《Genomics & Informatics》：Exploratory integrative machine learning analysis of miRNA datasets identifies a candidate miRNA signature for oral squamous cell carcinoma
编辑推荐：
背景：口腔鳞状细胞癌（OSCC）通常在晚期才被诊断，因此需要一种能以最小侵入性检测的OSCC生物标志物。尽管循环microRNA（miRNA）已显示出巨大的诊断前景，但与OSCC相关的公开可获得的循环miRNA数据集有限。目的：采用机器学习方法探索性整合公共组
背景：口腔鳞状细胞癌（OSCC）通常在晚期才被诊断，因此需要一种能以最小侵入性检测的OSCC生物标志物。尽管循环microRNA（miRNA）已显示出巨大的诊断前景，但与OSCC相关的公开可获得的循环miRNA数据集有限。目的：采用机器学习方法探索性整合公共组织miRNA数据集，以鉴定作为潜在OSCC生物标志物的候选miRNA。方法：从GEO和TCGA中整合多个包含肿瘤与对照样本的OSCC组织miRNA数据集进行生物标志物发现。在模型开发前排除仅含肿瘤样本的数据集。利用差异表达miRNA集合开发机器学习模型。评估了五种分类器，最佳模型通过应用于唯一公开可获得的独立循环血清miRNA数据集进行外部验证。该特征采用连续概率评分。模型解释采用SHAP（SHapley Additive exPlanations）进行。结果：鉴定出一个与OSCC相关的30个miRNA候选特征。在内部交叉验证中，该面板可将肿瘤与正常组织区分开（AUC 0.96）。逻辑回归模型具有最高的AUC，而XGBoost和SVM-RBF（径向基核支持向量机）具有略高的准确率，并在外部验证中给出AUC为0.67。留出组织水平的性能可变且较低（AUC 0.54–0.88），外部血清AUC中等（0.67）。所鉴定的面板包括已知的OSCC相关miRNA（miR-21、miR-146b-5p）以及若干研究较少的候选生物标志物，其功能尚待检验。结论：该研究表明，机器学习方法可应用于整合公共组织miRNA数据集，以鉴定OSCC中的循环miRNA生物标志物。这是一项探索性研究；该特征不应被视为经过验证的血清检测，而应被视为源自组织的候选面板，其向血清样本的可迁移性有限，在应用于诊断目的之前需要在更多、更大且独立的循环样本中验证。
研究背景方面，口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中最常见的组织病理学类型，约占全部口腔癌的90%，常累及舌、口底、颊黏膜、牙龈、硬腭、唇及磨牙后区，且常由白斑、红斑、口腔黏膜下纤维化等口腔潜在恶性疾患进展而来。GLOBOCAN 2020数据显示，全球唇癌与口腔癌新发病例约377,713例、死亡177,757例，南亚与东南亚国家疾病负担尤为突出，5年生存率不足50%，主要归因于晚期诊断与肿瘤诊疗服务有限。目前诊断方法对早期病变敏感性低、依赖检查者经验、取样量小且具侵入性，易导致诊断延迟。miRNA为约19–25个核苷酸的单链内源性非编码RNA，参与增殖、分化、凋亡与免疫调节等基本细胞功能，在肿瘤中可发挥癌基因（oncomiR，如miR-21抑制PTEN、PDCD4与TPM1）或抑癌基因（如let-7家族、miR-34）作用；循环miRNA因受细胞外囊泡保护或与RNA结合蛋白、脂蛋白结合而高度稳定，是OSCC非侵入性液体活检的候选标志物。然而OSCC循环miRNA公开数据集极少，多数单研究筛选样本量小、统计效能不足，难以跨队列可靠鉴定候选特征；GEO与TCGA等公共数据库结合miRBase统一命名，构成可整合的发现资源，但跨平台整合会引入非生物学变异，需批次校正与荟萃分析框架。机器学习已成为从高维分子数据中鉴定可重复分类器的关键工具，但分子分类器需独立队列外部验证，内部验证常高估性能。为此，研究人员以组织转录组数据作为发现队列、再在循环样本中检验所发现特征，整合多个GEO组织miRNA数据集与TCGA-HNSC口腔样本，系统比较五种监督机器学习算法，并在唯一公开可获得的独立循环血清数据集GSE113956中验证，旨在克服OSCC血液miRNA队列缺乏的长期困境，推动适用于资源有限环境的非侵入性诊断工具开发。
