《Frontiers in Immunology》：Single-cell analysis reveals smoke-induced neutrophil-macrophage crosstalk as a targetable mechanism in COPD pathogenesis
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背景：慢性阻塞性肺疾病（COPD）预计到2030年将成为全球第三大死亡原因，其中80-90%的病例归因于香烟烟雾（CS）暴露。本研究旨在阐明CS暴露所放大的细胞间通讯网络，并识别驱动吸烟相关COPD发病机制的可靶向通路。方法：研究人员对9例按吸烟状态分层的CO
背景：慢性阻塞性肺疾病（COPD）预计到2030年将成为全球第三大死亡原因，其中80-90%的病例归因于香烟烟雾（CS）暴露。本研究旨在阐明CS暴露所放大的细胞间通讯网络，并识别驱动吸烟相关COPD发病机制的可靶向通路。方法：研究人员对9例按吸烟状态分层的COPD患者肺组织进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（GSE173896），整合了配体-受体相互作用推断（CellChat）、伪时间轨迹分析（Monocle）、表型-细胞关联（Scissor）以及加权基因共表达网络分析（WGCNA）与批量RNA-seq数据（GSE57148）。识别了吸烟相关免疫细胞亚群，并通过功能富集分析优先筛选了致病基因模块。关键计算预测在暴露于香烟烟雾90天的C57BL/6小鼠中进行了验证，评估了肺功能、组织病理学、血清细胞因子（ELISA）、免疫荧光、Western blot和肺髓过氧化物酶（MPO）活性。结果：经过质量控制，共分析40,500个细胞（28,630个来自COPD组织，11,870个来自从不吸烟者对照组织）。在样本水平上，COPD组织显示NK细胞比例低于对照组（FDR = 0.011），巨噬细胞呈增多趋势。细胞间通讯分析揭示中性粒细胞和巨噬细胞为主要信号枢纽，ANXA1-FPR1/FPR2是中性粒细胞向巨噬细胞最显著的配体-受体对之一。轨迹分析随后进行亚聚类和Scissor分析，优先筛选出与批量肺组织中COPD表型相关的巨噬细胞和中性粒细胞亚群。这些模块的富集分析指向中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成和HIF-1信号。体内验证证实了CS诱导的肺功能障碍、血清细胞因子升高（IL-1β、TNF-α、IL-6；均p < 0.05）、巨噬细胞浸润增加伴FPR2上调（p < 0.01）、中性粒细胞积聚（p < 0.01）和NET形成、肺MPO活性增加（p < 0.001）以及HIF-1α蛋白诱导（p < 0.001）。结论：CS暴露通过由HIF-1α诱导的NET形成和失调的ANXA1-FPR2信号介导的自我放大中性粒细胞-巨噬细胞回路驱动慢性肺部炎症。本研究确立了细胞间串扰网络作为连接环境烟草暴露与COPD发病机制的核心机制。按环境暴露分层的单细胞图谱可能为早期生物标志物开发提供信息，并指导吸烟相关肺疾病的通路特异性干预。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）预计到2030年将成为全球第三大死亡原因，吸烟是其主要环境风险因素，然而戒烟仍是唯一能改变疾病进程的干预手段，传统抗炎治疗包括糖皮质激素均无法改变COPD进展，提示存在类固醇抵抗的炎症机制。COPD的病理特征涉及固有免疫和适应性免疫的协同失调，其中巨噬细胞和中性粒细胞在肺组织中的积聚和异常活化尤为突出。