《Tissue Engineering and Regenerative Medicine》：Mesenchymal Stromal Cell-Derived Secretome for Diabetic Foot Ulcers: Therapeutic Potential, Challenges in Clinical Translation, and Future Directions
背景：糖尿病足溃疡（DFUs）是糖尿病最具挑战性的慢性并发症之一，约15%至25%的糖尿病患者在其一生中会发生该并发症，给全球医疗卫生系统带来沉重负担。即使采用协调的多学科创面管理策略，仍有相当比例溃疡无法及时愈合，使患者易发生继发感染、下肢截肢及死亡风险升高。间充质基质细胞（MSCs）因其修复能力长期被研究作为再生治疗选择；然而，活细胞治疗向常规实践的转化受限于移植后细胞活力有限、组织植入效率低下以及大规模细胞制造的实际困难。作为替代方案，研究关注点已转向MSC来源分泌组——一种包含细胞外囊泡、细胞因子、趋化因子、营养因子和microRNAs的复杂混合物——其似乎保留了母细胞的大部分再生与免疫调节活性，且不具备给予活细胞相关的缺陷。方法：本综述考察MSC分泌组的生物学组成及其与DFU修复相关的机制作用，特别关注局部应用策略。结果：来自临床前糖尿病创面模型的证据表明，分泌组治疗后可加速创面闭合、刺激新生血管形成、重塑细胞外基质并抑制持续性炎症活动。早期临床试验结果同样令人鼓舞，两项分别纳入10至110名参与者的有限研究中完全创面闭合率为62%至100%，结局因分泌组的细胞来源、递送途径及研究设计差异而不同。若干障碍仍限制临床采用：符合GMP（药品生产质量管理规范）的生产方案尚未在制造商之间实现统一；批次间存在差异；尚无经过验证的效价测定方法；长期安全性数据仍有限；适宜剂量问题尚未解决。展望未来，工程化或修饰性分泌组制剂、联合治疗及智能创面监测设备可能进一步改善结局。结论：当前证据支持MSC分泌组作为DFU管理的一种有前景的无细胞选择。其在标准临床诊疗中的地位将取决于大型多中心随机对照试验以及建立一致、标准化的生产规范。
1 引言
根据国际糖尿病联盟（IDF）《糖尿病地图》第11版的最新全球审计数据，糖尿病患病率的增长速度超过此前预期。全球疾病负担已增至5.89亿成人，长期预测被显著上调，预计到2050年将达到8.53亿人。此外，全球糖尿病相关支出预计每年将超过1万亿美元。降低不断上升的全球糖尿病与肥胖负担是2025年的关键公共卫生优先事项。在糖尿病相关并发症中，糖尿病足溃疡（DFUs）等慢性难愈性创面是致病率和医疗负担的主要贡献因素。DFUs是糖尿病最严重的并发症之一，常导致感染、下肢截肢和永久性残疾。约15%–25%的糖尿病患者一生中至少发生一次DFU，其中许多进展为慢性难愈性创面，与致病率和死亡率升高相关。这些慢性创面源于炎症反应失调、血管生成受损及糖尿病状态下生长因子活性降低。DFUs具有显著的经济影响，近三分之一的糖尿病相关医疗费用与糖尿病足问题的管理有关。尽管传统管理策略（包括创面清创、压力卸载、感染控制、全身抗生素以及生长因子或皮肤替代物治疗）取得进展，DFUs仍表现出高复发率且常无法实现完全愈合。负压创面治疗（NPWT）和生物工程皮肤替代物等先进方式已显著改善愈合过程，但仍受成本、可及性和临床反应问题制约。这些局限促使研究人员探索再生与细胞治疗方法。在再生方法中，细胞治疗尤其是间充质基质细胞（MSCs）因具有免疫调节、促血管生成和再生特性而备受关注。然而，肿瘤源性、免疫原性、复杂性及伦理问题伴随MSC治疗的转化，限制其临床应用。