天（IAA 0.005 + NAA 1.105 mg/L），最大根长12.96 cm（IAA 1.568 + NAA 0.170 mg/L），最大根数7.76（IAA 1.636 + NAA 0.052 mg/L）。验证实验中，芽诱导天数19.93 ± 0.76天、芽长5.86 ± 0.49 cm、芽数11.8 ± 0.92、根诱导天数21.06 ± 0.77天、根长13.35 ± 0.60 cm、根数7.26 ± 0.35，与预测结果高度相关。LC-MS/MS-QTOF分析在正负离子化模式下鉴定了田间栽培和微繁殖植株叶片提取物中的酚类、黄酮类、萜类、生物碱和糖苷类等植物成分，两种来源植物材料间存在共有和独特化合物。
讨论部分总结：关于芽诱导，叶片外植体是直接器官发生的良好材料来源，高细胞分裂素与生长素比例有利于芽器官发生，BAP与低浓度NAA组合的效率已在药用植物中报道，芽丛形成表明所选激素浓度能诱导叶片表皮细胞直接器官发生，继代培养证明该组合可重复且适合后续增殖周期。关于根诱导，IAA通过刺激芽基部细胞分裂和激活根特异性基因促进不定根生长，半强度MS + IAA 1.5 mg/L的高效性与先前报道一致。关于驯化，逐步驯化对从体外到离体成功移植至关重要，本研究的建立阶段确保植株有足够生物量和生理发育进行LC-MS植物化学分析并与田间植株比较。关于机器学习，RF最适合芽数预测归因于其集成特性通过多决策树聚合预测减少过拟合并考虑激素与形态发生输出的非线性交互，GPR适合小样本量因提供概率预测和不确定性度量。验证实验证实两种模型可靠性，RF预测最大芽数10.15验证为11.8，GPR预测根数7.76验证为7.26，预测与验证数据高度相关与类似ML微繁殖研究一致。据研究人员所知，ML尚未应用于S. dulcis或任何Scoparia物种的微繁殖，该物种唯一模型引导优化为RSM研究。在其他植物物种中类似模型驱动方法已验证，本研究结果落在类似范围内。关于LC-MS植物化学谱分析，微繁殖组织特有、田间组织特有及共有代谢物的鉴定与比较体外和田间栽培药用植物的更广泛文献一致，研究表明微繁殖保留母株基本植物化学成分但引起一些变化，组织培养条件有时可增强化学多样性。本研究中鉴定的共有化合物包括黄酮和黄酮醇类，S. dulcis中已有 luteolin、apigenin和kaempferol衍生物报道，但物种特征性二萜类如scopadulcic acids和scopadulciol未在提取物中检测到。仅存在于微繁殖植株或仅存在于田间植株的化合物可能反映生长环境、发育阶段和PGR暴露差异。由于分析为定性，这些差异表明微繁殖维持植物大部分化学谱但非全部，需定量研究确认。
研究结论翻译：本研究建立了使用叶片外植体的Scoparia dulcis L.高效微繁殖方案，为传统繁殖方法提供了可靠且可扩展的替代方案。优化的体外再生系统确保真实型小植株的持续均匀供应，鉴于该物种在营养保健品和制药行业需求增长，这尤其有价值。将机器学习模型整合到组织培养优化中标志着重要的方法学进展，证明计算方法能准确预测最优激素浓度，从而最小化资源消耗和实验迭代。这使ML辅助优化成为未来植物生物技术研究的有前景方法，具有广泛药用植物物种的潜在适用性。LC-MS谱分析进一步证实微繁殖植株保留其田间栽培植株的主要植物化学谱，支持其作为生物活性代谢物一致且质量可控来源的适用性。共有和独特化合物的检测也为体外条件下次生代谢物生物合成未来研究开辟了机会。据研究人员所知，这是首个在S. dulcis中整合微繁殖、机器学习优化、验证和LC-MS植物化学比较的组合框架研究，使发现成为植物组织培养和药用植物生物技术领域的有意义贡献。
