《Journal of Molecular Histology》：Mechanism of Tongqiao Huashuan decoction regulating neuroinflammation and its effect on intestinal flora in vascular dementia rats
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为探讨通窍化栓汤（THD）对血管性痴呆（VD）保护作用相关的分子变化，本研究聚焦于NF-κB相关的炎症反应，并观察其对肠道菌群的影响。采用液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF-MS/MS）鉴定THD成分。将Sprague-Dawley大鼠分为假手
为探讨通窍化栓汤（THD）对血管性痴呆（VD）保护作用相关的分子变化，本研究聚焦于NF-κB相关的炎症反应，并观察其对肠道菌群的影响。采用液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF-MS/MS）鉴定THD成分。将Sprague-Dawley大鼠分为假手术组、VD组、VD+TCM（THD）组和VD+多奈哌齐组。通过Morris水迷宫评估空间学习与记忆能力，透射电子显微镜（TEM）分析海马CA1区神经元超微结构，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测海马和血清中的白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2）和IL-6，免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹法（WB）检测沉默信息调节因子1（SIRT1）、NF-κB、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）和NOD样受体蛋白3（NLRP3）的表达，并通过16S rRNA测序分析粪便菌群。LC-Q-TOF-MS/MS在THD提取物中检测到998种化学成分，其中24种高信号强度成分被初步注释。与假手术组相比，VD大鼠逃避潜伏期延长、海马神经元损伤、促炎因子升高、caspase-1/NLRP3/NF-κB上调以及SIRT1/IκBα下调。THD治疗逆转了这些VD诱导的病理异常。此外，THD恢复了VD模型大鼠中观察到的肠道菌群失调。研究表明，THD可改善VD相关的认知功能障碍，伴随SIRT1/IκBα/NF-κB相关蛋白表达的改变和促炎细胞因子的减少，同时能够恢复VD大鼠紊乱的肠道菌群。因此，SIRT1/IκBα/NF-κB信号级联的变化与THD介导的保护性结局相关。
研究背景
血管性痴呆（Vascular Dementia, VD）是一种由脑血管损伤引起的进行性认知障碍疾病，在亚洲地区的患病率高达约30%，远高于西方国家。临床上现有的VD治疗方法仅能缓解症状，无法针对神经炎症和肠道菌群失调等核心病理机制，导致远期疗效不理想。因此，迫切需要探索能够同时调节神经炎症和肠道微生物紊乱的新型治疗候选药物。
VD的病理生理学与NF-κB通路驱动的神经炎症密切相关。慢性脑低灌注（Chronic Cerebral Hypoperfusion, CCH）可激活NF-κB信号，进一步升高包括IL-1β和TNF-α在内的促炎细胞因子水平，加重海马神经元损伤，从而导致认知功能下降。已有研究报道VD动物模型和患者中存在肠道菌群失调，如拟杆菌门（Bacteroidota）丰度降低和变形菌门（Proteobacteria）丰度增加。然而，目前仍缺乏能够同时靶向神经炎症和肠道微生物紊乱的有效VD治疗药物。
苗药通窍化栓汤（Tongqiao Huashuan Decoction, THD）是一个有前景的VD干预候选方剂，其配方包含红藤、三七、水蛭等药材，遵循中医“活血化瘀”的治疗原则。前期动物实验已证明THD可改善脑缺血再灌注损伤大鼠的认知表现。本研究的目的是从多维生物学角度探讨THD对VD的保护作用及其潜在分子机制。
研究方法与技术
研究人员采用液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF-MS/MS）对THD的化学成分进行表征；利用改良的四血管闭塞（4-VO）法建立SD大鼠VD模型，将大鼠随机分为假手术组、VD组、VD+TCM（THD）组和VD+多奈哌齐组，每组12只；通过Morris水迷宫评估空间学习与记忆能力；采用透射电子显微镜（TEM）观察海马CA1区神经元超微结构；运用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测海马组织和血清中的IL-1β、TNF-α、MIP-2和IL-6水平；通过免疫组织化学（IHC）和蛋白质印迹法（WB）检测SIRT1、IκBα、NF-κB、caspase-1和NLRP3蛋白表达；利用16S rRNA基因测序对大鼠粪便菌群进行分析。
