《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Nitrogen-doped carbon dots for combating bacterial infections via synergistic membrane disruption and biofilm eradication
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氮掺杂碳点（N-CDs）已成为有前景的抗菌纳米材料。本研究针对日益严峻的细菌感染挑战，以D-山梨醇和L-赖氨酸为前驱体，通过一步水热法合成了一系列不同氮掺杂水平（0%–20%）的N-CDs。采用透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、傅里叶变换红外光
氮掺杂碳点（N-CDs）已成为有前景的抗菌纳米材料。本研究针对日益严峻的细菌感染挑战，以D-山梨醇和L-赖氨酸为前驱体，通过一步水热法合成了一系列不同氮掺杂水平（0%–20%）的N-CDs。采用透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、傅里叶变换红外光谱、紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱与荧光光谱、拉曼光谱、X射线光电子能谱（XPS）以及Zeta电位/粒径分析对所得样品进行表征。系统考察了氮掺杂对结构、光学、理化及抗菌性能的影响。15% N-CDs对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）表现出最优抗菌活性，抑制率分别为95.32% ± 1.41%和91.61% ± 1.36%，同时对正常哺乳动物细胞（HUVEC和HT-22）在高达700 μM浓度下表现出优异的生物相容性。机制研究表明，最优的15% N-CDs粘附于细菌表面，破坏细胞膜完整性，并抑制生物膜形成（分别高达81.1% ± 0.13%和76.94% ± 0.24%），扫描电子显微镜（SEM）、活/死染色和泄漏实验证实了这一点。总体而言，这些发现确立了N-CDs作为一种有前景的纳米平台，通过协同的膜损伤和生物膜抑制机制应对细菌感染，而不损害哺乳动物细胞活力。
细菌感染对全球公共卫生和经济稳定构成重大挑战。抗生素作为抗微生物治疗的主要临床手段，由于耐药菌株的不断出现而日益失去疗效。世界卫生组织已将抗微生物耐药性列为全球健康的十大威胁之一。2019年，约495万例死亡与耐药细菌感染相关，预测到2050年这一数字可能达到每年1000万。耐药性的发展速度远远超过新型抗生素的发现和开发。自2019年以来，美国FDA仅批准了少数几种新型抗菌药物，其中大多数涉及现有药物的修饰。在此背景下，开发新型抗菌策略已成为生物医学研究的迫切需求。纳米技术的出现为解决抗菌困境提供了新途径。作为零维碳纳米材料，碳点因其可调的光致发光特性、可定制的表面功能化、优异的光化学稳定性和良好的生物相容性而在抗菌领域展现出显著潜力。其抗菌作用通常涉及膜破坏和活性氧（ROS）生成。与传统半导体量子点相比，碳点通常不含金属、毒性低、生物相容性优越，更适合生物医学应用。值得注意的是，杂原子掺入已被证明是调控这些理化特性的有效方法。在杂原子中，氮引起了最广泛的研究兴趣。氮的引入不仅显著提高碳点的量子产率和发光性能，还有效调控其表面化学状态和电子结构。此外，N-CDs保留了原始碳点的理想特性，包括优异的水溶性、低毒性、满意的生物相容性和良好的组织渗透性，使其在生物分析检测、抗菌剂、生物成像和疾病治疗中具有应用前景。在此背景下，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌不仅是代表性的革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株，还引起具有临床和经济重要性的疾病。大肠杆菌是尿路感染、败血症和新生儿脑膜炎的主要原因，而金黄色葡萄球菌与皮肤和软组织感染、伤口感染、菌血症和植入物相关感染有关。