《Frontiers in Oncology》：A single-cell transcriptomics-based prognostic model identifies TM4SF1 as a key promoter of malignant progression in lung adenocarcinoma
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背景：肺腺癌（LUAD）的瘤内异质性深刻影响肿瘤进展和免疫逃逸。然而，当前的预后模型在很大程度上未能以单细胞分辨率捕捉肿瘤微环境（TME）的复杂细胞动力学。方法：研究人员将单细胞RNA测序与批量转录组学整合，以推导细胞类型特异性特征。在多个独立队列中系统评估了
背景：肺腺癌（LUAD）的瘤内异质性深刻影响肿瘤进展和免疫逃逸。然而，当前的预后模型在很大程度上未能以单细胞分辨率捕捉肿瘤微环境（TME）的复杂细胞动力学。方法：研究人员将单细胞RNA测序与批量转录组学整合，以推导细胞类型特异性特征。在多个独立队列中系统评估了101种机器学习算法组合，以构建稳健的预后模型。全面评估了免疫景观、突变特征、细胞间通讯和免疫治疗反应性。所鉴定的核心基因跨膜4 L六家族成员1（TM4SF1）的生物学功能在体外进行了严格验证。结果：最优的StepCox[forward]-Ridge模型在五个队列中显示出强大的预后分层能力。低风险肿瘤表现出免疫炎症表型，提示对免疫检查点阻断的预测反应较好。相反，高风险肿瘤具有免疫抑制性TME，其细胞通讯过度活跃，由成纤维细胞和髓系细胞驱动。TM4SF1是该高风险特征中的关键驱动因子。沉默TM4SF1显著抑制LUAD细胞增殖、迁移和侵袭，并强烈诱导凋亡。敲低TM4SF1通过降低PD-L1、增加MHC-I以及减少CCL5分泌来逆转肿瘤免疫逃逸。结论：该单细胞引导的机器学习框架在LUAD中提供了强大的预后分层，并捕捉到与潜在免疫治疗反应性相关的免疫表型。TM4SF1作为与LUAD恶性进展和免疫相关表型相关的候选介质出现，值得进一步的机制和体内研究。这提示其可能是一个有用的治疗靶点。
研究背景方面，肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占80%~85%，而肺腺癌（LUAD）已成为NSCLC中最常见的亚型。尽管诊断技术和治疗方法不断改进，患者预后仍然较差，这很大程度上归因于LUAD的高度异质性以及肿瘤与免疫微环境之间复杂相互作用所导致的耐药性。此外，即使在同一TNM分期的患者中，临床结局也存在高度变异性，因此迫切需要更准确的预后分层工具。瘤内异质性（ITH）是指同一肿瘤内存在多个在基因组、表观遗传和表型水平上存在差异的亚克隆，目前越来越被认为是塑造肿瘤进展、免疫逃逸和治疗耐药的重要力量。现有基于细胞类型特异性基因表达的预后评估系统，其遗传特征主要来自TME组分如基质，而恶性细胞的内在特征提供的信息相对有限。传统预后评估主要关注TME组分或恶性细胞中的单一侧面，无法全面反映这种高度异质性肿瘤的演化复杂性或免疫景观。单细胞测序技术凭借其高分辨率能力，提供了TME中细胞动力学和相互作用的全面视图，使研究人员能够更好地解析LUAD的ITH。通过迭代优化算法，机器学习可以提升模型性能，已被广泛用于构建临床预后模型。研究人员旨在利用单细胞测序数据创建一个特征矩阵，分离LUAD TME中所有细胞类型的特征，测试101种特征选择和机器学习建模策略组合，开发并验证一个预后风险模型，并研究其与免疫特征的关联。在该模型指导下，TM4SF1被鉴定为驱动肿瘤血管生成、细胞增殖和迁移的关键因子，并可能参与免疫排斥，提示其可能成为改善LUAD治疗并使肿瘤对免疫治疗更敏感的靶点。
