《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：PDRG1 sustains the proliferative and invasive phenotypes of tumor cells in oral squamous cell carcinoma
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PDRG1（p53与DNA损伤调节基因1）在多种癌中促进增殖与侵袭。然而，既往仅在全组织块中对其进行定量，其瘤内异质性尚未明确建立，且其是否与免疫微环境相关仍不清楚。本研究对91例口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织进行区室与区域解析的免疫组织化学染色，在同一张切片
PDRG1（p53与DNA损伤调节基因1）在多种癌中促进增殖与侵袭。然而，既往仅在全组织块中对其进行定量，其瘤内异质性尚未明确建立，且其是否与免疫微环境相关仍不清楚。本研究对91例口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织进行区室与区域解析的免疫组织化学染色，在同一张切片上分别对肿瘤中心（TCs-Center）与侵袭前沿（TCs-Front）的肿瘤细胞（TCs）、成纤维细胞样细胞（FLCs）和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行评分（n=81），并结合单细胞与泛癌转录组学、siRNA敲低联合RNA测序、外周免疫细胞流式细胞术表型分析（n=56）及生存分析。PDRG1主要定位于肿瘤细胞，侵袭前沿表达高于肿瘤中心，且TCs-Front中PDRG1表达与TNM分期及淋巴结转移高度相关。在HSC3与HN6细胞系中敲低PDRG1可降低增殖、迁移与侵袭能力，下调细胞分裂基因评分及部分上皮-间质转化（EMT）。在TCGA中，PDRG1与连接相关基因呈负相关，与增殖及侵袭标志物呈正相关。然而，PDRG1与免疫浸润无关联，外周血CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD19+ B细胞及CD56+ NK细胞的百分比与计数均无变化，提示其效应并非由抗肿瘤免疫介导。肿瘤细胞中高PDRG1提示较短的总生存期、无转移生存期及无病生存期。综上，PDRG1可能通过调控OSCC肿瘤增殖与侵袭成为新的治疗靶点。
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤，约占口腔癌的90%以上。2022年全球估计新增唇及口腔癌病例约390,000例、死亡188,000例，且全球疾病负担预计将持续上升至2050年。5年总生存率近30年来始终维持在50%左右，晚期患者预后更差。癌基因激活与抑癌基因缺失驱动增殖、侵袭与转移，仍需能够识别最可能发生播散肿瘤的标志物。约三分之二的OSCC存在致病性TP53突变，且与较短生存期相关。淋巴结转移是主要的不良预后因素，而临床淋巴结阴性患者的隐匿性淋巴结转移目前仍难以预测。PDRG1于2003年被鉴定为受紫外线辐射和p53差异调节的转录本，定位于染色体20q11.2，编码133个氨基酸的蛋白，参与增殖、凋亡、细胞周期调控及DNA损伤修复，近期研究显示其可通过结合TSC2激活mTORC1信号。PDRG1在肺癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、肝细胞癌及胶质母细胞瘤中过表达并发挥促癌作用，高表达与不良预后相关。已报道的机制主要集中于ATM-p53及p21介导的细胞周期与衰老调控。