由于MSCs主要通过旁分泌分泌而非直接植入发挥修复作用，在不移植活细胞的情况下恢复创面部位生长因子和细胞因子信号已成为有吸引力的替代策略。创面愈合本身是一个受到严格调控的过程，涉及炎症期、增殖期和重塑期，其中VEGF、PDGF和FGF等生长因子（GFs）在血管生成、上皮再生及组织修复所需的细胞信号传导中发挥核心作用。在糖尿病状态下，这种生长因子活性显著降低，导致DFUs中观察到的愈合受损。这些局限使利用MSC来源旁分泌因子的无细胞再生策略日益受到关注。MSC分泌组指MSCs分泌的生物活性分子集合，包括细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞外囊泡和外泌体。这些旁分泌因子被认为通过促进细胞外基质重塑、血管生成以及增强成纤维细胞和角质形成细胞活性并抑制炎症来重现MSCs的治疗效果。与细胞方法相比，基于分泌组的治疗具有若干有益优势，包括非免疫原性、可规模化、易于储存和运输，且受较少伦理或法律限制。可采用预处理技术或生物工程增强或改变分泌组以获得最佳治疗结果。对于临床转化，需要适当的递送系统以在创面部位维持生物活性。局部应用MSC分泌组是一种靶向、非侵入性且有前景的慢性创面治疗途径，可制备为条件培养基、水凝胶或外泌体。在糖尿病临床前模型中，这些制剂的局部给药已被证明可改善新生血管形成和上皮组织再生、减少炎症细胞浸润并加速创面闭合。此外，早期临床研究表明，基于分泌组的治疗对慢性创面患者安全、耐受良好且可能有效。鉴于全球糖尿病负担不断上升和当前创面护理策略的局限，迫切需要创新有效的治疗方法。本综述考察MSC分泌组局部治疗DFU的现状及其未来治疗潜力，重点包括分子机制、临床前和临床证据、制剂技术、监管障碍和临床转化路径。图1展示了MSC分泌组通过局部递送介导DFU愈合的关键机制。
2 创面愈合生物学
创面愈合是一个受到严格调控、相互重叠的生物学过程，涉及信号分子、免疫细胞和ECM成分之间的协调相互作用。愈合过程可分为四个主要阶段：止血期、炎症期、增殖期和重塑期。止血期：受伤后机体立即开始形成血凝块以阻止失血。由于血小板黏附于暴露的胶原，凝血级联被启动并形成纤维蛋白凝块。此外，这些血小板释放FGF、TGF-β和PDGF等信号分子，启动成纤维细胞和免疫细胞的募集。炎症期：中性粒细胞首先被募集并介导微生物清除和碎片去除。单核细胞在创面微环境中分化为巨噬细胞。巨噬细胞通过吞噬作用及细胞因子/生长因子分泌调节炎症。为成功进入下一阶段，从促炎型向促修复型巨噬细胞表型的转变至关重要。增殖期：增殖期的特征是血管生成、成纤维细胞活化和再上皮化。成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，促进ECM沉积和创面收缩。VEGF和FGF促进内皮增殖和新生血管形成。同时，周围神经修复也开始。重塑期：重塑期涉及新形成组织的结构成熟。大量I型胶原取代增殖期最初沉积的III型胶原。MMPs尤其是MMP-9调节ECM降解和重塑。根据创面复杂性，此阶段可能持续数周至数月。在正常生理条件下，这些阶段受到严格调控并及时消退，从而实现成功的组织修复。
2.1 慢性创面与糖尿病足溃疡（DFUs）的挑战
