基于多组学整合解析奶牛中性洗涤纤维消化率差异相关的瘤胃微生物与代谢特征

《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Multi-omics analysis reveals microbial and metabolic signatures associated with neutral detergent fiber digestibility in dairy cattle

　　

背景：瘤胃微生物组在奶牛纤维降解中发挥核心作用，然而驱动中性洗涤纤维（NDF）消化率变异的精确功能与代谢网络仍知之甚少。阐明这些微生物组-宿主互作对于提高饲草利用率、推进可持续奶业生产至关重要。结果：研究人员采用整合性宏基因组学-代谢组学方法，对表现出高与低NDF消化率表型的泌乳奶牛（每组n = 10）的瘤胃微生态进行了表征。宏基因组分析显示，高NDF消化率组（HI）中纤维分解类群（Prevotella sp.、Lachnospiraceae bacterium）及碳水化合物活性酶显著富集。此外，物种水平差异丰度检验表明，Methanobrevibacter spp.在低NDF消化率组（LO）中的丰度高于HI组，而在门或属水平未检测到古菌差异。功能与代谢组学分析表明，HI组奶牛中氨基酸降解功能更广泛地富集，主要挥发性脂肪酸（VFAs）浓度更高，这与整体瘤胃发酵活性更强相一致。此外，VFAs和微生物组成分别解释了NDF消化率变异的54.3%和43.0%。基于所选注释代谢物特征的探索性机器学习模型表现出中等判别性能，袋外准确率为77.19%。结论：研究结果表明，瘤胃微生物组成、氨基酸代谢及VFA产生的协同变化与奶牛NDF消化率的变异相关。这些结果为未来通过微生物组导向的营养或育种策略改善纤维利用率的研究提供了基础。

研究背景方面，反刍动物在全球粮食安全中具有重要地位，能够将不可食用的植物生物质转化为优质乳和肉供人类消费。然而，反刍动物生产的可持续性日益受到饲料高效供给与利用的制约。在乳用反刍动物中，纤维消化率受饲料特性、瘤胃发酵及宿主-微生物组互作共同塑造，其中瘤胃微生物组发挥核心作用。瘤胃作为一个特化的生物反应器，容纳由细菌、原虫和真菌组成的复杂微生物生态系统，协同降解纤维物质。近年来宏基因组学的进展显著拓展了对该过程的理解，揭示了微生物组内的功能特化。例如，Ruminococcus和Fibrobacter是瘤胃中经典的纤维素分解属，而半纤维素降解更常与Prevotella和Butyrivibrio等属相关。尽管厌氧真菌丰度较低，但通过分泌多种碳水化合物活性酶（CAZymes）包括糖苷水解酶（GH5、GH6、GH48）及组装纤维小体，对顽固木质纤维素的分解贡献不成比例。此外，宏基因组学使得从未培养类群中回收基因组成为可能，揭示了与奶牛纤维消化效率相关的大量新型CAZymes资源。尽管取得了这些进展，当前改善中性洗涤纤维（NDF）消化率的策略主要集中于外源性饲料添加剂，在很大程度上忽视了驱动动物个体间纤维利用差异的内在宿主-微生物代谢互作。近期研究表明，瘤胃纤维降解不仅依赖CAZymes的水解能力，还严重依赖微生物群内复杂的代谢交叉喂养。然而，这些微生态代谢网络如何协同调控宿主的纤维表型仍属未知。研究人员假设高NDF消化率表型并非仅由纤维分解细菌的丰度决定，而是由关键类群与宿主之间高效的能量和中间代谢物（特定VFAs和氨基酸前体）耦合网络所驱动。为验证这一假设，研究人员采用整合的宏基因组与代谢组学框架，表征了高与低NDF消化率表型奶牛的微生物与代谢特征。本研究旨在鉴定纤维降解所必需的关键类群和功能通路，并阐明将瘤胃微生物组与NDF消化率变异联系起来的调控网络。这些见解将为增强纤维利用和促进可持续反刍动物生产的靶向策略提供依据。