在肝细胞癌中，PDRG1招募EZH2增加p21启动子区H3K27me3，抑制p21转录并驱动进展；另一项同类型肿瘤研究将PDRG1置于转录因子SP1下游及Wnt/β-catenin激活上游。PDRG1也是该肿瘤类型未折叠蛋白反应相关预后特征的十个基因之一。泛癌分析已将PDRG1过表达与多种肿瘤类型的不良预后相关联，支持其作为通用肿瘤标志物的候选资格。然而，上述所有测量均在全组织块上进行，对由异质性细胞构成的病变仅给出单一数值。值得注意的是，同一肿瘤内的恶性细胞在基因型、转录状态和表型上存在差异，且这种变异在空间上有序排列，最显著的分界位于肿瘤巢与侵袭前沿之间。头颈部鳞状细胞癌及皮肤鳞状细胞癌的单细胞与空间分析已鉴定出肿瘤-间质界面处一个独特的恶性细胞群体，其表现出肿瘤巢内细胞未观察到的黏附与细胞外基质程序。仅局限于OSCC深部侵袭边缘的恶性分级比整个肿瘤的分级携带更多预后信息，且该边缘的肿瘤出芽是淋巴结转移和生存的最强组织学预测因子之一。PDRG1在OSCC中尚未在单细胞分辨率下被表征，其是否在病变中均匀分布、哪些细胞类型表达、哪个肿瘤区域驱动临床结局、其表达是否与免疫微环境相关均不清楚。为此，研究人员将91例OSCC病例的区室与区域解析免疫组织化学与单细胞及泛癌转录组学、siRNA敲低联合RNA测序、外周淋巴细胞表型分析及生存分析相结合，以定位PDRG1在肿瘤中的位置、明确其在肿瘤细胞中维持的程序并检验其表达所预测的临床结局。研究结论为：PDRG1主要由肿瘤细胞表达并在OSCC侵袭前沿富集，侵袭前沿高PDRG1与不良预后相关，使其成为识别OSCC侵袭性肿瘤细胞群体的候选标志物及针对该群体治疗的潜在靶点。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：对91例原发OSCC患者手术标本（2013年1月至2019年12月，南京大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科）进行区室与区域解析的免疫组织化学染色与评分（肿瘤细胞、成纤维细胞样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞分别评分，肿瘤中心与侵袭前沿配对比较）；采用GEO数据集（GSE160269、GSE168652、GSE103322）经TISCH数据库进行单细胞转录组分析，TCGA HNSC及乳腺癌队列经TNMplot比较表达差异，cBioPortal评估基因相关性，TIMER分析信号通路与细胞周期相关性；在HSC3与HN6细胞系中进行siRNA敲低联合RNA测序及基因集富集分析（GSEA）与过表达分析；对56例同队列患者术前外周血单个核细胞进行流式细胞术淋巴细胞亚群表型分析；采用Kaplan-Meier分析及Cox比例风险回归进行生存分析。
研究结果如下：
PDRG1在多种肿瘤类型中上调并定位于恶性上皮：TCGA中PDRG1 mRNA在多数癌种（包括HNSC）的肿瘤组织中高于癌旁正常组织。三个独立单细胞RNA测序数据集分析显示，恶性上皮细胞贡献了大部分PDRG1表达，免疫与间质细胞贡献甚微。在HNSCC与BRCA中，PDRG1表达从正常组织到原发肿瘤再到转移灶呈逐步升高。免疫组织化学评分显示肿瘤细胞中PDRG1评分最高，成纤维细胞样细胞、肿瘤浸润淋巴细胞及正常上皮较低，确定肿瘤细胞为OSCC中PDRG1蛋白的主要来源。肿瘤细胞中较高PDRG1与更晚期TNM分期及转移相关，而这些关联在成纤维细胞样细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中较弱或缺失。按各区间中位免疫组织化学评分分组经χ2检验证实：肿瘤细胞高PDRG1与晚期TNM分期（χ2=6.562，P=0.010）及淋巴结转移（χ2=7.014，P=0.008）相关，与性别、年龄、T分期、分化程度或吸烟史均无关。
