止泻胶囊通过抑制PI3K/AKT信号通路减轻电离辐射诱导的肠损伤

《Journal of Molecular Histology》：ZhiXie capsule mitigates ionizing radiation-induced intestinal injury by inhibiting PI3K/AKT signaling pathway

　　

本研究旨在探讨止泻胶囊（Zhixie Capsule，ZXC）对电离辐射（ionizing radiation，IR）诱导的肠损伤（放射性肠炎，radiation enteritis，RE）的治疗作用，并阐明其潜在分子机制，重点关注PI3K/AKT信号通路。通过12 Gy腹部IR建立RE大鼠模型。ZXC每日给药，连续7天，通过监测体重、疾病活动指数（disease activity index，DAI）、结肠长度、组织病理学（H&E）及肠屏障完整性（阿尔新蓝染色、FITC-葡聚糖通透性实验及ZO-1和occludin免疫荧光）评价其效果。采用网络药理学预测关键通路。通过ELISA测定炎性细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10），通过Western blot分析通路蛋白表达（p-PI3K、p-AKT、p-IKKβ、p-p65）。使用PI3K激活剂YS49进行挽救实验以确认通路特异性。结果方面，ZXC剂量依赖性减轻RE表现，包括体重下降、结肠缩短和组织学损伤，并改善肠屏障完整性，表现为杯状细胞数量增加和紧密连接蛋白表达上调。网络药理学预测PI3K/AKT轴的潜在参与。机制上，ZXC抑制IR诱导的PI3K/AKT磷酸化及下游NF-κB激活，减少促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）并增加IL-10水平。这些保护作用被YS49部分逆转，提示ZXC通过抑制PI3K/AKT介导的炎症和改善黏膜屏障完整性减轻RE，突出其作为辐射缓解策略的潜力。

放射性肠炎（radiation enteritis，RE）是腹盆腔放疗最常见且最令人衰弱的并发症之一，在接受治疗的患者中发病率约为30%。临床表现通常包括腹泻、腹痛和便血。严重病例可能需要中断治疗，并可显著损害生活质量，部分患者甚至影响预后。尽管放疗投照技术有所进步，但有效的药物干预仍然有限，使RE成为优化放疗疗效的主要障碍。RE的发病机制是多因素的，涉及肠上皮细胞凋亡、炎症级联激活和黏膜屏障完整性破坏。在调控这些病理过程的信号网络中，PI3K/AKT轴已成为关键调控通路。在电离辐射（ionizing radiation，IR）诱导的肠道炎症和屏障功能障碍背景下，该通路的异常激活促进促炎细胞因子（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）分泌，并下调紧密连接蛋白如闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）和claudin-1，从而加剧屏障破坏。一致地，药理学抑制PI3K/AKT信号已在多种实验模型中被证明可减轻IR诱导的损伤，确立该通路作为RE的有前景的治疗靶点。中药（traditional Chinese medicine，TCM）复方具有多成分和多靶点特性，在管理IR诱导的肠损伤方面受到越来越多的关注。止泻胶囊（ZXC）是一种临床使用的中药制剂，由苍术（Atractylodes lancea）、岩陀（Rodgersia spp.）、草血竭（Polygonum paleaceum）和老鹳草（Geranium wilfordii）组成，在缓解IR诱导的腹泻方面显示出良好疗效。现代药理学研究已鉴定出若干可能贡献这些作用的生物活性成分。苍术中的苍术素、白术内酯I和多糖具有抗炎和调节肠道菌群的特性。岩陀中的岩白菜素抑制NF-κB激活并减轻肠道炎症。草血竭中的多酚发挥收敛和黏膜保护作用。此外，老鹳草中的黄酮类化合物通过抗炎和免疫调节机制提供胃肠道保护。然而，ZXC是否通过调节PI3K/AKT通路减轻IR诱导的肠损伤仍有待确定。本研究采用大鼠腹部照射模型评价ZXC对IR诱导肠损伤的保护作用，以复方谷氨酰胺肠溶胶囊（Compound Glutamine Enteric-Coated Capsules，CGECC）作为阳性对照。