在关键技术方法方面，研究人员从TCGA下载了LUAD的转录组图谱、拷贝数变异、突变景观和临床信息作为基础训练数据，并从GEO获取了四个独立验证队列（GSE31210、GSE42127、GSE37745、GSE50081）以及GSE131907中15例LUAD样本的单细胞RNA测序数据。为评估RiskScore与免疫治疗结局的关联，使用了三个NSCLC数据集（GSE166449、GSE207422、GSE135222）和IMvigor210队列。采用Seurat 4.0进行scRNA-seq分析，通过FindAllMarkers鉴定各亚群标志物。对差异表达基因进行单变量Cox回归分析筛选与总生存期（OS）显著相关的候选基因。保留八个scRNA-seq细胞亚群各自前60个基因作为候选预后生物标志物，纳入包含10种机器学习技术的整合框架，以TCGA-LUAD和四个GEO队列的平均C-index对模型排序并选择最优模型。使用ESTIMATE算法计算免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分，并进行ssGSEA分析。通过CellChat推断细胞间通讯网络。从HPA获取免疫组化数据比较TM4SF1蛋白水平。通过Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术评估凋亡，采用ELISA定量CCL5浓度。
研究结果方面，第一，预后风险评估模型的构建与验证。研究人员利用已发表的LUAD scRNA-seq数据集GSE131907中选择的基因构建了包含LUAD TME多种细胞群体的特征矩阵，排除了正常邻近组织数据以确保细胞类型特征忠实反映肿瘤相关转录状态。通过仅选择每个亚群中log2FC最高的前60个标志物，确保了批量测序数据集中细胞亚群的均衡加权，最终 derived 的480个LUAD基因特征矩阵作为构建预后风险评估模型的基础。研究人员用TCGA数据开发模型并在四个独立GEO队列中验证，以所有五个队列的平均C-index指导算法选择。在评估所有101种算法组合后，发现整合StepCox（forward）和Ridge回归的模型获得最高平均C-index（0.652），被选为最终预后模型。该模型在每个队列中均能一致地对患者进行预后分层，评分越高结局越差。时间依赖ROC曲线显示TCGA-LUAD队列1年、3年和5年AUC分别为0.74、0.72和0.68，GSE42127为0.93、0.70和0.68，GSE31210为0.83、0.69和0.72，GSE50081为0.62、0.62和0.62，GSE37745为0.56、0.67和0.64。与常规临床标志物相比，RiskScore提供了稳健可靠的预后评估。KEGG和GO富集分析显示高风险组显著富集于细胞周期进程和细胞外基质组织相关通路，包括有丝分裂核分裂和DNA复制，提示活跃的基质重塑和更强的侵袭能力；低风险组则表现出抗肿瘤免疫应答的激活，包括适应性免疫如T/B细胞受体复合物和抗原结合的激活。基因组相关分析显示高风险组总体突变负荷更高，TP53（43%）、TTN（38%）和MUC16（35%）为最常见突变基因，突变谱以单核苷酸多态性（SNPs）为主，主要为错义突变，C>A颠换是最常见的单核苷酸变异（SNV）类型，与LUAD经典烟草暴露特征一致。
第二，风险评估模型预测免疫治疗反应的效能。研究人员使用ESTIMATE算法研究TME，发现低风险肿瘤具有更高的免疫评分和ESTIMATE评分以及更低的肿瘤纯度，提示免疫炎症型或热肿瘤表型。高风险组TMB更高，表明低风险患者更好的免疫治疗反应可能由TME重塑和免疫细胞招募驱动，而非仅由更高突变数量驱动。TIDE算法显示低风险组T细胞排斥和功能障碍评分更低，符合更少免疫逃逸和对免疫检查点抑制剂（ICIs）更高敏感性。TCIA衍生的免疫表型评分（IPS）分析显示低风险患者在所有四种CTLA-4和PD-1表达状态下IPS均显著更高。对三个独立NSCLC队列和一个非肺癌队列的分析显示，较低RiskScore倾向于与更好的免疫治疗结局相关，尽管关联强度因数据集而异。这些结果揭示该风险特征可能有助于分层更可能从免疫检查点阻断治疗中获益的患者。