尽管已有研究提示COPD由细胞间通讯异常驱动的自我放大炎症回路所致，但慢性吸烟暴露诱导的细胞类型特异性转录程序尚未在单细胞分辨率上得到全面绘制，尤其是吸烟暴露与非吸烟COPD组织之间的直接比较仍属空白。为此，研究人员开展了整合单细胞RNA测序、批量转录组学和香烟烟雾诱导COPD小鼠模型实验验证的多组学研究。研究目标是：（1）在单细胞分辨率上描绘COPD肺组织中吸烟特异性免疫细胞图谱；（2）系统绘制细胞间通讯网络，重点关注吸烟放大的信号通路；（3）整合单细胞发现与批量组织表型，优先筛选疾病相关细胞状态和致病基因模块；（4）通过功能富集分析阐明优先免疫细胞群相关的生物学过程和分子通路；（5）通过体内实验检验关键计算预测。研究结论表明，CS暴露通过由HIF-1α诱导的NET形成和失调的ANXA1-FPR2信号介导的自我放大中性粒细胞-巨噬细胞回路驱动慢性肺部炎症，确立了细胞间串扰网络作为连接环境烟草暴露与COPD发病机制的核心机制，为吸烟相关肺疾病的早期生物标志物开发和通路特异性干预提供了依据。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：单细胞RNA测序分析（GSE173896数据集，包含9例按吸烟状态分层的COPD患者肺组织样本，经质量控制后保留40,500个细胞），使用Seurat进行降维聚类和细胞注释，Harmony校正批次效应，UMAP可视化；CellChat进行配体-受体相互作用推断和细胞通讯网络分析；Monocle进行伪时间轨迹分析；Scissor整合单细胞与批量RNA-seq数据（GSE57148，98例COPD与91例正常肺功能样本）进行表型-细胞关联分析；WGCNA构建基因共表达网络；功能富集分析（GO和KEGG）；以及C57BL/6小鼠CS暴露模型（LPS致敏后CS暴露90天）的体内验证，包括肺功能检测、组织病理学、ELISA、免疫荧光、Western blot和MPO活性测定。
结果部分：（1）吸烟暴露重塑COPD肺免疫微环境——通过单细胞转录组分析9例COPD组织样本，经UMAP降维在吸烟组解析出28个转录簇、非吸烟组24个转录簇，注释出13种主要免疫和基质细胞群，发现COPD组织NK细胞比例显著低于对照组（6.9% ± 3.5% vs. 22.6% ± 4.5%；FDR = 0.011），巨噬细胞呈增多趋势（11.7% ± 6.8% vs. 6.7% ± 2.6%）。（2）中性粒细胞-巨噬细胞串扰驱动吸烟诱导的肺部炎症——通过CellChat配体-受体分析，发现中性粒细胞和巨噬细胞是COPD微环境中的主要信号发送者，通路水平分析识别了BAFF、CALCR、RESISTIN、NRG和OSM五条介导中性粒细胞向巨噬细胞通讯的主要信号级联，配体-受体水平上ANXA1-FPR1和ANXA1-FPR2是中性粒细胞向巨噬细胞最显著的相互作用之一。（3）巨噬细胞和中性粒细胞的伪时间轨迹分析——通过Monocle 2将巨噬细胞解析为10个簇，其中簇5（Mac-C5）位于轨迹分支末端；中性粒细胞同样解析为10个簇，簇8（Neu-C8）占据轨迹终点，两个群体均包含COPD和对照组织来源的细胞，被选为进一步亚聚类分析的对象。（4）整合单细胞和批量转录组学识别COPD相关基因模块——Mac-C5和Neu-C8分别重新聚类产生7个和10个亚簇，Scissor分析以GSE57148批量数据为表型参考，超几何检验显示Mac-C5-1和Neu-C8-3分别显著富集Scissor+细胞；WGCNA分析显示巨噬细胞来源的粉色模块与COPD正相关性最强（r = 0.24，p = 0.006），中性粒细胞来源的黄色模块正相关性最强（r = 0.27，p = 2 × 10??）。