CGECC是L-谷氨酰胺和中药复方四君子汤的复合制剂。L-谷氨酰胺是肠上皮细胞的主要代谢燃料，草药成分调节肠道功能和黏膜免疫。临床上，CGECC已用于维持肠屏障完整性和减轻黏膜炎症损伤，使其成为评价ZXC屏障保护和抗炎作用的临床相关参考。此外，通过结合网络药理学、通路激动剂挽救实验、肠屏障功能分析和炎症信号检测，研究人员探索了PI3K/AKT信号通路在ZXC介导的针对IR诱导肠损伤保护中的作用。这些发现可能为ZXC的临床应用提供机制基础，并支持进一步开发针对RE的PI3K/AKT靶向策略。在方法上，研究人员开展了以下关键技术和实验方法：采用6–8周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（购自上海毕凯科仪生物科技有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2023-0009），通过VARIAN直线加速器（6 MV X射线，SSD 100 cm，剂量率200 cGy/min，铅屏蔽非靶组织）单次12 Gy腹部照射建立急性RE模型，成功建模以24 h内出现IR诱导肠损伤症状（排便频率增加、黏液便或血便）确认。实验分为两个队列：（1）剂量效应研究，大鼠随机分为6组（n=5）：对照（假照射，0.9%生理盐水）、IR模型、IR+CGECC（10 mg/10 g）及IR+ZXC低/中/高剂量（5、15、45 mg/10 g）组；（2）通路挽救研究，大鼠随机分为5组（n=8）：对照（假照射，0.9%生理盐水+5% DMSO）、IR模型、IR+ZXC-H（高剂量ZXC+5% DMSO）、IR+YS49（0.9%生理盐水+YS49，5 mg/kg，腹腔注射）及IR+ZXC-H+YS49组。所有处理每日一次，连续7天。ZXC和CGECC剂量由临床人用剂量按公式换算：大鼠剂量=人每日剂量×0.0026。末次给药24 h后腹腔注射戊巴比妥钠（200 mg/kg）处死大鼠并收集样本。研究人员通过每日监测一般状况、体重和DAI评分进行药效学研究；通过H&E和AB-PAS染色进行组织病理学检查；通过ELISA测定血清IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10水平；通过Western blot检测结肠组织中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、IKKβ、p-IKKβ、p65、p-p65和GAPDH蛋白表达（磷酸化蛋白信号以对应总蛋白信号归一化，再以对照组中位p/total比值归一化获得倍数变化）；通过FITC-葡聚糖通透性实验评价肠屏障功能；通过免疫荧光检测Villin、ZO-1和occludin表达；通过网络药理学（TCMSP数据库、Herb数据库、已发表UHPLC-QTOF-MS/MS数据、SwissTargetPrediction、GeneCards、OMIM、DisGeNET、jvenn、STRING、Cytoscape、SRplot平台）预测关键通路。所有数据以均值±标准误（SEM）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）继以Tukey事后检验进行多组比较，P<0.05为差异有统计学意义。研究结果如下：（1）ZXC减轻大鼠IR诱导的肠损伤。通过12 Gy X射线腹部照射建立急性RE大鼠模型并以假照射大鼠为健康对照，IR暴露引起进行性体重下降和DAI评分显著升高，ZXC中、高剂量显著减轻体重下降并抑制DAI异常升高；大体形态分析显示IR暴露大鼠肠道严重充血和水肿，ZXC高剂量基本保持宏观肠道完整性；IR诱导的结肠缩短被中、高剂量ZXC显著逆转，疗效与CGECC相当；H&E染色进一步证实ZXC剂量依赖性保持结肠黏膜完整性、减少炎症并恢复隐窝结构，高剂量ZXC保护效果与CGECC相当。（2）网络药理学预测ZXC抗IR诱导肠损伤的潜在机制。