在研究方法上，关键技术方法包括：从中国甘肃某商业奶牛场采集131头健康多胎荷斯坦奶牛的样本，基于全群表观消化率测定结果，选取20头具有极端NDF消化率值的奶牛，回顾性分为高NDF消化率组（HI，62.26% ± 1.25%）和低NDF消化率组（LO，44.16% ± 2.07%），两组差异显著（P < 0.01）。所有奶牛饲养于同一圈舍并接受同一批次全混合日粮，采样集中在产后56–60天。通过食管导管采集瘤胃液，经四层纱布过滤后用于后续分析。主要技术方法包括：（1）宏基因组测序：使用Illumina NovaSeq平台进行配对末端测序，经质控、宿主DNA去除后，使用MEGAHIT组装、MetaGene预测开放阅读框、CD-HIT构建非冗余基因目录，基于NR数据库和KEGG数据库进行物种与功能注释，CAZy数据库注释碳水化合物活性酶；（2）代谢组学分析：采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）进行非靶向代谢组学分析，通过Progenesis QI软件进行峰检测与对齐，基于HMDB和Metlin数据库鉴定代谢物，使用OPLS-DA筛选差异代谢物；（3）瘤胃VFA浓度测定：使用Agilent 7890B-7000D气相色谱平台测定；（4）方差分解分析：采用线性混合模型量化各组学层对NDF消化率变异的解释比例；（5）随机森林分类模型：评估代谢物特征的判别性能；（6）Microbe-Metabolite Vectors（mmvec）建模微生物-代谢物共现概率。

研究结果方面，首先在养分表观消化率和VFA浓度方面，HI组NDF消化率（62.26% ± 1.25%）显著高于LO组（44.16% ± 2.07%）（P < 0.01）。HI组粗蛋白（CP）消化率（74.32% ± 0.78%）也高于LO组（67.21% ± 1.05%，P < 0.01）。在瘤胃发酵参数方面，乙酸（61.74 vs. 44.49 mmol/L）、丙酸（35.69 vs. 26.51 mmol/L）、丁酸（17.89 vs. 14.16 mmol/L）和异戊酸（1.80 vs. 1.45 mmol/L）在HI组均高于LO组（P < 0.05）。总VFA浓度在HI组也更高（120.42 vs. 89.60 mmol/L，P < 0.01），而NH3-N组间无显著差异（8.53 vs. 7.79 mmol/L，P = 0.17）。乙酸/丙酸比值组间相近（HI组1.73 vs. LO组1.68），表明HI组较高的VFA浓度反映的是整体发酵强度增强而非向丙酸为主的显著转变。此外，LO组瘤胃pH趋于更低（6.21 vs. 6.47，P = 0.09），但差异未达统计学显著。这些结果表明HI组瘤胃发酵的整体幅度更大而非向丙酸的特异性偏移。

在基于宏基因组学的瘤胃微生物组成方面，瘤胃宏基因组主要由细菌（92.66%）、病毒（3.82%）、古菌（2.83%）、真核生物（0.68%）和未分类（0.01%）组成。由于细菌占绝大多数，下游分类描述和功能解释主要集中于细菌部分，但古菌部分保留在分类数据集中并评估了组间相对丰度差异。微生物多样性的alpha和beta多样性指数在HI和LO组间均存在显著差异。主坐标分析（PCoA）表明组间清晰聚类，凸显了微生物群落结构的差异，并得到归一化随机性比率（NST）显著差异的支持。Alpha多样性也表现出显著差异，Shannon指数和Ace指数均确认了微生物丰富度的变化。优势细菌门包括Bacteroidota（45.12 ± 2.31）、Bacillota（38.75 ± 2.04）和Pseudomonadota（2.56 ± 0.01）。优势细菌属为Prevotella（25.95 ± 1.41）、未分类Lachnospiraceae（10.68 ± 1.44）、未分类Bacteroidales（7.79 ± 0.89）和未分类Clostridia（4.76 ± 0.44）。