在技术方法上，研究采用回顾性设计，筛选GEO七个系列（GSE113956、GSE45238、GSE28100、GSE168227、GSE98463、GSE103931、GSE137865）及TCGA-HNSC口腔样本，其中GSE113956留作独立循环血清验证集，其余用于组织发现；仅含肿瘤样本的三个数据集（GSE45238、GSE103931、GSE137865）在建模前排除，最终用于差异表达、特征选择、模型训练与SHAP分析的组织数据集为GSE28100、GSE168227、GSE98463与TCGA-HNSC，共340例OSCC与59例对照。分析在Python中完成，使用GEOparse、pandas、NumPy、SciPy、statsmodels、scikit-learn、xgboost、SHAP等工具，随机种子固定为42；探针经平台注释与miRBase命名映射为标准miRNA标识，重复探针取中位数汇总，表达值作log2(x+1)转换，缺失值采用k近邻插补，各数据集内分别作分位数归一化，保留至少出现在两个独立数据集中的miRNA并比对至统一miRNA集合；未应用ComBat等跨数据集批次校正。差异表达采用双侧Mann–Whitney U检验，以Benjamini–Hochberg法计算错误发现率（FDR）；为避免数据泄漏，特征选择在重复分层五折交叉验证（重复10次）的每一折训练集中独立进行，测试top 5、10、15、20、30个miRNA；比较逻辑回归、线性支持向量机、径向基核支持向量机（SVM-RBF）、随机森林与XGBoost五种监督二分类器，均使用平衡类别权重。以准确率、精确率、敏感度、F1分数及平均受试者工作特征曲线下面积（ROC-AUC）报告性能，特征稳定性以交叉验证各折中被选次数衡量，并进行留一数据集验证；最佳组织模型在全部发现数据集上重训后于GSE113956外部验证，并用独立XGBoost模型的平均绝对SHAP值总结miRNA重要性。
研究结果方面，3.1数据集选择：按预设纳入排除标准筛选后，七个GEO数据集与TCGA-HNSC口腔样本符合条件；三个仅含肿瘤样本的数据集因无法无偏进行批次校正与监督训练而在建模前排除，仅含OSCC与对照的组织数据集用于后续分析，血清数据集仅用于独立外部验证。3.2数据集特征：纳入数据集样本量各异，均含OSCC与非癌对照样本。3.3数据预处理：全部数据集通过预处理流程，整合前按平台标准化miRNA标识、合并重复探针并作跨平台归一化，未行跨数据集批次校正，各数据集内分别归一化与质控后形成可用于下游统计与机器学习的单一表达矩阵。3.4探索性分析：按疾病状态着色的主成分分析（PCA）显示OSCC与对照样本间存在一定分离但亦有重叠，提示异质性；按数据集来源着色的PCA可见数据集特异性聚类，表明数据来源进一步贡献总体变异。3.5差异表达miRNA：发现若干在OSCC与对照组织间差异表达的miRNA，按校正FDR排序后保留top特征用于后续机器学习分析。3.6特征选择：不同特征面板大小的预测性能存在差异，选择平均ROC-AUC最高的30个miRNA面板用于模型开发。3.7机器学习模型比较：逻辑回归获得最高平均ROC-AUC（0.959），XGBoost与SVM-RBF准确率略高（分别为0.927与0.921，逻辑回归为0.906）。3.8稳定miRNA特征：以重复特征选择迭代中的选择计数与选择频率评估稳定性，被更频繁选择的miRNA被认为更稳健可重复，用于后续建模与最终候选面板构建。3.9留一数据集验证：每次留出一个完整组织数据集作为独立测试集，其余用于建模，各留出数据集性能差异较大（AUC范围0.54–0.88）；留出TCGA-HNSC时TCGA的AUC仍为0.81但敏感度降至0.15，与TCGA贡献340例OSCC中的285例（84%）及59例对照中的30例（51%）一致，提示样本排序在队列间部分延续而决策阈值未延续，故对分类器泛化性作谨慎解读并将此较大变异列为局限。3.10循环数据集外部验证：逻辑回归被确定为最佳组织模型并在独立循环血清miRNA数据集GSE113956中验证，外部AUC为0.67，判别性能中等，提示组织miRNA特征在循环区室中仅部分体现，不应视为已验证的血清标志物。3.11 SHAP分析：以平均绝对SHAP值量化各特征贡献，若干miRNA对模型预测的贡献持续高于其余特征。3.12最终候选miRNA面板：综合差异表达分析、特征稳定性、SHAP特征重要性与机器学习性能的证据，选取被这些互补分析共同检出的miRNA作为最终候选生物标志物，该面板尚待进一步验证研究，并非临床已验证的miRNA特征。
