Erythrinin B通过靶向LasR受体抑制铜绿假单胞菌群体感应及生物膜形成的生物信息学证据

《Frontiers in Microbiology》：Inhibition of quorum sensing and biofilm in Pseudomonas aeruginosa by erythrinin B: Bioinformatic evidence for the LasR binding

　　

群体感应（QS）调控的毒力因子和生物膜形成是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）抗微生物耐药性的主要贡献因素。这凸显了开发能够干扰这些通路并减少此类感染的新型抗毒力策略的迫切需求。本研究旨在评估Erythrinin B对铜绿假单胞菌PAO1中QS调控的毒力因子和生物膜形成的抑制潜力。Erythrinin B以剂量依赖性方式显著抑制了绿脓菌素（72.27%）、pyoverdin（68.22%）、蛋白酶（83.08%）和弹性蛋白酶（62.16%）的产生，而对鼠李糖脂的抑制作用较弱（29.17%）。在300 μg/mL浓度下，生物膜生物量减少了73.02%，显微镜观察证实了粘附减少和浮游细胞分散。胞外多糖（EPS）和海藻酸盐水平也显著降低，表明生物膜基质完整性受到破坏。分子对接表明Erythrinin B与LasR受体结合（?11.7 kcal/mol），与Thr75、Tyr56、Tyr64和Ser129形成氢键，同时存在疏水作用和范德华接触。分子动力学（MD）模拟证实了复合物的稳定性，与脱辅基LasR相比仅发生微小构象变化。MM/GBSA分析显示有利的结合自由能（?26.89 ± 2.04 kcal/mol），以范德华相互作用为主，Val76、Trp88和Leu36有重要贡献。这些发现表明Erythrinin B是一种有效的QS抑制剂，能够减弱铜绿假单胞菌的毒力和生物膜形成。

本研究旨在评估天然异黄酮类化合物Erythrinin B对铜绿假单胞菌PAO1群体感应调控毒力因子及生物膜形成的抑制潜力，并结合分子对接与分子动力学模拟揭示其靶向LasR受体的分子机制。研究背景方面，抗微生物耐药性（AMR）已成为21世纪全球重大公共卫生问题，据估计2019年细菌AMR直接导致127万人死亡，间接关联约500万全球死亡病例，而新药研发管线的匮乏进一步加剧了这一危机。群体感应是细菌密度依赖性的细胞间通讯系统，在革兰阴性病原菌如铜绿假单胞菌中调控蛋白酶、弹性蛋白酶、绿脓菌素、鼠李糖脂和铁载体等毒力因子的产生，这些毒力因子不仅介导宿主组织损伤，还参与免疫逃逸和持续性感染。QS还调控运动性和生物膜形成，两者对细菌定植和播散至关重要。生物膜是包裹在自身产生的胞外聚合物基质中的有组织微生物群落，与约80%的人类感染相关，在铜绿假单胞菌中生物膜形成与EPS和海藻酸盐产生密切相关。Erythrinin B是从刺桐属植物中分离的异戊烯基化异黄酮，具有抗氧化、抗炎和抗菌等多种药理活性，且已有报道其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有抗菌活性，但尚无证据表明其能抑制QS调控性状。基于上述背景，研究人员提出Erythrinin B可通过干扰QS信号传导和生物膜形成来减弱铜绿假单胞菌毒力的假设。

在技术方法方面，研究人员采用铜绿假单胞菌PAO1菌株，通过TTC染料法测定Erythrinin B的最低抑菌浓度（MIC）为500 μg/mL，后续实验均在亚抑菌浓度（50–300 μg/mL）下进行。主要关键技术方法包括：通过氯仿提取-HCl萃取法测定绿脓菌素，荧光光谱法测定pyoverdin，偶氮酪蛋白降解法测定总蛋白酶活性，弹性蛋白酶刚果红（ECR）结合法测定弹性蛋白酶活性，地衣酚法测定鼠李糖脂，96孔微量滴定板结晶紫染色法测定生物膜生物量，光镜、扫描电镜（SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察生物膜形态，苯酚-硫酸法测定EPS，以及分子对接（AutoDock Vina）和200 ns分子动力学模拟（GROMACS 2018.1，amber99sb-ILDN力场）结合MM/GBSA结合自由能计算。