两种病原体的生物膜形成能力进一步加剧了慢性和器械相关感染，凸显了需要结合膜破坏和生物膜抑制的制剂。尽管N-CDs在抗菌领域具有前景，但目前研究仍存在两大不足。第一，对N-CDs抗菌机制的理解大多局限于单一层面（如仅ROS检测或仅形态观察），缺乏对细菌形态变化、生物膜形成能力和细胞膜完整性等多指标的综合评估，导致对其作用特征的理解不完整。第二，N-CDs的结构特征（如表面官能团和氮掺杂类型）与上述抗菌效应之间的相关性仍不清楚；不同合成条件下获得的N-CDs活性差异的系统实验比较匮乏，阻碍了其性能的靶向优化。这两大不足共同阻碍了N-CDs抗菌应用的合理优化。为解决这些空白，研究人员通过一步水热法合成了一系列氮掺杂水平可控（0%–20%）的N-CDs，并系统评估了其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌和抗生物膜活性以及对哺乳动物细胞的生物相容性。目的是确定抗菌性能的最佳掺杂水平，阐明氮诱导的表面化学与生物活性之间的关系，从而为合理设计基于N-CD的抗菌平台提供实验依据。
研究人员开展的研究主要涉及以下关键技术方法：以D-山梨醇和L-赖氨酸为前驱体，通过一步水热法（180 °C，8 h）合成不同氮掺杂水平（0%–20%）的N-CDs；采用TEM、AFM、FTIR、UV-Vis、荧光光谱、拉曼光谱、XPS及Zeta电位/粒径分析进行结构、光学和理化表征；采用平板涂布法评估体外抗菌活性；通过SEM观察细菌形态、活/死染色（SYTO-9/PI）评估膜完整性、BCA法和LDH法检测蛋白与乳酸脱氢酶泄漏、结晶紫染色法评估生物膜抑制；采用CCK-8法和活/死染色（Calcein-AM/PI）评估对HUVEC和HT-22细胞的生物相容性。菌株来源为北京科灵生化科技研究院（金黄色葡萄球菌ZKCC152962、大肠杆菌ZKCC12120），细胞系购自武汉普瑞拉生物科技有限公司。
研究结果如下：
3.1 结构与组成分析：通过FTIR、UV-Vis、拉曼光谱和XPS表征，证实氮成功掺杂入碳骨架。N-CDs在1568 cm
-1处出现C=N伸缩振动峰，1336和3413 cm
-1处出现C–N和N–H伸缩振动；UV-Vis吸收峰从282.5 nm蓝移至约281 nm；拉曼ID/IG比从约0.76增至约0.98，表明氮掺杂引入大量结构缺陷和无序位点；XPS高分辨C1s、N1s和O1s谱证实C–C/C=C、C–O/C–N、C=O、N–C和N–H等化学键的存在。
3.2 形貌与分布分析：通过TEM和AFM观察，未掺杂CDs呈准球形，粒径分布1.5–8.5 nm，平均3.86 ± 1.30 nm；N-CDs粒径分布拓宽至1.0–11.0 nm，平均5.77 ± 2.65 nm，分散性显著改善，几乎无团聚。AFM显示N-CDs在基底上的分布面积和沉积密度显著增加，高度范围为1.5–12 nm。表明氮掺杂促进CDs横向生长并增强胶体稳定性。
3.3 水合粒径与Zeta电位分析：通过纳米粒径和Zeta电位分析仪测定不同氮掺杂水平（0%–20%）N-CDs的水合直径和表面电位。未掺杂CDs呈弱正Zeta电位；氮掺杂后Zeta电位由正转负，15% N掺杂时绝对值最大，表明胶体稳定性最优；水合直径随氮掺杂含量增加从约32.5 ± 0.53 nm（未掺杂）逐渐增至约70.2 ± 0.34 nm（20% N），与TEM和AFM观察一致。
3.4 光致发光特性：通过荧光发射光谱测定不同氮掺杂水平N-CDs在不同激发波长（350–390 nm）下的发光行为。未掺杂CDs在370 nm激发下发射峰约447 nm；氮掺杂后发射峰红移至约458 nm（20% N）；荧光强度随氮含量先增后减，10%掺杂时最大。15% N-CDs在350–390 nm激发下发射峰从约440 nm红移至约462 nm，370 nm激发时强度最大，具有典型的激发波长可调荧光特性。