（5）COPD相关基因模块的功能注释——巨噬细胞粉色模块的GO生物学过程富集于固有免疫激活通路，包括补体受体介导信号、磷脂酶C激活G蛋白偶联受体信号、免疫应答激活信号转导和胞质钙离子浓度正调控；KEGG通路识别出NET形成和神经活性配体-受体相互作用。中性粒细胞黄色模块的GO分析突出缺氧驱动应激反应，KEGG揭示HIF-1信号通路为吸烟诱导缺氧下中性粒细胞存活和炎症功能的主调控因子，以及Th17细胞分化和线粒体自噬通路。（6）香烟烟雾诱导COPD小鼠模型的实验验证——通过LPS致敏后慢性CS暴露建立C57BL/6小鼠COPD模型，模型组表现出COPD临床特征，包括体重进行性下降、肺功能指标改变（Cchord升高p < 0.01，FEV50%降低p < 0.001，PEF降低p < 0.001）、肺组织MPO活性增加（p < 0.001）、H&E和Masson染色显示肺泡破坏、气道壁增厚和胶原沉积，三重免疫荧光显示citH3?MPO?Ly6G? NET结构增多。（7）CS暴露小鼠的炎症细胞因子、髓系细胞标志物和HIF-1α——血清IL-1β、TNF-α和IL-6显著升高（p < 0.05，p < 0.01），F4/80和FPR2免疫反应性增加（p < 0.05和p < 0.01），Western blot证实FPR2蛋白水平升高约2.2倍（p < 0.05），Ly6G免疫荧光显示中性粒细胞积聚增加（p < 0.01），HIF-1α免疫反应性增加（p < 0.001）。
讨论部分总结了以下要点：本研究结合人肺组织单细胞和批量转录组分析及CS暴露小鼠模型，发现中性粒细胞和巨噬细胞是COPD肺组织中的主要信号发送者，ANXA1-FPR1/FPR2是连接两种细胞类型的最显著配体-受体对之一；亚聚类联合Scissor分析优先筛选出与COPD表型相关的巨噬细胞和中性粒细胞亚群，对应基因模块富集于NET形成和HIF-1信号；CS暴露小鼠中NET形成增加、肺MPO活性升高、FPR2蛋白水平升高、HIF-1α诱导和血清细胞因子升高支持了这些发现。研究提示HIF-1α可能是连接烟草烟雾暴露与中性粒细胞驱动炎症的纽带——CS中的活性氧、丙烯醛和甲醛通过抑制脯氨酰羟化酶结构域（PHD）酶诱导假性缺氧，稳定HIF-1α；HIF-1α转录上调抗凋亡蛋白和糖酵解酶，延长中性粒细胞存活，并通过诱导PAD4促进NET形成。NETs作为损伤相关分子模式（DAMPs）激活巨噬细胞，活化的巨噬细胞分泌趋化因子和细胞因子招募更多中性粒细胞，形成闭合的炎症回路。稳态下ANXA1-FPR2轴发挥促炎症消退功能，但慢性CS暴露可能诱导FPR2失调的病理"消退失败"表型，ANXA1-FPR2信号的条件依赖性多效性——急性炎症中促消退而慢性烟雾暴露下促炎——可能解释传统抗炎治疗在COPD中的失败。研究同时指出若干局限性：单细胞数据集为9例患者的横断面快照，可能无法完全捕捉疾病异质性和纵向进展；小鼠模型验证结果转化至人类干预试验仍需额外步骤；功能富集分析识别了HIF-1α靶基因和NET形成通路，但未通过实验证实HIF-1α直接调控COPD中性粒细胞的NET释放。
研究结论部分翻译如下：总之，本研究将中性粒细胞-巨噬细胞炎症串扰确定为吸烟相关COPD的候选机制。研究数据提示一个回路，其中中性粒细胞中HIF-1α激活和NET形成，连同改变的ANXA1-FPR2信号，可能维持慢性炎症。若经细胞特异性功能研究证实，这些通路可为靶向治疗开发提供信息，如HIF-1α抑制剂、PAD4抑制剂和FPR2调节剂，针对COPD的上游驱动因素而非下游炎症。随着COPD全球负担持续上升，尤其在暴露于生物质燃料燃烧和空气污染的低收入和中等收入国家，本研究的见解可能为治疗开发和旨在预防和减轻吸烟相关肺疾病的公共卫生政策提供参考。