PDRG1在OSCC侵袭前沿富集：同一OSCC标本内配对比较显示，侵袭前沿PDRG1染色高于肿瘤中心。在肿瘤中心低PDRG1的病例中，前沿与中心评分分布均衡；在肿瘤中心高PDRG1的病例中，73.2%的病例侵袭前沿PDRG1更高。按前沿-中心关系分组，TNM分期分布几乎相同，但前沿评分高于中心评分组T3-T4肿瘤略多。分别分析各区域显示，仅侵袭前沿PDRG1与TNM分期及转移相关，两区域均与T分期或复发无关。按各区域自身中位数二分后比较临床病理特征再现了该区域差异：侵袭前沿高PDRG1与晚期TNM分期、淋巴结转移及年龄≥60岁相关，与性别、T分期、分化程度或吸烟史无关；肿瘤中心PDRG1与七项特征均无显著关联，仅显示淋巴结转移趋势。该模式提示PDRG1与OSCC侵袭性的关联来自肿瘤-间质界面处的肿瘤细胞亚群。
PDRG1敲低抑制OSCC细胞增殖与侵袭：在HSC3与HN6细胞中以siRNA敲低PDRG1，三条siRNA均在mRNA和蛋白水平降低PDRG1，si-PDRG1-3抑制最干净、最一致并被用于后续实验。RNA测序显示PDRG1本身位列下调最强的基因之一。GSEA突出显示有丝分裂程序为主要受损对象：细胞分裂（NES=-2.21，P=0.001，FDR<0.001）与细胞周期（NES=-1.82，P=0.002，FDR=0.031）基因集均被耗竭。CCK-8实验中敲低降低两细胞系72小时内的增殖。划痕实验中敲低缩短迁移距离，Transwell实验中减少迁移和侵袭细胞数，两细胞系反应一致。PDRG1因此维持OSCC细胞的增殖与侵袭表型。
PDRG1维持间质标志物表达并重塑细胞黏附：在HN6细胞中，PDRG1敲低降低N-cadherin、SNAIL和vimentin的mRNA水平；蛋白水平上敲低降低SNAIL、N-cadherin和vimentin但未改变E-cadherin，与mRNA数据一致。PDRG1敲低后差异表达基因的GO过表达分析显示两个主要富集功能组：调控细胞分裂、增殖表型以及细胞-基质黏附、细胞骨架相关信号。KEGG分析中黏着斑为最显著通路之一，ECM-受体相互作用及蛋白聚糖在癌症中亦富集，与同一基质黏附主题一致。在TCGA中，PDRG1与紧密连接基因ZO-1/TJP1（R=-0.53，P=5.80×10
-39）、桥粒基因DSP（R=-0.41，P=4.83×10
-22）、黏附连接基因CDH1（R=-0.17，P=1.57×10
-7）及鳞状分化标志物SPRR1B（R=-0.14，P=8.05×10
-3）呈负相关。ZO-1与DSP相关性最强，将紧密连接与桥粒连接的丧失置于患者肿瘤PDRG1高表型的中心。TIMER 2.0分析显示最强正相关集中于细胞周期与增殖模块，以PCNA（R=0.473）、CDK1（R=0.403）和CCNB1（R=0.279）为首，MKI67相关性弱（R=0.082）。Wnt通路基因亦呈正相关，而Notch、Hedgehog和PI3K/AKT基因无相关性，TGF-β和NF-κB基因呈弱负相关。
PDRG1表达与免疫特征及淋巴细胞亚群无关：对si-NC与si-PDRG1细胞中22个LM22免疫细胞标志基因集进行单样本GSEA显示整体谱型基本不变，六样本间评分相当，仅静息记忆CD4
+ T细胞特征在组间存在差异（P=0.019），其余21个特征不变。在TCGA HNSC队列中，PDRG1表达与T细胞标志物CD8B（P=0.3090）、B细胞标志物CD19（P=0.3010）、巨噬细胞标志物CD68（P=0.7010）或检查点基因PD-1/PDCD1（P=0.0973）均无相关性。对56例同队列患者外周血单个核细胞进行流式细胞术分析，按TCs-Center、TCs-Front、FLCs和TILs中PDRG1免疫组织化学评分分为高、低组，在全部40项比较（4区间×5群体×2指标）中，任何外周淋巴细胞亚群的比例或绝对计数在PDRG1高、低组间均无差异。肿瘤或间质区间PDRG1表达因此与循环免疫细胞组成无关。