慢性创面尤其是DFUs无法越过愈合的炎症期。DFUs是主要糖尿病并发症，与感染、截肢和创面不良愈合高风险相关。关键 contributing 因素包括：持续性炎症反应：以持续中性粒细胞活化和M1巨噬细胞优势为特征的持续性炎症导致组织损伤和愈合延迟。缺氧与缺血：血管生成和灌注受损导致组织缺氧，限制创面修复所需的氧可利用性。基质金属蛋白酶增加：MMP-9活性升高伴TIMP调节减少导致ECM和生长因子过度降解。细胞反应受损：在高血糖条件下，角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞的增殖、迁移和ECM合成减少。神经病变与压力性损伤：周围神经病变导致反复未被注意的创伤和压力性损伤，促进慢性创面形成。感染：多种微生物生物膜维持慢性感染、促进持续性炎症并降低宿主免疫清除。炎症消退失败，以从促炎型向修复型免疫表型转变受损为特征，促成了DFUs的慢性化。IL-1、TNF-α和IL-6等高水平促炎细胞因子强化了这一观点，表明创面微环境处于持续性炎症状态并伴有免疫细胞的持续募集和活化。巨噬细胞在此阶段主要显示促炎表型，而非转变为组织修复所需的抗炎表型。吞噬能力降低但仍释放有害酶的功障碍中性粒细胞加速了这一过程。最终，该过程导致MMP-9与TIMP-1比值功能障碍，其中高MMP-9水平破坏性降解组织和关键生长因子，从而阻碍创面愈合过程。除这些免疫学困难外，缺血和局部缺氧为组织愈合提供显著代谢障碍。血管化受损导致的氧缺乏显著降低成纤维细胞和内皮细胞的代谢需求。DFUs中发现的慢性缺氧微环境有害，因为其抑制内皮祖细胞动员并下调血管内皮生长因子（VEGF）表达，尽管短暂缺氧在急性创面中可作为启动血管生成相关信号通路的触发因素。这阻止了新血管的生成，而新血管生成是肉芽组织发育所必需的。涉及局部给予基质细胞来源因子的治疗方法有助于解决上述血管缺陷，这是使愈合恢复到正常阶段的关键治疗重点。这些缺陷过程各自代表MSC分泌组可能发挥纠正作用的独特位点。其组成性生长因子和细胞因子有助于在缺氧组织中恢复血管生成信号，其免疫调节货物有助于引导巨噬细胞远离持续促炎状态，其调节性microRNAs和酶有助于重新平衡MMP/TIMP活性以限制过度基质降解。这些效应的具体分子基础在第3节中详细讨论。
3 MSC分泌组：组成与生物学功能
间充质基质细胞（MSCs）已被证明通过其分泌组执行大部分治疗活动，分泌组是组织损伤激活后释放到其微环境中的一组因子和细胞外囊泡。MSCs已被证明通过Caplan提出的“损伤药房”概念发挥作用。在此，MSCs利用旁分泌方法而非分化来执行其愈合作用。这种无细胞治疗具有明显优势：消除致瘤风险、避免供受体免疫不匹配、允许产品标准化并简化储存和递送。MSC分泌组含有生物活性因子，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和细胞外囊泡（EVs），如外泌体和微囊泡。这些分泌产物是MSCs旁分泌效应的关键介质，影响再生、免疫调节和血管生成，而无需直接细胞植入。
3.1 分泌组组分
分泌组组分包括细胞因子和趋化因子。MSC分泌组包括多种抗炎介质，例如IL-10、IL-1RA、TGF-β和PGE2，可减少过度炎症反应。此外，CCL2（MCP-1）、CXCL12（SDF-1）和GM-CSF等趋化因子参与免疫细胞或祖细胞的募集，这对再生至关重要。生长因子：再生过程由多种生长因子介导，即血管内皮生长因子（用于血管生成）、肝细胞生长因子（用于上皮细胞增殖）、成纤维细胞生长因子-2（用于成纤维细胞活化）、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子-1和角质形成细胞生长因子。所有这些生长因子诱导血管化、再上皮化和细胞外基质形成。细胞外囊泡与外泌体：细胞外囊泡包括直径约30–150 nm的纳米级外泌体，在递送功能性货物（蛋白质、脂质、mRNAs和microRNAs）中发挥作用。