《Frontiers in Immunology》：Case Report: Genetic and functional analysis of a novel homozygous intronic CD46 variant in a patient with atypical hemolytic uremic syndrome
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非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）是一种由补体过度激活驱动的补体介导的血栓性微血管病。约半数aHUS患者可检测到补体相关基因的遗传学异常。CD46（膜辅因子蛋白，MCP）是因子I的跨膜辅因子，促进细胞表面C3b和C4b的失活。在与aHUS相关的CD46变异中
非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）是一种由补体过度激活驱动的补体介导的血栓性微血管病。约半数aHUS患者可检测到补体相关基因的遗传学异常。CD46（膜辅因子蛋白，MCP）是因子I的跨膜辅因子，促进细胞表面C3b和C4b的失活。在与aHUS相关的CD46变异中，内含子变异可导致异常剪接和细胞表面CD46缺失。然而，即使借助基于机器学习的算法，预测非经典剪接位点变异的致病性仍具有挑战性。本研究探讨了在一例aHUS患者中鉴定的新型内含子CD46变异的潜在致病性。一名27岁女性因COVID-19感染诱发复发性aHUS，接受依库珠单抗治疗。患者无aHUS家族史。经依库珠单抗和甲泼尼龙冲击治疗后，实验室检查改善，于住院第15天出院。遗传学分析揭示CD46基因纯合内含子变异c.287-5T>C。尽管计算机分析预测其致病可能性低，研究人员进一步对患者及其无症状杂合子母亲进行了CD46的遗传与表达分析。流式细胞术显示患者外周血单个核细胞表面CD46表达显著降低，而其杂合子母亲表达降低但仍可检测。RT-PCR证实患者转录本中外显子3跳跃，导致提前终止密码子。小基因剪接试验重现了外周血cDNA中观察到的相同外显子跳跃事件。这些发现表明，新型纯合CD46内含子变异c.287-5T>C（其致病性无法仅通过计算机预测确定）通过异常剪接和细胞表面CD46表达缺失导致aHUS。本研究强调了功能验证在解读补体介导疾病中非经典剪接位点变异中的关键作用。
非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）是一种以微血管病性溶血性贫血、血小板减少和急性肾损伤三联征为特征的血栓性微血管病，由补体系统过度激活介导。约50%的aHUS患者存在补体相关基因遗传学异常或抗补体因子H（CFH）自身抗体。CD46是一种表达于几乎所有人体细胞表面的跨膜蛋白（红细胞除外），作为因子I的辅因子促进C3b和C4b裂解，抑制宿主细胞表面补体激活。约5%–15%的aHUS患者携带CD46基因致病性变异。目前HGMD已注册90余种CD46致aHUS变异，包括错义、无义、剪接变异及缺失。内含子变异可导致异常剪接，但非经典剪接位点变异的致病性预测极具挑战性。
本研究报告一例携带新型纯合内含子CD46变异c.287-5T>C的复发性aHUS患者。该变异在HGMD、gnomAD和ClinVar中均未见报道。计算机预测工具SpliceAI接受位点丢失Δ评分为0.11（低于代表性截断值），Pangolin剪接丢失Δ评分为0.22（略高于常规阈值0.2），CADD-PHRED评分为7.934（提示致病可能性低）。由于患者为该罕见变异纯合子且反复发病，研究人员进一步开展了转录本和蛋白表达分析。
在关键技术方法方面，研究人员采集患者、其母亲及健康志愿者的外周血样本提取DNA和RNA，采用靶向外显子测序及Sanger测序进行遗传学分析；利用流式细胞术检测外周血单个核细胞（PBMCs）表面CD46蛋白表达；通过RT-PCR及Sanger测序进行转录本分析；并构建pSPL3B小基因载体转染HEK293T细胞进行小基因剪接试验。样本来源为和歌山医科大学附属机构及Kazusa DNA研究所合作队列。