第三，RiskScore对细胞相互作用和免疫微环境的影响。研究人员利用scRNA-seq数据分析高、低风险组的免疫浸润景观和细胞间通讯网络，发现低风险TME富含抗肿瘤免疫效应细胞（T、B和NK细胞），而高风险TME显示基质和髓系区室明显扩张，反映促纤维增生和免疫抑制转变。细胞间通讯分析显示高风险组推断的细胞间通讯更广泛，相互作用频率和强度更高。高风险组细胞显示放大的双向信号传导能力，成纤维细胞、髓系细胞和上皮细胞被鉴定为高风险TME的主要信号枢纽。该组显示与细胞外基质重塑和肿瘤侵袭相关的信号通路明显上调，如SPP1、IGFBP和PERIOSTIN。这些发现表明模型定义的高风险表型与增强的基质和髓系细胞串扰相关。
第四，敲低TM4SF1减轻肿瘤细胞的恶性表型。研究人员利用LUAD scRNA-seq数据映射了八个主要细胞谱系的表达谱，揭示TM4SF1的独特表达模式。虽然相当比例的特征基因主要表达于免疫区室如T淋巴细胞和髓系细胞，但TM4SF1主要表达于恶性细胞和内皮细胞。细胞类型分辨的相关性分析进一步表明，TM4SF1表达与RiskScore的关联在恶性细胞中比在内皮细胞中更强，且TM4SF1表达与RiskScore总体呈正相关。HPA数据库分析显示LUAD中TM4SF1表达显著高于癌旁非癌组织。RT-qPCR分析证实LUAD细胞系A549、H1975和H1299中TM4SF1转录水平相对正常支气管上皮细胞系BEAS-2B显著升高。选择表达最强的A549和H1299两株细胞系进行慢病毒递送TM4SF1靶向shRNA（sh-TM4SF1#1和#2）及非靶向对照（sh-NC）以实现稳定敲低。TM4SF1敲低减弱了上述两种细胞系的恶性特性，包括增殖、集落形成和侵袭。划痕实验进一步显示TM4SF1沉默后迁移显著受损。流式细胞术分析显示H1299和A549细胞系中TM4SF1耗竭后凋亡细胞数量可测量地增加。与流式细胞术结果一致，TM4SF1敲低上调了H1299和A549细胞中关键促凋亡调节因子BAX mRNA，进一步提示TM4SF1耗竭减弱LUAD细胞的抗凋亡表型。
第五，TM4SF1沉默通过影响免疫相关表型抑制LUAD。研究人员评估了TM4SF1对趋化因子产生的影响，RT-qPCR和ELISA结果显示TM4SF1敲低大幅减弱H1299和A549细胞系中CCL5的mRNA表达和蛋白分泌。肿瘤免疫原性主要取决于MHC-I介导的抗原呈递和PD-L1免疫检查点信号，直接影响CD8+ T细胞毒性。研究人员检测了TM4SF1沉默是否影响PD-L1和MHC-I表达，发现敲低TM4SF1降低PD-L1水平并升高MHC-I，与预期免疫调节效应一致。这些发现表明TM4SF1可能通过干扰PD-L1和MHC-I表达控制LUAD细胞的免疫相关特征，从而削弱肿瘤免疫原性。
讨论部分总结如下：LUAD日益被认为是高度复杂的多细胞生态系统，TNM分期仍是评估肿瘤进展的核心，但其侧重解剖学而忽视瘤内异质性，同一临床分期患者常显示截然不同的生存结局，迫切需要超越标准组织病理学的分层工具。ITH对肿瘤行为和治疗反应的影响取决于肿瘤微环境中不同细胞的协同方式，因此需要将癌细胞内在特征与周围组分的多样表型状态联系起来的综合方法。本研究利用scRNA-seq数据对LUAD样本中所有细胞类型的特征进行分类，通过提取恶性细胞和TME亚群中前60个差异表达基因，在最小化单一细胞类型偏倚的同时捕捉跨谱系异质性。