通过TCMSP数据库、Herb平台和已发表UHPLC-QTOF-MS/MS数据获得核心生物活性化合物，去重后得到286个独特预测靶点，与GeneCards、OMIM和DisGeNET的360个RE相关基因取交集鉴定出57个候选治疗靶点；PPI网络分析预测TP53、STAT3、AKT1、TNF、BCL2、IL6和JUN为枢纽调控因子；功能富集分析显示辐射反应和UV损伤相关过程为顶级GO生物学过程条目，TNF信号、PI3K-AKT和NF-κB通路为最显著富集的KEGG通路；AKT1为PPI网络中度数最高的枢纽之一，PI3K/AKT轴已被牵涉RE发病机制，该汇聚指引机制焦点转向该通路。这些发现提示ZXC可能通过调节PI3K/AKT信号通路在RE中发挥治疗作用。（3）ZXC减轻照射肠道炎症反应并抑制PI3K/AKT信号。IR暴露引起肠道强烈炎症特征，血清促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α显著升高，抗炎细胞因子IL-10显著降低；ZXC剂量依赖性减轻这种细胞因子失衡，部分恢复促炎/抗炎稳态，效果接近CGECC；IR触发结肠组织PI3K/AKT通路过度激活，表现为p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高，伴随下游NF-κB信号放大（p-IKKβ/IKKβ和p-p65/p65比值升高）；ZXC剂量响应性减弱通路激活，中、高剂量显著抑制PI3K/AKT磷酸化并削弱IKKβ/p65激活。（4）ZXC通过抑制PI3K/AKT通路减轻RE。为确定PI3K/AKT抑制是否为ZXC保护作用的必要条件，使用PI3K特异性激活剂YS49进行药理学挽救实验；ZXC-H单药治疗显著减轻疾病活动并防止进行性体重下降，而YS49共同给药大幅削弱这些保护作用，导致DAI评分部分回升和体重下降加剧；YS49显著削弱ZXC介导的结肠长度保持并部分减弱组织学保护，ZXC-H+YS49组结肠组织显示严重黏膜结构紊乱和密集炎症浸润，明显劣于ZXC单药组；这些发现提示PI3K/AKT信号是ZXC抗IR诱导肠损伤保护作用的关键介质，尽管其他通路也可能参与。（5）ZXC通过抑制PI3K/AKT通路保持肠屏障完整性。阿尔新蓝染色显示照射后杯状细胞显著耗竭，提示黏液层破坏；ZXC-H治疗显著增加杯状细胞密度，而YS49单独进一步加剧杯状细胞丢失，共同给药部分削弱ZXC介导的保护；血清FITC-葡聚糖分析显示IR诱导肠通透性增高，ZXC-H单药显著减轻，YS49共同给药部分拮抗该保护效果；免疫荧光分析显示IR诱导刷状缘标志物Villin及紧密连接蛋白ZO-1和occludin下调，ZXC-H单药显著增加三种蛋白表达，YS49共同给药通过降低ZO-1和occludin荧光强度部分削弱这些有益效果；这些发现表明ZXC至少部分通过抑制PI3K/AKT通路改善肠屏障完整性。（6）ZXC通过PI3K/AKT阻断抑制IR诱导的炎症信号。为探究ZXC是否通过PI3K/AKT抑制抑制IR诱导的炎症，检测血清细胞因子和结肠组织信号通路激活；IR触发明显促炎反应，血清IL-1β、IL-6和TNF-α升高，IL-10降低；ZXC-H单药显著减轻细胞因子失衡；YS49不仅单独加剧炎症，共同给药还部分逆转ZXC的抗炎作用，表现为促炎细胞因子升高和IL-10降低；Western blot进一步支持这些结果，IR诱导PI3K和AKT明显过度磷酸化及下游IKKβ和p65激活增强，ZXC-H单药显著抑制该信号级联，YS49共同给药部分减弱ZXC的抑制作用，导致p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-IKKβ/IKKβ和p-p65/p65比值高于ZXC-H组；这些数据表明ZXC部分通过抑制PI3K/AKT/NF-κB轴减轻IR诱导的炎症信号。讨论部分总结如下：本研究显示ZXC这种四味中药复方通过抑制PI3K/AKT信号通路部分保护免受IR诱导的肠损伤；通过整合网络药理学、药理学挽救实验和肠屏障功能评估，研究人员鉴定出ZXC抑制PI3K/AKT磷酸化从而减弱下游NF-κB介导的炎症并改善黏膜屏障完整性的潜在机制。