研究结果方面，绿脓菌素抑制实验表明，Erythrinin B在50、100、200和300 μg/mL浓度下分别使绿脓菌素降低17.91%、38.13%、61.11%和72.27%，呈剂量依赖性抑制。Pyoverdin抑制实验显示，200 μg/mL和300 μg/mL处理分别使pyoverdin降低55.84%和68.22%，溶剂对照DMSO无显著影响。蛋白酶和弹性蛋白酶抑制实验表明，总蛋白酶活性在50–300 μg/mL下分别降低26.12%、41.63%、66.17%和83.08%，弹性蛋白酶活性分别降低18.63%、35.04%、53.74%和62.16%。鼠李糖脂抑制实验发现，Erythrinin B对鼠李糖脂的抑制作用较弱，50和100 μg/mL时抑制不显著，200和300 μg/mL时分别降低21.84%和29.17%，提示其不直接靶向RhlR QS回路。生物膜抑制实验显示，Erythrinin B在50–300 μg/mL下使生物膜生物量分别降低16.20%、37.55%、56.12%和73.02%，光镜、SEM和CLSM均证实处理组生物膜结构松散、粘附减少、浮游细胞增多。EPS和海藻酸盐抑制实验表明，EPS在50–300 μg/mL下分别降低13.58%、29.10%、48.19%和63.25%，海藻酸盐分别降低12.23%、27.15%、44.32%和58.67%。分子对接实验显示，Erythrinin B与LasR的结合能为?11.7 kcal/mol，占据与天然自诱导物3-oxo-C12-HSL相同的结合位点，与Leu110、Ser129、Thr75和Thr93形成常规氢键，与Tyr56和Tyr64形成π-供体氢键，并通过π-π堆积（Trp88、Tyr64）、π-π T型（Phe101）、烷基（Val76、Leu40、Cys79、Leu125）等疏水作用稳定结合。分子动力学模拟实验表明，Erythrinin B与LasR复合物的RMSD为0.223 ± 0.038 nm，配体RMSD为0.114 ± 0.013 nm，复合物在200 ns内保持稳定；配体RMSF为0.091 ± 0.064 nm，与天然自诱导物相当；回转半径（Rg）为1.476 ± 0.006 nm，溶剂可及表面积（SASA）为89.59 ± 1.30 nm2；Ser129氢键占据率达65.0%；主成分分析（PCA）和自由能景观（FEL）显示Erythrinin B复合物具有单一能量最低点（50.16 ns），较天然自诱导物的三个能量最低点更为集中。MM/GBSA分析显示，Erythrinin B与LasR的结合自由能为?26.89 ± 2.04 kcal/mol，范德华相互作用（ΔEvdW = ?45.54 ± 1.59 kcal/mol）为主要驱动力，关键残基贡献依次为Val76（?2.353 kcal/mol）、Trp88（?1.740 kcal/mol）、Leu36（?1.683 kcal/mol）和Tyr56（?1.395 kcal/mol）。

讨论部分总结：研究人员系统讨论了Erythrinin B对铜绿假单胞菌QS调控毒力因子和生物膜的抑制作用及其分子机制。绿脓菌素作为关键的蓝绿色吩嗪类色素毒力决定因子，其抑制可减轻对宿主呼吸道上皮纤毛运动的损害和免疫蛋白表达的干扰。Pyoverdin作为荧光铁载体，其抑制可能损害细菌在铁限制宿主环境中的生长能力和免疫逃逸能力。蛋白酶和弹性蛋白酶（LasB）的剂量依赖性抑制表明Erythrinin B广泛减弱了铜绿假单胞菌的胞外蛋白水解能力。鼠李糖脂的较弱抑制提示Erythrinin B不直接靶向RhlR QS回路，但通过降低鼠李糖脂可利用性可能损害细菌的表面运动和生物膜发育。生物膜生物量的显著降低及显微镜观察证实的结构破坏表明Erythrinin B同时损害初始粘附和后续生物膜发育。EPS和海藻酸盐的减少进一步支持基质产生抑制是抗生物膜效应的重要 contributor。分子对接和MD模拟结果共同表明Erythrinin B通过与天然自诱导物竞争LasR结合位点，形成多种氢键、疏水接触和静电相互作用，从而减弱LasR激活和下游QS调控毒力基因的转录。MM/GBSA分析显示Erythrinin B的结合自由能虽低于天然自诱导物（?34.37 ± 1.98 kcal/mol），但其在LasR结合腔内的稳定占据及与关键残基的相互作用支持其作为竞争性抑制剂的潜力。研究结论翻译如下：本研究证明Erythrinin B有效减弱铜绿假单胞菌PAO1中QS调控的毒力和生物膜形成。Erythrinin B显著降低绿脓菌素、pyoverdin、蛋白酶、弹性蛋白酶、EPS和海藻酸盐的产生，同时适度抑制鼠李糖脂合成。生物膜生物量受到显著抑制，生物膜结构被破坏，显微镜观察予以证实。分子对接揭示Erythrinin B与LasR受体结合，与自诱导物识别关键残基形成氢键和疏水接触。MD模拟验证了LasR-Erythrinin B复合物的稳定性，与天然配体相比仅显示微小构象变化。这些发现表明Erythrinin B是一种有前景的天然QS抑制剂，能够损害铜绿假单胞菌的毒力和生物膜发育。需要针对更多高毒力菌株和临床分离株开展进一步研究以验证Erythrinin B的转化潜力。