在基于宏基因组学的细菌和古菌组间差异方面，门水平上，Spirochaetota在HI组中的丰度显著高于LO组（P = 0.01）。科水平上，Bacteroidaceae在HI组显著富集（P < 0.01）。种水平上，Bacteroidaceae_bacterium是HI组中显著增加的物种之一（P = 0.01）。共有49个细菌物种在两组间存在显著差异，其中16个物种在HI组富集，包括7个Prevotella相关类群、2个Bacteroidaceae相关类群、2个Succiniclasticum相关类群、1个Kiritimatiella相关类群、1个Treponema相关类群、1个Alphaproteobacteria相关类群、1个Paludibacteraceae相关类群和1个未分类类群（LDA > 2.0，P < 0.05）。相比之下，33个物种在LO组富集（LDA > 2.5，P < 0.05），表明LO表型也具有独特的微生物特征而非仅仅是HI相关类群的缺失。对于古菌，在门或属水平未检测到显著组间差异。在种水平上，正式差异丰度检验表明Methanobrevibacter spp.（主要为s. Methanobrevibacter boviskoreani、s. Methanobrevibacter oralis和s. Methanobrevibacter woesei）在LO组中的丰度显著高于HI组（LDA > 2，P < 0.05）。这一模式表明此处观察到的古菌差异是物种水平的组成性差异而非古菌部分在更高分类阶元上的广泛富集。基于出现频率，持久性（核心）物种在微生物群落中占主导地位。大多数数据点分布在中间频率区域，而核心和瞬态区域的物种数量相对较低。分布模式对中性模型拟合较差（R2 = 0.001264）。持久性（核心）物种的比例丰度和数量在LO和HI组中均显著高于瞬态和间歇类型。基于网络拓扑学鉴定了前10个结构关键物种（包括s_archaeon和s_Clostridiales_bacterium），其结构关键性指数（Ks）分布已展示。由于该分析是在群落网络水平而非组特异性差异网络比较水平进行的，这些类群被解释为整体群落结构的指示者而非HI/LO分化的直接驱动者。

在基于宏基因组学的瘤胃微生物功能方面，共鉴定出630个编码碳水化合物活性酶（CAZymes）的基因，分属于25个辅助活性（AAs）、81个碳水化合物结合模块（CBMs）、16个碳水化合物酯酶（CEs）、296个糖苷水解酶（GHs）、111个糖基转移酶（GTs）和101个多糖裂解酶（PLs）。其中，编码GT2的基因最为优势（9.20 ± 0.55），其次为GH2（5.80 ± 0.23）、GT4（4.67 ± 0.28）和GH3（1.82 ± 0.13）。比较鉴定的CAZymes，基于LEfSe分析共有15个家族水平酶在两组间存在显著差异。其中，8个家族水平酶（7个GH和1个CE）在HI组显著富集，而7个家族水平酶（1个GH、5个GT和1个CE）在LO组瘤胃中显著富集（LDA > 2.5，P < 0.05）。HI组富集的CAZyme家族包括GH2、GH3、GH106、GH31、GH92、GH29、GH43-29和CE8。在功能上，这些家族更符合果胶分解、脱支和寡糖导向活性而非经典的内切纤维素酶或木聚糖酶系统。相比之下，LO组以GT2、GT4、GH73、CE3、GT8、GT28和GT83的富集为特征，表明其功能谱中糖基转移酶相关活性占比更高。样本-物种关系Circos图揭示了HI和LO组之间不同的群落组成。不同门对家族水平CAZyme功能的贡献存在显著差异。具体而言，Bacteroidota对多个CAZyme家族（F1、F3、F5）贡献较大，而Bacillota和Actinobacteriota分别对其他功能（F2、F8）做出了实质性且独特的贡献。对于KEGG谱，共观察到641条内源性三级通路，归属于六个一级类别，包括代谢（66.38 ± 0.49）、细胞过程（12.93 ± 0.18）、环境信息（7.06 ± 0.07）、遗传信息（3.35 ± 0.01）和生物体系统（4.21 ± 0.16）。进一步鉴定了48条二级关键通路，包括全局与概览图（31.04 ± 0.25）、碳水化合物代谢（10.62 ± 0.10）、氨基酸代谢（7.08 ± 0.09）、聚糖生物合成与代谢（5.80 ± 0.03）、辅因子与维生素代谢（5.84 ± 0.06）和能量代谢（4.74 ± 0.05）。比较鉴定的KEGG通路，一级水平未观察到任何差异（P > 0.05），而氨基酸代谢在二级水平组间存在显著差异（P < 0.05）。三级水平氨基酸代谢差异分析显示，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路在两组间存在显著差异（P < 0.05）。此外，四个模块（M00373、M00741、M00376、M00960）（P < 0.05）和六条下游通路（K01915: glnA, GLUL, 谷氨酰胺合成酶；K00265: gltB, 谷氨酸合成酶（NADPH）大链；K00764: purF, PPAT, 酰胺磷酸核糖基转移酶；K15633: gpmI, 2,3-二磷酸甘油酸非依赖性磷酸甘油酸变位酶；K01847: MUT, 甲基丙二酰辅酶A变位酶；K01425: glsA, GLS, 谷氨酰胺酶）在HI组富集。差异分析提示若干氨基酸降解通路在功能上与中心碳代谢相关，包括谷氨酸代谢、丙氨酸和天冬氨酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解。这些通路水平的关联涉及丙酮酸、α-酮戊二酸和琥珀酰辅酶A相关反应等中间产物，可能反映HI组中与发酵过程相关的协调代谢功能。HI和LO组的整体群落结构与所测环境因子之间存在显著相关模式。具体而言，群落结构与某些关键环境因子（CP消化率、NDF消化率）呈显著正相关或负相关（Mantel's r，P < 0.05）。