研究人员系统评估了101种特征选择和建模策略组合，应用于包含480个基因的精炼特征矩阵。在所有测试配置中，StepCox[forward]与Ridge回归的配对在数据集中获得最高平均C-index，成为最优预测模型。最终模型的特征选择和系数估计仅在TCGA训练队列中进行，所得模型应用于四个GEO队列时未进行额外基因重选或系数重拟合。该模型有效将患者分为生存差异显著的高、低风险组，其预后效能和分层能力在四个独立GEO验证队列中展现出显著可重复性。scRNA-seq以单细胞分辨率解构了复杂TME生态系统，使疾病驱动基因能够精确映射到特定细胞亚群，同时批量RNA-seq转录组学赋予该多基因特征在大型真实世界队列中的临床可转化性。由于模型跨TCGA RNA-seq和GEO微阵列平台转移，队列间性能的一定衰减和异质性是预期的。研究流程中每个队列独立预处理，基因标识符在基因符号水平统一，仅保留共享基因，有意避免混合跨队列批次校正以避免信息泄漏。方法学上，本研究与Wang等人最近提出的结直肠癌ITRG模型相似，该模型同样利用ITH相关差异表达基因和几种常见算法生成列线图，其1年、3年和5年生存预测AUC分别为0.669、0.664和0.645，校正年龄、肿瘤分级和TNM分期后仍为独立预后因素。虽然跨癌种比较应谨慎解释，但本研究模型在TCGA-LUAD中实现了更高的1/3/5年AUC（0.74/0.72/0.68 vs. 0.669/0.664/0.645），并在GSE42127（0.93/0.70/0.68）和GSE31210（0.83/0.69/0.72）中显示出强外部性能。GSE50081（0.62/0.62/0.62）和GSE37745（0.56/0.67/0.64）中的性能较为温和但仍表明总体稳健性及队列间变异性。GSE42127中异常高的1年AUC应谨慎解释，因为当早期事件有限和/或删失不均匀时，时间依赖ROC估计可能不稳定。肿瘤细胞的关键特征是逃避免疫破坏和抵抗药物干预的能力。既往研究提示高TMB与更广泛的新抗原库和更强免疫原性相关，指向更好的ICIs反应。然而本研究结果显示一个令人困惑的情况：尽管TMB显著更高，高风险组ESTIMATE免疫评分更低而TIDE评分更高。由于ESTIMATE衍生的免疫评分主要反映批量转录组成分而非直接免疫功能，这些发现应解释为与免疫细胞代表性降低和炎症较少的TME背景一致，而非免疫冷状态的确定性证据。与此一致，多个独立真实世界免疫治疗队列和IPS分析显示低风险组更可能从免疫治疗中获益。一个合理解释是高风险组富含Treg的免疫沉默微环境，这种富含Treg的微环境可能使免疫应答即使在高新抗原负荷下也无法有效激活。为提供初步实验支持，研究人员检测了TM4SF1敲低后CCL5这一参与Treg和其他免疫抑制群体招募的趋化因子。总之，这些发现提示免疫治疗获益的主要决定因素不仅是基因组突变负荷，而是TME内免疫细胞的实际组成和激活状态。单细胞细胞间通讯分析为高风险组的免疫表型提供了关键机制见解，鉴定出高风险TME内一个过度活跃的双向通讯网络，主要由成纤维细胞、髓系细胞和上皮细胞协调。SPP1、IGFBP和PERIOSTIN等信号通路的显著上调驱动深刻的免疫抑制性肿瘤微环境，即促纤维增生和促纤维化微环境的建立。其中IGFBP-AKT1-SOD2轴激活可促进肿瘤细胞远处转移和迁移中存活，PERIOSTIN-ITGAV/ITGB5-PI3K/AKT/β-catenin信号轴诱导肿瘤细胞获得上皮-间质转化（EMT）表型并促进其增殖、迁移和侵袭。这种状态构建了密集的物理屏障阻碍效应CD8+ T细胞浸润。因此，高风险组中这些异常细胞相互作用驱动的内在TME重塑从根本上压倒了高TMB赋予的潜在免疫原性优势，决定了最终免疫表型。