3.5 抗菌活性与最优掺杂比：通过平板涂布法评估不同氮掺杂水平（0%–20%）N-CDs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性。未掺杂CDs抗菌效果较弱；随氮掺杂含量从0%增至15%，抗菌活性显著增强，15% N-CDs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落抑制率分别达约95.32% ± 1.41%和91.61% ± 1.36%，优于文献报道的铈掺杂碳点和火龙果衍生碳点，且无需光激活；20% N掺杂时抗菌活性有所下降。抗菌活性增强主要归因于氮掺杂增加功能基团增强N-CDs与细菌表面相互作用，以及粒径增大提供更大接触界面；20% N活性降低与颗粒聚集和胶体稳定性轻微下降有关。
3.6 抗菌机制阐明：
3.6.1 表面粘附与形态破坏：通过SEM和EDS观察15% N-CDs处理前后细菌形态和表面元素变化。未处理大肠杆菌呈短杆状、表面光滑完整，金黄色葡萄球菌呈球形、表面饱满呈葡萄串状簇集；15% N-CDs处理后大肠杆菌表面明显皱缩、凹陷和起皱，部分失去杆状形态，金黄色葡萄球菌表面粗糙化和局部变形。EDS检测到处理后两种细菌表面出现明显氮信号，直接证明N-CDs附着于细菌表面。
3.6.2 膜完整性丧失与细胞活力：通过活/死细菌染色试剂盒和荧光显微镜观察，未处理组两种细菌在绿色通道呈大量明亮绿色荧光，几乎无红色荧光；15% N-CDs处理后大量细菌呈强烈红色荧光，仅极少数呈绿色荧光，表明膜完整性严重受损、细胞基本死亡。通过BCA法和LDH试剂盒测定上清液中蛋白含量和LDH活性，BCA蛋白定量显示处理后两种细菌上清蛋白含量仅轻微增加，表明少量蛋白泄漏；LDH活性测定显示大肠杆菌处理组上清LDH活性较对照组显著增加，表明N-CDs严重破坏大肠杆菌细胞膜导致大量胞内LDH泄漏；金黄色葡萄球菌处理组上清LDH活性较对照组轻微下降，未检测到明显酶泄漏。表明N-CDs对大肠杆菌细胞膜具有更直接的破坏作用。
3.6.3 生物膜形成抑制：通过结晶紫染色法评估15% N-CDs对生物膜形成的影响。未处理组两种细菌呈深紫色染色，生物膜完整性为100%；15% N-CDs处理后染色显著变浅，大肠杆菌处理组生物膜完整性降至18.9% ± 0.13%，金黄色葡萄球菌降至23.06% ± 0.24%，生物膜抑制率分别高达81.1% ± 0.13%和76.94% ± 0.24%。抑制机制可能包括：氮掺杂引入的丰富极性功能基团增强N-CDs与细菌表面的化学相互作用，使其附着于细菌表面破坏细胞壁/膜完整性，削弱细菌初始粘附能力；膜完整性破坏干扰胞外聚合物分泌，有效阻断生物膜基质的后续构建和成熟。
3.7 对哺乳动物细胞的生物相容性：通过CCK-8法和活/死染色评估N-CDs对HUVEC和HT-22细胞的细胞毒性。在0–700 μM宽浓度范围内，所有N-CD配方（0%–20%掺杂）均未引起细胞活力相对于未处理对照的明显降低（p > 0.05，ns）；活/死荧光成像显示即使在最高测试浓度下绝大多数细胞呈绿色（活细胞）荧光，仅偶见红色（死细胞）。表明N-CDs特别是最优活性的15%配方具有优异生物相容性，对正常哺乳动物细胞保持宽治疗窗口。
讨论部分总结：本研究存在菌株面板窄（仅大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）、缺乏ROS定量、缺乏体内数据以及抗菌实验中缺乏阳性对照等局限性。未来工作应扩展至临床多重耐药分离株测试，定量胞内和胞外ROS以阐明氧化应激贡献，纳入标准抗生素作为阳性对照进行基准测试，并在动物感染模型中评估治疗疗效、生物分布和生物安全性。
研究结论翻译：本研究证明氮掺杂水平是碳点抗菌性能的关键决定因素，15% N-CDs配方通过同时破坏膜和根除生物膜实现最优协同活性。机制研究揭示了多靶点作用模式：表面粘附、膜破坏（在大肠杆菌中比金黄色葡萄球菌更显著）和抑制生物膜形成——共同解释了对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株的强效杀菌作用。重要的是，这种强效抗菌功效在不损害哺乳动物细胞活力的情况下实现，即使在相当高的浓度下也是如此，凸显了有利的选择性指数。研究结果不仅为合理设计N-CDs建立了构效关系框架，还将其定位为应对日益严重的细菌感染威胁的有前景且安全的纳米平台。