在瘤胃代谢组谱差异方面，瘤胃内容物中共鉴定出434种代谢物，其中319种在人类代谢组数据库（HMDB）中注释。分类分析显示代谢组以"脂质和类脂分子"（22.88%）和"有机酸及其衍生物"（22.57%）为主，其次为"有机杂环化合物"（16.30%）、"苯环型化合物"（10.03%）和"苯丙素和聚酮类"（9.09%）。高（HI）和低（LO）NDF消化率组之间观察到清晰分离，所有样本均落在95% Hotelling's T2椭圆内。使用置换检验（n = 200）验证了模型的稳健性，确认观察到的分离具有统计学显著性且非过拟合所致（Q2 > 0.5，截距 < 0）。火山图可视化了全局差异代谢物模式，揭示了上调和下调特征的明显聚类。进一步选取了9个差异代谢物特征使用箱线图进行可视化。由于这些注释来自非靶向LC-MS且未经真实标准品验证，应将其解释为推定性代谢物赋值而非确认的生物标志物。尽管如此，这些所选特征说明了HI和LO组之间的清晰代谢差异，表明NDF消化率的差异伴随着瘤胃代谢谱的实质性重塑。差异代谢物在特定代谢通路中显著富集，主要包括氨基酸代谢（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成；组氨酸代谢）和辅因子与维生素代谢。与此一致，前30种差异代谢物的更广泛分类显示大多数属于氨基酸代谢（33.97%），其次为脂质代谢（11.32%）和辅因子/维生素代谢（11.32%）。差异代谢特征与特定功能集之间观察到显著关联，提示瘤胃代谢组与NDF消化率变异之间可能存在联系。

在多组学分析揭示微生物对瘤胃氨基酸生物合成的贡献方面，相当比例的注释代谢特征被MetOrigin分类为共代谢物或微生物群相关化合物。基于这些注释，通路富集分析提示氨基酸代谢的扰动，特别是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（KEGG map00290）和组氨酸代谢（KEGG map00340）。值得注意的是，这些生物合成相关特征在LO组中相对更为突出。这些结果应谨慎解释，因为代谢物注释未经真实标准品验证。整合分类、功能和代谢数据的Sankey图说明了注释细菌类群、所选功能基因和下游代谢物特征在支链氨基酸和组氨酸通路中的关联。由于许多优势类群在更精细分类水平上未解析，这些Sankey图应解释为通路水平关联模式而非直接的分类群-代谢物机制联系。经KEGG验证，K00016被鉴定为L-乳酸脱氢酶而非乙酰羟酸异构还原酶。K00016的相对丰度在LO组中显著高于HI组（P < 0.01），表明LO组中乳酸相关功能信号更强。一致地，组氨酸生物合成关键酶K00817的丰度在HI组中也显著低于LO组（P < 0.01），进一步表明LO表型保留了更强的氨基酸生物合成相关功能。一个特定的Clostridium类群与粪便L-组氨酸浓度呈强正相关（r > 0.8，P < 0.001）。这一发现暗示High组中该特定Clostridium成员的耗竭可能直接导致观察到的L-组氨酸水平降低，为基于微生物群的干预提供了潜在靶点。