研究结果
LC-Q-TOF-MS/MS成分鉴定
通过LC-Q-TOF-MS/MS在正负离子模式下共检测到THD提取物中的998种化学成分。以响应强度大于100,000为筛选标准，初步注释了24种高信号强度成分，包括四氢小檗碱、紫堇达明碱、异茴芹内酯、绿原酸、东莨菪苷、3-O-咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、奎宁酸、(-)-表儿茶素-3-O-没食子酸酯等。
THD对VD大鼠空间学习与记忆能力的影响
Morris水迷宫测试结果显示，与假手术组相比，VD组大鼠逃避潜伏期显著延长，穿越原平台次数和目标象限停留时间显著减少。THD或多奈哌齐治疗后，VD大鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数和目标象限停留时间显著增加，表明THD能显著改善VD大鼠的空间学习与记忆能力。
THD对VD大鼠海马神经元超微结构的影响
透射电镜观察显示，假手术组海马神经元核膜结构清晰，染色质分布均匀，胞质内含丰富细胞器。VD组出现明显的神经元病理改变，包括胞体收缩、形态不规则、内部结构紊乱、胞质含量减少、核糖体、线粒体和内质网数量显著减少。THD和多奈哌齐治疗可减轻这些病理超微结构改变。
THD对VD大鼠海马SIRT1、IκBα、NF-κB、caspase-1和NLRP3蛋白表达的影响
免疫组化和Western blot检测结果显示，与假手术组相比，VD组海马组织中SIRT1和IκBα蛋白表达下调，而NF-κB、caspase-1和NLRP3蛋白表达上调。THD显著提高了VD大鼠海马中SIRT1和IκBα的蛋白表达，同时抑制了NF-κB、caspase-1和NLRP3的表达。
THD对VD大鼠海马和血清中IL-1β、TNF-α、MIP-2、IL-6表达的影响
ELISA检测结果表明，与假手术组相比，VD大鼠海马组织和血清中IL-1β、TNF-α、MIP-2和IL-6水平均显著升高。THD和多奈哌齐均能有效降低VD大鼠中这些升高的促炎细胞因子水平。
THD对VD大鼠肠道菌群的影响
16S rRNA基因测序结果显示，各组间Chao1和Shannon指数无显著差异，但VD组的Simpson指数显著高于假手术组，表明模型组肠道微生物群落多样性降低。THD或多奈哌齐治疗显著降低了VD大鼠的Simpson指数。β多样性分析显示，基于Bray-Curtis、Jaccard和未加权UniFrac距离的PERMANOVA分析表明各组间微生物群落存在显著差异，但加权UniFrac距离未检测到组间差异，提示组间差异主要由低丰度类群驱动。
在门水平上，与假手术组相比，VD组厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）丰度降低，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）和梭杆菌门（Fusobacteria）丰度升高。THD和多奈哌齐治疗增加了拟杆菌门丰度，降低了变形菌门、放线菌门和梭杆菌门丰度。在属水平上，THD显著增加了Ligilactobacillus和未分类Muribaculaceae的丰度，降低了未分类厚壁菌门的丰度。
炎症标志物与肠道菌群α多样性的Spearman相关性分析
Spearman相关分析显示，在海马组织中，IL-1β与shannon（r=-0.48）、simpson（r=-0.47）和pielou_e（r=-0.43）呈显著负相关；MIP-2与shannon（r=-0.23）呈负相关。在血清中，IL-1β与simpson（r=-0.468）和pielou_e（r=-0.423）呈显著负相关。这表明THD诱导的肠道菌群多样性改善与IL-1β降低密切相关。
讨论与结论
讨论部分指出，血管性痴呆由慢性缺血再灌注损伤引起，目前临床缺乏特异性治疗药物。本研究采用的改良4-VO模型通过可逆性夹闭颈总动脉模拟慢性脑低灌注，更符合VD的临床特征。THD通过上调SIRT1和IκBα蛋白表达，抑制NF-κB、caspase-1和NLRP3蛋白表达，从而发挥抗炎和神经保护作用。同时，THD能够恢复VD大鼠的肠道菌群失调，提高菌群多样性，调节特定菌群丰度。Spearman相关分析进一步证实，THD诱导的肠道菌群多样性改善与神经炎症缓解密切相关。
研究结论：THD在VD大鼠中产生治疗相关效应。首先，THD抑制NF-κB蛋白表达水平，下调海马中促炎蛋白（NF-κB、caspase-1、NLRP3）的表达，降低海马组织和血清中炎症因子（IL-1β、TNF-α、MIP-2、IL-6）的水平。其次，THD改善海马CA1区神经元的形态和超微结构完整性，减轻VD诱导的神经元损伤。第三，THD上调海马中SIRT1和IκBα蛋白表达，进一步发挥抗炎和神经保护活性。此外，THD增加VD大鼠的肠道菌群多样性并部分调节微生物组成。综上所述，这些发现表明THD能够改善VD相关的病理改变和认知功能障碍，为THD治疗VD的进一步研究提供了实验证据。