这些囊泡介导一种远程信号形式，模拟活间充质基质细胞（MSCs）的信号传导，包括其免疫应答、血管生成和组织修复模式。酶与miRNAs：分泌组包括基质金属蛋白酶（如MMP-2和MMP-9）以帮助重塑受损ECM。外泌体microRNAs如miR-21、miR-126、miR-146a和miR-31调节受体细胞中的基因网络，促进血管生成、抑制纤维化并塑造免疫行为。表1总结了MSC分泌组中鉴定的主要生物活性成分及其在DFU愈合中的特定作用。尽管MSC分泌组包含多种生物活性分子，其组成受若干生物学和技术因素影响，包括供者特征、组织来源、培养条件、传代次数和预处理策略。这些变量可改变可溶性蛋白、细胞外囊泡和调节性microRNAs的相对丰度，导致生物活性和治疗潜力差异。因此，实施标准化生产方案和全面表征方法对于确保产品一致性、提高可重复性并促进未来临床转化至关重要。
3.2 旁分泌信号与免疫调节
MSC分泌组通过旁分泌机制发挥作用，而非通过细胞植入，而是通过影响局部细胞（如巨噬细胞、成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞）采取修复表型。MSC分泌因子（PGE2、TGF-β、IL-6和IDO）促进巨噬细胞向抗炎M2表型极化，减少T细胞增殖，阻碍树突状细胞活化并抑制NK细胞毒性。炎症预处理（例如暴露于IFN-γ、TNF-α）或缺氧可增强MSC分泌组效力，增加免疫调节细胞因子和促血管生成因子的分泌，并富集外泌体货物中的治疗性miRNAs如miR-146b、miR-223和miR-322。近期进展强调了MSC分泌组在创面愈合之外的广泛免疫调节和再生应用，通过涉及细胞因子调节、血管生成和细胞外基质重塑的机制扩展到若干炎症性疾病模型。
3.3 MSC分泌组在DFU治疗中的分子机制与治疗相关性
近期使用沃顿胶或骨髓MSCs的研究中的蛋白质组学和细胞因子谱分析强调了供者特异性变异，并鉴定了新分子，如α2-巨球蛋白、MCP-1、MIP-1β、RANTES、IL-1α/β、IL-6/8、GM-CSF、FGF-2、HGF和PDGF-AA。这些因子参与关键创面愈合过程，包括免疫调节、血管生成、细胞迁移和细胞外基质重塑。MCP-1、MIP-1β和RANTES等趋化因子调节免疫细胞募集并促进慢性炎症消退，而FGF-2、HGF和PDGF-AA等生长因子支持内皮细胞增殖、新生血管形成、成纤维细胞活化和组织再生。2023年一项临床转化研究表明，MSC条件培养基在体内和体外极化巨噬细胞，强调分泌组介导的免疫修复效应。PI3K/Akt/eNOS通路的激活增强内皮细胞增殖、迁移和一氧化氮产生，从而促进缺血性糖尿病创面中的新生血管形成。相反，抑制TLR4/NF-κB信号传导降低TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子的表达，有助于解决慢性DFUs特征的持续性炎症状态。总体而言，这些效应促进创面从炎症期向增殖期和重塑期转变。系统综述已证实，MSC分泌组通过增加多种动物模型和早期临床试验中的胶原沉积、真皮细胞迁移、再上皮化和新生血管形成来加速皮肤创面愈合。BM-MSC来源条件培养基的蛋白质组学和功能谱分析显示，其分泌组复杂，富含生长因子、细胞因子和ECM调节蛋白，支持其在皮肤再生和修复中的潜力，突出基于MSC分泌组的方法对糖尿病足溃疡的治疗潜力。重要的是，MSC分泌组的治疗效力源于多种再生通路的同时调节而非单一生物活性因子的作用，使其特别适合治疗DFU等多因素疾病。
4 用于分泌组收集的MSC来源