在整合分析与NDF消化率预测建模方面，基于Spearman相关分析，不同的微生物和代谢特征与瘤胃VFA谱相关。若干微生物类群包括Bacteroidaceae bacterium、Bacteroidales bacterium、Clostridia bacterium、Oscillospiraceae bacterium、Ruminococcus sp.、未分类archaeon、Methanobrevibacter sp.、Mogibacterium sp.和Paludibacteraceae bacterium与瘤胃VFA呈正相关，而Hallella mizrahii、Prevotella bryantii、Prevotella lacticifex和Pseudomonadota bacterium呈负相关。这一模式提示纤维分解细菌和古菌的联合体与增强的发酵活性协同相关。瘤胃代谢物的平行分析鉴定了若干与瘤胃VFA正相关的代谢物，如Ala-Asp-Ile、AC-Pro-Gly-Pro-OH、(S)-[8]-姜辣素、甲硫氨酰-脯氨酸、H-Val-Val-OH和H-Val-Ile-OH，而Shanzhiside和4-甲基-5-噻唑乙醇呈负相关。这意味着蛋白质降解产物可能与驱动VFA产生的微生物代谢网络交织在一起。瘤胃发酵VFA谱占总组学解释变异的比例最大（54.3% ± 9.2% SE），凸显了其至关重要性。瘤胃微生物组成解释了组学解释变异的43.0%（± 8.7% SE）， highlighting其强大的直接和间接影响。相比之下，瘤胃代谢组单独仅占变异的2.7%，提示其主要作用可能通过其与微生物和发酵产物的互作来介导。进一步使用随机森林模型评估所选注释代谢物特征与NDF消化率的判别贡献。在训练集中，探索性模型在ROC分析中达到曲线下面积（AUC）为0.96。然而，袋外（OOB）错误率为0.2281，对应准确率为77.19%，10头HI奶牛中8头正确分类，10头LO奶牛中7头正确分类。这些结果表明所选代谢物特征具有初步判别价值，尽管样本量有限和非靶向代谢物注释的推定性性质需要谨慎解释。微生物群落分析揭示了NDF消化率组间不同的组成模式。HI组显示Clostridium sp.、Prevotella sp.、Fibrobacter sp.及相关生物体的丰度更高，而LO组显示其自身富集的谱系，包括Propionibacterium sp.、Acidipropionibacterium sp.、Thermoanaerobacter sp.和其他类群。因此，HI和LO组之间的对比反映了两种不同的微生物配置而非仅HI组中类群的单方面增加。网络分析鉴定了与两种表型相关的显著微生物-代谢物相关性，通过Spearman相关分析鉴定了5个显著互作对（FDR校正P < 0.1，|r| > 0.4）。