TM4SF1最初被指定为L6肿瘤相关抗原，与整合素、受体酪氨酸激酶和胶原结合，这些分子相互作用使该蛋白能够促进血管生成、增殖和迁移，凸显其对恶性肿瘤的贡献。本研究中TM4SF1被证明是预后特征中的关键基因，在单细胞水平富集于恶性和内皮细胞，其在两个区室中的表达均与RiskScore正相关，其中恶性细胞中观察到的关联更强。这一模式提示TM4SF1可能通过肿瘤细胞内部过程和内皮相关微环境重塑共同促进高风险LUAD的侵袭行为。与此一致，既往研究显示TM4SF1阳性癌症亚群（TPCS）相比其他癌细胞亚群表现出增强的增殖能力和转录及表型可塑性，通过上皮-间质转化驱动瘤内异质性产生，并表现出增强的化疗耐药和免疫逃逸，以低新抗原表达和对免疫检查点抑制剂抵抗为特征。既往多项研究将TM4SF1过表达与恶性行为联系起来，然而在HR+ HER2-乳腺癌中TM4SF1下调且过表达抑制细胞增殖，TM4SF1在LUAD中的作用仍知之甚少。本研究发现TM4SF1敲低显著损害H1299和A549细胞的增殖、集落形成、侵袭和迁移，同时通过流式细胞术和BAX mRNA增加促进凋亡，提示TM4SF1有助于维持LUAD细胞的抗凋亡表型。虽然既往研究报道TM4SF1在HR+HER2-乳腺癌中下调并作为肿瘤抑制因子，但本研究证明TM4SF1在LUAD中发挥致癌作用，这种功能不一致可能源于深刻的背景依赖性，包括细胞类型特异性、不同组织微环境和不同致癌驱动网络。此外需注意体外功能实验中细胞系多样性有限，本研究因H1299和A549内源性表达最高而选择其进行TM4SF1敲低，但两株细胞系均携带KRAS突变，缺乏在其他常见LUAD遗传背景如EGFR驱动（如H1975）、STK11、KEAP1或MET突变中的功能验证是本研究的局限性。除这些内在致癌特性外，本研究还表明TM4SF1作为LUAD潜在治疗靶点值得进一步研究。TM4SF1敲低后CCL5的mRNA表达和蛋白分泌均大幅降低，同时观察到PD-L1明显下调和MHC-I上调。肿瘤细胞中高TM4SF1表达可能与CCL5产生增加相关，既往研究将CCL5与免疫抑制群体如Treg、髓源性抑制细胞（MDSCs）和M2极化巨噬细胞的招募联系起来。此外，TM4SF1驱动的PD-L1升高和MHC-I降低直接削弱T细胞识别和杀伤能力，导致严重免疫功能障碍。值得注意的是，这些分子变化与TIDE算法标记高风险组的T细胞排斥和功能障碍特征高度吻合。本研究存在一些局限性：第一，单细胞队列规模有限且仅包含早期和晚期LUAD样本，可能限制研究发现对更广泛患者群体的适用性。第二，机器学习框架虽稳健但可能因转录组数据高维度而存在过拟合风险，尽管RiskScore模型在各队列中一致地对患者进行分层，但在GSE50081和GSE37745中绝对区分度适中。第三，本研究所有转录组数据均来自公共数据库，TM4SF1在真实世界患者中的预后和转化意义需要在前瞻性收集的多中心临床样本中进一步确认。此外，TM4SF1在LUAD进展中的作用迄今仅由初步体外实验支持，其体内功能仍知之甚少。未来研究将聚焦肿瘤细胞-免疫细胞共培养系统、正交细胞模型（如CRISPRi联合回补）和适当的体内模型，以进一步研究TM4SF1在LUAD进展和免疫逃逸中的机制作用。基于这些发现，未来研究应首先安排人源化动物模型的部署以研究TM4SF1的体内功能角色，从而更精确地评估肿瘤免疫微环境的动态景观；同时计划启动利用所提出的RiskScore对患者进行分层的前瞻性临床试验，这些努力对验证预后模型的临床价值和机制假设至关重要，最终促进新的个性化治疗策略的开发。
研究结论翻译：该单细胞引导的机器学习框架在LUAD中提供了强大的预后分层，并捕捉到与潜在免疫治疗反应性相关的免疫表型。TM4SF1作为与LUAD恶性进展和免疫相关表型相关的候选介质出现，值得进一步的机制和体内研究。这提示其可能是一个有用的治疗靶点。