肿瘤细胞高PDRG1预测OSCC不良结局：Kaplan-Meier分析显示肿瘤细胞中高PDRG1在肿瘤中心与侵袭前沿均与较短的总生存期（OS）、无转移生存期（MFS）和无病生存期（DFS）相关。TCs-Center的P值分别为0.0001、0.0300和0.0008，TCs-Front分别为<0.0001、0.0199和0.0002。按FLCs或TILs中PDRG1分层未见显著生存差异。单因素Cox回归中，TCs-Center和TCs-Front高PDRG1与OS和DFS风险增加相关，效应量与晚期TNM分期及淋巴结转移相当；FLCs和TILs中PDRG1无显著预后价值。多因素Cox回归纳入TNM分期、淋巴结转移和PDRG1后，TNM分期仍与OS和DFS独立相关，淋巴结转移与OS独立相关；肿瘤细胞高PDRG1仍与风险增加相关但未达统计学显著性，TCs-Center的OS风险比为3.543（95% CI 0.934-13.439，P=0.063）。TCGA分析显示高PDRG1亦与食管腺癌（P=0.0052）、子宫体子宫内膜癌（P=0.0002）和肉瘤（P=0.0120）较短总生存期相关，提示PDRG1与不良结局的关联可能延伸至其他多种恶性肿瘤。
讨论部分总结：在OSCC中，PDRG1主要由肿瘤细胞表达，其丰度在病变内呈梯度分布，于肿瘤-间质界面达峰值。既往研究已确立PDRG1在多种癌中为生长促进因子，本研究明确了PDRG1在肿瘤内发挥作用的位置、在该位点维持的细胞过程及其区域分布的临床意义。PDRG1的表达与临床相关性均集中于侵袭前沿，前沿水平高于中心，且前沿PDRG1与TNM分期及转移关联更密切，提示PDRG1在局部侵袭与播散中发挥作用，并将其置于传统组织病理学分级和肿瘤出芽评估已认定为信息最丰富的肿瘤区域。PDRG1敲低抑制增殖、迁移与侵袭并耗竭细胞分裂与细胞周期基因集，与胃癌、结直肠癌和胶质母细胞瘤的报道一致。研究进一步发现侵袭表型由黏附与细胞骨架机制驱动。杂合上皮-间质细胞亦驻留于侵袭前沿，单细胞研究显示该边缘邻近癌相关成纤维细胞的恶性细胞上调ECM与黏附基因而不激活完整的经典EMT转录因子程序；小鼠皮肤与乳腺肿瘤体内研究已解析出沿同一轴的多个稳定中间状态，支持杂合上皮/间质状态为稳定、自我维持的表型而非短暂中间态的观点。本分析中Wnt通路基因与PDRG1正相关，而Notch、Hedgehog、PI3K/AKT、TGF-β和NF-κB通路基因相关性可忽略。PDRG1在食管癌和肝细胞癌中已被置于Wnt/β-catenin信号上游。此外，OSCC中肿瘤内在分子常重塑免疫微环境，例如IL-33/ST2信号驱动PD-L1表达和免疫逃逸，而PDRG1无此活性：敲低后22个LM22特征中21个不变，PDRG1在TCGA HNSC中与CD8B、CD19、CD68或PDCD1无相关，且40项外周淋巴细胞亚群比较中无一能区分PDRG1高表达与低表达患者。肿瘤细胞高PDRG1预测较短的总生存期、无转移生存期和无病生存期，单因素风险比与TNM分期和淋巴结转移相当，生存分离在侵袭前沿最大。既往研究亦报道了PDRG1的预后价值，本研究TCGA分析将该关联扩展至食管腺癌、子宫内膜癌和肉瘤。PDRG1并非独立于分期和淋巴结状态。研究结论部分翻译如下：PDRG1主要由肿瘤细胞表达并在OSCC侵袭前沿富集，侵袭前沿高PDRG1与不良预后相关，使其成为识别OSCC侵袭性肿瘤细胞群体的候选标志物及针对该群体治疗的潜在靶点。