讨论部分总结：研究人员的宏基因组和代谢组学分析提供了超越单纯编目微生物组成的功能性见解，突出了导致奶牛不同NDF消化率表型的功能互作和代谢网络。通过将微生物分类和功能谱与代谢物变化及发酵指标联系起来，提供了一个整合框架以更好地理解与NDF消化率相关的微生物和代谢特征。一个关键发现是高低NDF消化率（HI）瘤胃微生物组中特定细菌类群的显著富集，包括Prevotella sp.、Bacteroidaceae_bacterium、Succiniclasticum sp.、Treponema sp.和特征不佳的Kiritimatiella属。由于若干优势类群在种水平未解析，数据更适合解释为群落水平的功能转变而非将主导机制作用归于任何单一命名的属。Treponema相关类群在HI组的富集也值得注意，该谱系成员常与瘤胃中碳水化合物活性和果胶分解功能相关，并已被报道与纤维附着微生物联合体相关联。这一生态角色在方向上与HI组中观察到的CE8和GH106富集一致，尽管液体相采样设计不允许将这些CAZyme功能直接归因于Treponema本身。在此背景下，Prevotella相关类群与未培养Bacteroidales和Bacteroidaceae相关生物、增加的氨基酸降解功能及改变的代谢物谱的共富集提示了一个与NDF消化率相关的更广泛的交叉喂养网络。在通路水平上，HI组富集的氨基酸降解信号与涉及丙酮酸、α-酮戊二酸和琥珀酰辅酶A相关步骤的反应相关联，这些是发酵代谢的中心节点。这些关联提示了与VFA产生相关的更广泛的群落水平代谢配置，但它们本身并不能确立氨基酸分解代谢与纤维消化之间的直接因果联系。本研究的一个关键方法学局限性是瘤胃样本通过食管导管采集，然后在DNA提取前经四层纱布过滤。因此，此处生成的宏基因组谱主要反映液体相瘤胃微生物群，可能低估了固体食糜部分中更丰富的颗粒附着纤维分解生物。这一采样特征可能部分解释了为何经典纤维附着类群如Fibrobacter未在差异类群中突出，以及为何HI组中观察到的CAZyme差异更符合果胶分解、脱支和寡糖导向功能而非经典纤维素分解系统。因此，结论应解释为描述主要与液体相瘤胃生态系统相关的微生物和功能特征而非整个瘤胃纤维附着群落。类似地，HI奶牛中Succiniclasticum的富集与该属作为利用琥珀酸产生丙酸的已知瘤胃细菌生理学一致。其富集因此更可能表明瘤胃群落其他成员产生的琥珀酸上游可用性增加，而非Succiniclasticum自身对日粮碳水化合物的直接发酵。这一解释支持HI组中与丙酸形成相关的定向交叉喂养关系。然而，由于乙酸、丙酸和总VFA均平行增加，数据支持整体发酵强度的差异而非向丙酸的特异性偏移。Kiritimatiella的富集——一个特征不佳的属，预测编码多糖降解酶但目前尚未从瘤胃中培养——提示其可能与较高NDF消化率相关的微生物特征有关。然而，其潜在作用是从功能注释推断而非直接实验证据，其特定互作需要未来分离和表征。在功能水平上，HI奶牛显示编码特定糖苷水解酶（GH2; GH3; GH106; GH31; GH92; GH29; GH43-29）和碳水化合物酯酶（CE8）的基因丰度增加，这可能有助于液体相瘤胃环境中的多糖加工。这些富集的家族并非代表经典纤维素分解系统，而更符合果胶分解、脱支和寡糖导向活性，包括加工部分降解植物聚糖的侧链和末端残基。这些功能差异因此可能表明HI组中可溶性或部分降解植物来源底物的利用增强，这可能反过来支持微生物发酵并有助于更高的VFA产生。研究人员还检查了Additional file 5中的经典内切纤维素酶和木聚糖酶相关家族。其中，GH5在HI组中显示更高的家族水平丰度，而GH9、GH48、GH10、GH11和CE1未显著富集。若干碳水化合物结合模块家族也在组间存在差异。然而，在本数据集中未鉴定到明确的dockerin或纤维小体相关家族注释。重要的是，LO组不应仅被解释为HI表型的缩减版本。相反，它显示了其自身协调的微生物和功能特征。与HI组相比，LO组显示Methanobrevibacter物种、若干糖基转移酶主导的CAZyme家族（GT2、GT4、GT8、GT28和GT83）的更大富集，以及K00016和K00817的更高丰度，表明LO组显示了独特的功能谱。然而，K00016的更高丰度应解释为乳酸相关信号而非增强支链氨基酸生物合成的直接证据。总之，这些模式提示LO瘤胃微生物组可能将更大比例的碳和还原当量导向微生物生物合成和产甲烷而非发酵性VFA输出，这为LO组较低的NDF消化率提供了补充解释。支链氨基酸代谢在KO水平的解释需要修正，因为KEGG验证显示K00016编码L-乳酸脱氢酶而非酮醇酸还原异构酶。因此不再将K00016解释为LO组增强支链氨基酸生物合成的证据。尽管通路富集提示缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢的差异，但本研究中KO水平数据不足以确定支链氨基酸通量的方向。相比之下，LO组中K00016的更高丰度指向乳酸相关功能信号，可能与较低NDF消化率表型相关。与此一致，LO组瘤胃pH趋于更低，尽管差异未达统计学显著（P = 0.09）。这一模式在方向上与更酸化的瘤胃环境可能不利于高效纤维降解的可能性一致。尽管HI奶牛表现出更高的NDF消化率和更高的总VFA浓度，但其Methanobrevibacter的种水平丰度更低。这一模式表明本数据集中纤维降解与产甲烷之间的关系不能仅由更大的底物周转来解释。产甲烷取决于氢产生与处置之间的平衡、替代电子汇的可用性、瘤胃pH、底物分配以及古菌群落组成。在本数据中，乙酸、丙酸和总VFA均平行增加，而乙酸/丙酸比值组间数值相近（HI组1.73 vs. LO组1.68），反对向丙酸作为主导替代氢汇的简单转变。此外，LO组瘤胃pH趋于更低，这在方向上与LO中纤维降解条件较差而非HI中pH驱动的产甲烷菌抑制相一致。而且，古菌差异在种水平检测到，LO组中若干Methanobrevibacter物种丰度更高，而在门或属水平未观察到差异。总之，这些观察提示本研究中的产甲烷菌信号更可能反映更广泛微生物-代谢网络内古菌群落组成的转变而非对纤维周转或VFA输出的简单直接响应。由于未直接测量氢通量和溶解气体池，产甲烷与替代氢汇之间的平衡应谨慎解释。通过分区总组学解释变异，研究人员发现VFA谱占比例最大（54.3%），这在生物学上验证了NDF消化率表型，因为VFA是纤维发酵的直接终端产物。相反，微生物组成贡献了43.0%的解释变异，揭示了上游驱动力。必须认识到这三个组学层在体内高度相关；因此，这些估计百分比代表它们对模型总解释力的相对独立贡献（总和为100%），而非绝对表型变异的互斥分区。代谢组较低的比例可解释性（2.7%）可能是因为许多小分子具有高渗透性、快速周转率或作为瞬态共代谢中间体而不像VFA那样稳定积累。这一量化强有力地支持了微生物酶活性（CAZymes）解构纤维、驱动中心发酵通路（KEGG模块）产生VFA、随后被宿主吸收和直接利用的模型。总之，多组学整合提示了一个与高NDF消化率相关的潜在连贯微生物-代谢网络。研究人员提出一个模型，其中富集的细菌联合体（Prevotella sp.、Succiniclasticum sp.等）和特征不佳的Kiritimatiella属可能通过特定CAZymes促进多糖加工。同时，HI组富集的氨基酸降解通路在通路水平上与中心碳代谢和琥珀酸-丙酸交叉喂养配置相关，尽管特定中间体和代谢通量仍需实验验证。这一更广泛的代谢配置与HI组更高的整体VFA输出相关而非向丙酸的特异性偏移。此外，观察到的代谢环境与较低的产甲烷菌丰度相关，尽管这一关系的因果基础需要进一步研究。重要的是，方差分解分析定量证明微生物过程和VFA输出在控制该表型中发挥主要作用。这些发现为开发靶向策略调控瘤胃微生物网络提供了基础，目标是增强纤维利用并可能减少奶牛生产中的甲烷排放。