间充质基质细胞（MSCs）是多能基质细胞，能够产生统称为分泌组的生物活性因子，在组织再生、免疫调节和创面愈合中发挥关键作用。分泌组由细胞因子、趋化因子、生长因子和细胞外囊泡（EVs）组成，可受MSCs组织来源影响。以下综述用于MSC分离的各种组织来源及其与基于分泌组治疗应用的相关性。
4.1 骨髓来源MSCs（BM-MSCs）
骨髓是间充质基质细胞（BM-MSCs）最传统且研究最广泛的来源。BM-MSC分泌组富含血管生成和免疫调节因子，如VEGF、TGF-β、IL-6和HGF，在促进创面愈合尤其是缺血性和慢性创面中发挥关键作用。Sudha Balasubramanian及其同事的研究表明，骨髓来源间充质基质细胞（BM-MSCs）的分泌组不仅促进血管生成和成纤维细胞增殖，还增加再上皮化和胶原合成。这具有促进组织和创面愈合的潜力。此外，研究还表明BM-MSC分泌组在调节免疫应答、减少炎症和促进慢性创面愈合环境方面的重要性。临床和临床前研究均表明，BM-MSC分泌组具有增加血管分布和真皮厚度以及减小创面大小的潜力。
4.2 脂肪组织来源MSCs（AD-MSCs）
脂肪组织通过微创操作提供更高产量的MSCs。AD-MSC分泌组含有丰富的血管生成和抗炎分子，如IL-10、VEGF和瘦素。由于其再生特性，其在治疗慢性创面和糖尿病溃疡方面显示出前景。广泛研究表明，AD-MSC分泌组通过促进成纤维细胞增殖、细胞外基质重塑、再上皮化和免疫调节来促进慢性创面愈合和糖尿病溃疡修复。AD-MSCs分泌的神经营养因子也有助于神经再生，这在糖尿病创面恢复中至关重要。此外，研究表明AD-MSC分泌组可将创面微环境从促炎转变为抗炎，加速创面闭合并减少瘢痕形成。临床试验和临床前模型证实其作为难愈性创面（包括糖尿病足溃疡）有前景的无细胞治疗的有效性。
4.3 脐带来源MSCs（UC-MSCs）
UC-MSCs，包括来自沃顿胶和脐血的细胞，是低免疫原性和高增殖潜力的新生儿MSCs。这些MSCs的分泌组富含IGF-1、PDGF和bFGF等生长因子，有助于抗瘢痕和再上皮化效应。Li等近期综述阐明了脐带来源间充质基质细胞（UC-MSC）分泌组如何支持皮肤再生和年轻化。该分泌组是细胞因子、趋化因子、细胞外囊泡和携带microRNAs和蛋白质的外泌体的复杂混合物。这些组分共同刺激成纤维细胞增殖、角质形成细胞迁移、血管生成和细胞外基质重塑。这种联合活性加速受损组织愈合，还对抗皮肤老化的若干标志，促进胶原产生、减少炎症并限制纤维化。抗氧化活性和促炎细胞因子抑制进一步有助于创造有利于组织再生的环境。临床和临床前研究已证实UC-MSC分泌组加速创面愈合、增加真皮厚度并增强血管化。递送系统（如水凝胶）的最新进展扩展了其治疗潜力。作为无细胞选择，UC-MSC分泌组提供了传统细胞治疗的可行替代方案，具有更好的安全性和更低的免疫原性。
4.4 胎盘来源MSCs（P-MSCs）
胎盘来源间充质基质细胞（MSCs）具有非侵入性采集的优势，并显示出改善的免疫调节和抗炎潜力。这些细胞的分泌组包括白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1RA）等细胞因子和有助于组织修复的生长因子，尤其在炎症环境中。在了解P-MSCs生物学基础后，Meamar等开展了一项临床试验，比较人胎盘来源间充质基质细胞、明胶电纺纳米纤维支架和富血小板血浆（PRP）凝胶与传统方法管理糖尿病足溃疡的疗效，结果显示与单独传统管理方法相比，在溃疡愈合过程中具有显著疗效。明胶支架在溃疡管理中有效促进细胞黏附和增殖，而富血小板血浆凝胶有效提供必要生长因子，从而促进溃疡愈合过程。
4.5 牙髓来源MSCs（DP-MSCs）