研究结果如下：
Case presentation（病例介绍）：一名27岁女性因呕吐和腹泻就诊，有8年前需血浆置换的aHUS病史，无aHUS家族史。入院实验室检查示血红蛋白11.5 g/dL、血小板12×103/μL、血清肌酐3.48 mg/dL、LDH 2959 U/L、结合珠蛋白13 mg/dL，外周血涂片见裂红细胞，Coombs试验阴性，ADAMTS13活性正常，SARS-CoV-2抗原及PCR均阳性，排除产志贺毒素大肠杆菌感染。诊断为COVID-19感染诱发的复发性aHUS。经依库珠单抗（900 mg）及甲泼尼龙冲击治疗后实验室指标改善，第15天出院，随访2年余未复发，未需维持性依库珠单抗治疗。
Genetic testing and in silico prediction（遗传学检测与计算机预测）：靶向外显子测序鉴定CD46纯合内含子变异NM_002389.4:c.287-5T>C，Sanger测序证实患者为纯合子、母亲为杂合子。计算机预测显示该变异致病可能性较低，但鉴于患者为罕见变异纯合子且反复发病，研究人员进一步开展功能验证。
Cell-surface expression of CD46（CD46细胞表面表达）：流式细胞术显示患者PBMCs表面CD46表达几何平均荧光强度（gMFI）低于健康对照的2%，接近同型对照水平；杂合子母亲gMFI约为健康对照的40%。
Transcriptional analysis（转录本分析）：RT-PCR显示患者存在较短条带（276 bp），健康对照为较长条带（379 bp），母亲同时出现两条带。Sanger测序证实较短转录本缺失外显子3，外显子2直接连接外显子4，导致移码并在外显子4第4个密码子处引入提前终止密码子（p.Arg96Ilefs*4）。
Minigene splicing assay（小基因剪接试验）：将含变异型（c.287-5C）和参考型（c.287-5T）的CD46外显子3及侧翼内含子序列插入pSPL3B载体转染HEK293T细胞，RT-PCR显示变异型 construct 产生较短转录本，与空载体一致，Sanger测序证实其缺失外显子3，外显子A直接连接外显子B，证实该变异导致外显子3跳跃。
讨论部分总结：本研究通过基因组和cDNA测序、流式细胞术及小基因剪接试验证实c.287-5T>C变异通过异常剪接导致CD46蛋白合成减少和细胞表面表达降低，进而引起补体激活失调和aHUS发生。变异型 construct 中可见微弱正常大小条带，提示小部分转录本正确剪接，可能解释患者PBMCs荧光强度略高于同型对照。母亲PBMCs中CD46表达降至约40%，异常转录本较弱可能归因于无义介导的mRNA降解（NMD）。多数人类内含子（约99%）在剪接供体和接受位点具有高度保守的经典二核苷酸GT和AG，HGMD中16种CD46剪接变异中13种影响经典剪接位点二核苷酸，其余3种位于剪接供体区域。本变异位于剪接受体区域第5位，介于多嘧啶 tract 与经典剪接接受位点之间，其致剪接异常的分子机制尚不清楚。据研究人员所知，这是首例经实验证实导致aHUS异常剪接的位于经典二核苷酸之外的CD46剪接受体变异。临床上CD46相关aHUS以高复发率和相对良好的肾脏预后为特征，可能与CD46以外其他膜结合调节因子（如CD55、CD59）维持细胞表面补体调控有关。CD46变异携带者外显率低，先前报道c.286+2T>G外显率不足30%，提示aHUS发病与严重程度取决于残余CD46表达及其他调节因子所赋予的补体调控活性与额外补体激活触发因素之间的平衡。本家族中纯合子患者两次发病而杂合子母亲无症状，支持该假说。患者经两剂依库珠单抗治疗后溶血、肾功能和血小板减少均改善，未需维持治疗，但鉴于CD46相关aHUS易复发，需长期随访。
研究结论翻译：研究人员鉴定了一种新型纯合内含子CD46变异c.287-5T>C，该变异很可能在一例复发性aHUS患者中具有致病性。值得注意的是，当前计算机算法无法可靠预测这一非经典内含子改变的致病影响。