PI3K/AKT信号通路是细胞存活、炎症和屏障功能对各种应激源（包括IR）反应的公认调节因子；越来越多的证据表明异常PI3K/AKT激活触发下游NF-κB信号并促进炎症损伤；药理学抑制该级联反复与天然产物的器官保护相关，如安肠 herbal formula、人参皂苷Rk1和白藜芦醇通过抑制PI3K/AKT激活改善IR诱导的肠损伤，金合欢素通过抑制氧化应激减轻组织病理学损伤和细胞死亡；与这些报道一致，研究人员观察到照射大鼠肠道PI3K/AKT/NF-κB通路强烈激活，ZXC通过抑制该激活发挥保护作用，PI3K激活剂YS49挽救实验支持PI3K/AKT的因果贡献。此外，ZXC改善肠屏障完整性，表现为FITC-葡聚糖通透性降低、杯状细胞丰度增加和紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达上调；ZXC抑制PI3K/AKT后组织水平上皮紧密连接完整性的改善可能通过间接的炎症依赖机制产生；通过抑制PI3K/AKT介导的NF-κB激活，ZXC减少促炎细胞因子产生（TNF-α、IL-1β和IL-6），这些细胞因子已知通过多种机制破坏紧密连接，包括肌球蛋白轻链激酶（myosin light-chain kinase，MLCK）依赖性环周肌动球蛋白环收缩、occludin和ZO-1内吞和降解增加、成孔蛋白claudin-2上调及促进上皮细胞凋亡；因此，减少炎症负担可能为紧密连接重新组装和杯状细胞恢复创造允许性微环境；此外，PI3K/AKT信号可能直接调节细胞骨架动力学和连接组装，但研究人员未检测RE中p-AKT与紧密连接蛋白的相互作用或共定位，组织水平相关性仍为推断性，未来需共定位研究阐明ZXC主要通过炎症依赖机制还是也通过直接上皮调节发挥作用。值得注意的是，ZXC的协同组成可能贡献其治疗效应；ZXC中四种组成草药各自已被报道具有抗炎、抗氧化和/或黏膜保护特性，但作为复方在IR诱导损伤中的联合效应此前未被研究；网络药理学分析预测ZXC中多种活性化合物，包括苍术中的汉黄芩素、老鹳草中的山奈酚和草血竭中的各种黄酮类，可能汇聚于PI3K/AKT/NF-κB轴的关键节点如AKT1、TNF和IL6；与预测一致，既往研究报道汉黄芩素可抑制巨噬细胞中LPS诱导的NF-κB激活，山奈酚通过调节PI3K/AKT通路抑制玉米赤霉烯酮诱导的氧化应激；这些发现提示ZXC成分可能协同抑制RE中PI3K/AKT磷酸化。除PI3K/AKT外，网络药理学预测其他几个枢纽靶点（如STAT3、JUN、BCL2和TP53）和通路（包括TNF和IL-17信号）也可能参与，它们可能与PI3K/AKT信号存在广泛串扰，其潜在贡献可能解释YS49仅部分逆转ZXC保护作用；该模式与中药复方多成分多靶点特性一致，其治疗疗效可能源于多种信号网络的联合调节而非单一通路抑制；然而，这些网络药理学发现是预测性而非实验性的，ZXC成分的直接结合靶点仍有待鉴定。值得注意的是，PI3K/AKT信号在辐射诱导损伤中的作用并非单向；若干研究报道该通路激活可促进细胞存活并减轻辐射诱导凋亡，提示在某些情境下（如低剂量辐射后肠干细胞）具有保护功能；这种明显差异可通过细胞类型特异性效应、通路激活的时间动力学及急性与慢性损伤设置来调和；在本研究中，研究人员观察到辐射暴露导致持续PI3K/AKT激活，伴随强烈炎症反应和屏障破坏，无代偿性上皮保护证据；该观察与过度或延长PI3K/AKT信号可能使平衡向病理性炎症倾斜的概念一致，尤其在肠道复杂多细胞环境中；研究人员发现ZXC通过抑制该通路发挥保护作用，提示在实验模型中PI3K/AKT激活的净贡献是促炎和屏障破坏性的，而非细胞保护性的；这强调信号通路功能情境依赖性解释的重要性，并突出开发靶向该通路治疗策略时需仔细考虑。尽管本研究提供ZXC抗RE保护作用的证据，但应承认若干局限性：单次12 Gy腹部照射模型主要再现急性RE，而临床腹盆腔放疗以分次剂量递送且常导致慢性进行性肠损伤，因此该模型可能无法完全捕捉临床放疗的长期病理特征和累积效应；未来需使用分次照射模型和慢性时间点研究以确定ZXC保护作用能否转化至临床环境；此外，尽管YS49挽救实验支持PI3K/AKT的因果贡献，其他通路和ZXC直接分子靶点仍有待充分表征；未来需化学生物学和通路特异性验证研究以鉴定这些靶点并阐明其各自贡献。研究结论部分翻译如下：总之，研究人员证明ZXC通过部分抑制PI3K/AKT信号通路减轻IR诱导的肠损伤；这些发现突出PI3K/AKT通路作为RE的有前景的治疗靶点，并提供支持ZXC临床转化的机制见解。