讨论部分指出，为填补OSCC循环miRNA生物标志物领域缺乏足够效能循环队列的长期难题，研究以规模更大的公共组织转录组数据为发现队列并在循环中检验所发现特征；整合多个GEO组织数据集与TCGA-HNSC头颈队列构建统一发现矩阵，鉴定出30个miRNA候选面板，比较五种监督分类器，逻辑回归表现最稳定，并在独立血清样本中获得0.67的外部AUC。研究以组织作发现，是因OSCC缺乏大型公开循环miRNA数据集，GSE113956作为唯一公开血清数据集被有意留作检验组织来源信号能否转化至血液的测试，0.67的外部AUC仅为部分延续，故该30个miRNA应视为有潜力在循环中被检出的组织来源候选标志物，而非已验证的血清检测，这一设计假设限制了该面板的即时诊断用途。组织-血清性能差距可能源于循环miRNA细胞来源差异、组织数据集与血清数据集 profiling 平台差异、血清队列样本量小（25例OSCC、15例对照）及归一化策略差异；直接检验可迁移性需同一患者的配对组织与血清。面板中miR-21为经典oncomiR，在OSCC组织、唾液与血清中持续上调，通过p53通路及PTEN、PDCD4等抑癌靶点促进增殖、抑制凋亡，其在循环队列中的频繁出现支持其纳入；miR-146b-5p亦与OSCC相关；面板还包含抑癌miRNA miR-99a与miR-100，其下调解除对PI3K/AKT/mTOR翻译轴的抑制并与侵袭性行为相关；miR-30家族部分成员及较少报道的miR-1251、miR-4705、miR-2681与病毒相关kshv-miR-K12-7，仅因发现队列足够大并在较新miRBase版本中获得可靠注释才被检出。研究未进行靶点预测或通路富集分析，因目标为构建并检验分类器而非刻画miRNA功能，靶点与通路分析及实验验证是必要的下一步。方法学上，信号分布于大量miRNA且贡献近似可加，惩罚线性模型优于灵活非线性学习器，可能因miRNA表达矩阵特征数百且相关、样本相对较少；研究有意采用经典机器学习而非深度学习，原因包括组织发现数据类别高度不平衡（59例对照对340例OSCC）、需小而可解释的面板并支持SHAP解释、线性模型已具竞争力。0.67的中等AUC亦因分类器在组织发现、血清验证的不同生物学与技术区室中评估，且内部交叉验证已知会高估真实性能；血清miRNA池受细胞外囊泡主动释放、凋亡与坏死细胞被动释放及Argonaute与脂蛋白结合影响，使其仅部分且有偏地反映肿瘤，加之平台、RNA提取方案与归一化策略的跨研究变异，即使设计良好的循环OSCC研究在队列间迁移时分类器性能亦会衰减；已有血清来源特征可在临床显影前检出复发OSCC，而本研究特征源自组织、向血清仅部分可迁移，说明组织来源与血清来源特征捕获重叠但不同的信号。研究优势包括发现矩阵来自多个公共数据库、规模与多样性超过任何单中心收集，降低过拟合单一群体或平台的风险；独立循环数据集外部验证直接回应分子分类器开发中的乐观报告问题；系统比较五种机器学习模型提供比单一算法更平衡的算法行为描述；SHAP解释通过分解各特征对模型输出的贡献提高透明度，使miRNA集合的个体贡献可追溯并与OSCC已知生物学背景交叉参照。局限性包括：组织矩阵数据集与循环血清miRNA数据集无重叠，外部验证AUC不高，提示该面板不能视为诊断性而应视为探索性与假设生成性；未作正式跨数据集批次校正，各数据集分别归一化后按共同miRNA合并，留一数据集验证AUC范围0.54–0.88为最保守的泛化估计；所纳入数据集仅含非癌或非异常样本，特征未在良性或癌前口腔病变样本中检验；多数公共数据集缺乏一致临床信息（分期、肿瘤部位、吸烟、年龄、性别），无法跨合并数据校正这些临床协变量；未进行靶点、通路或其他功能分析；GSE113956为目前所知唯一同时含OSCC病例与对照的公开血清或血浆miRNA数据集，样本量小（25例OSCC、15例对照）且采用基于杂交的平台，准确性不及逆转录定量PCR（RT-qPCR）或测序方法，故需在更大、前瞻性、独立的循环队列中以RT-qPCR或测序进一步验证。结论部分译为：这项探索性研究表明，一种整合计算方法——在多个公共GEO组织数据集与TCGA-HNSC口腔队列中开展发现，随后在独立循环血清队列中检验——可生成OSCC候选miRNA面板。研究鉴定出30个候选miRNA集合，包括miR-21、miR-146b-5p、miR-99a、miR-100、miR-195与miR-29c等已知OSCC相关分子，以及较少报道和较新注释的miRNA。组织来源miRNA特征向血液传递的诊断信号有限，逻辑回归模型在血清中获得合理的0.67外部AUC即为证明。这些发现具有假设生成性，需在更大、独立、前瞻性的循环样本队列（理想为配对组织与血清并同时采用RT-qPCR与测序）中评估该面板的任何诊断应用。