结论部分翻译：总体而言，研究人员的发现部分支持了NDF消化率变异与协调的微生物和代谢功能相关而非与单一纤维分解类群的丰度相关的假设。具有较高NDF消化率的奶牛表现出较低的Methanobrevibacter种水平丰度以及更强的发酵相关功能。然而，由于乙酸、丙酸和总VFA平行增加且乙酸/丙酸比值组间相似，这一模式不应被解释为丙酸驱动的简单产甲烷抑制的证据。相反，它更可能反映古菌群落组成和氢处置网络的更广泛转变，需要直接验证。相比之下，LO表型与相对更高的Methanobrevibacter种水平丰度、糖基转移酶富集的CAZyme家族、更强的乳酸相关功能信号和更高的与组氨酸代谢相关的K00817丰度相关。这些对比特征表明HI和LO组代表两种与NDF消化率相关的不同瘤胃微生物-代谢配置。若干与Prevotella、Succiniclasticum、Treponema和其他未解析类群相关的细菌谱系在高NDF消化率（HI）奶牛中富集，并与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路相关。总体而言，组学可解释性分析揭示瘤胃微生物和瘤胃发酵VFA对NDF利用的贡献比瘤胃代谢组学更显著。然而，由于本研究基于过滤的液体相瘤胃样本，这些发现主要反映液体相关瘤胃微生物群，不应直接推广至颗粒附着纤维分解群落。这些微生物组相关模式为通过饲养管理或遗传选择修饰瘤胃微生物群以增强NDF利用的策略提供了有用见解。