牙髓来源间充质基质细胞（DP-MSCs）是一种可及且符合伦理的干细胞来源，具有强大再生潜力，使其成为创面愈合治疗（包括DFUs）的有吸引力选择。DP-MSCs具有丰富的分泌组，含有神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）等神经营养因子，在神经再生、血管生成和炎症调节中发挥重要作用，这些是创面愈合的关键方面。近期研究证实，DP-MSCs来源外泌体通过激活Cdc42/p38 MAPK信号通路促进血管生成来加速皮肤创面愈合。该通路的激活导致内皮细胞迁移增加和新血管形成，从而促进创面愈合。DP-MSC分泌组及其外泌体含量已显示出调节免疫反应、促进成纤维细胞增殖和重塑细胞外基质的潜力，这些在治疗DFUs等慢性创面中具有重要意义。DP-MSC分泌组和外泌体作为无细胞产品，为创面治疗中的细胞治疗提供了潜在替代方案，并在安全性、储存和靶向递送方面显示出优势。
4.6 月经血来源MSCs（MenSCs）
MenSCs是一种新型、非侵入性MSC来源，具有显著旁分泌活性和高增殖潜力。MenSCs通过分泌VEGF、TGF-β1和MMPs等促血管生成和抗凋亡物质参与子宫内膜和创面愈合。研究表明，MenSCs释放由不同蛋白质、脂质和microRNAs等可溶性化合物组成的EVs。这些已显示出促进成纤维细胞迁移和血管生成的有希望潜力。MenSCs已被证明在创面愈合中发挥重要作用，包括糖尿病足创面等慢性创面。由于细胞低免疫原性潜力，MenSCs在创面愈合方面具有很大潜力。这些细胞在再生医学和疾病诊断中具有重要意义，在诱导组织愈合方面显示出巨大潜力。
4.7 羊水来源MSCs（AF-MSCs）
AF-MSCs在羊膜穿刺过程中分离，其分泌组谱有利于胎儿组织修复。该条件培养基含有干性相关和抗炎细胞因子，如IL-6和IL-8。人羊水干细胞（AFSCs）已成为再生医学中有前景的细胞来源，特别是在创面愈合应用中。AFSCs由于其卓越的增殖能力和多向分化潜力而成为组织修复的优秀候选者。其庞大的分泌组富含生长因子、细胞因子和具有强旁分泌效应的细胞外囊泡，是其治疗成功的主要因素。这些分泌因子调节重要创面愈合过程，包括细胞外基质重塑、血管生成增强、成纤维细胞迁移刺激和炎症调节。在糖尿病足溃疡等慢性创面模型中，AFSC来源条件培养基已被证明可增加组织再生、加速创面闭合并改善新生血管形成。关键的是，使用AFSC分泌组作为无细胞治疗避免了细胞移植相关问题，如免疫排斥和致癌性，提供更安全有效的改善创面愈合的方法。
4.8 滑膜来源MSCs（SM-MSCs）
SM-MSCs主要用于骨关节炎研究，来源于关节滑膜衬里。其分泌组富含软骨修复介质，如GDF-5、IL-10和TIMP-1。分泌组的抗炎细胞因子IL-10对于降低DFUs中的慢性炎症和促进创面愈合至关重要。此外，MSC分泌组通常通过VEGF等生长因子促进血管生成和细胞增殖，这对DFU修复很重要，可改善组织再生。
4.9 子宫内膜来源MSCs（eMSCs）
eMSCs从子宫内膜组织收集，具有再生和血管生成能力，这在生殖和创面愈合背景下尤为重要。这些细胞的分泌组包括VEGF、HGF和IGF-1，共同促进血管生成、细胞增殖和组织再生。在创面愈合背景下，eMSC分泌组通过增强新血管形成和通过免疫调节及细胞外基质重塑创造有利微环境来加速恢复。这些特征使eMSC分泌组成为针对慢性创面（包括糖尿病足溃疡，其中血管生成和再生受损是主要挑战）治疗的有吸引力候选者。
4.10 诱导多能干细胞来源MSCs（iPSC-MSCs）
iPSCs可分化为MSC样细胞，实现自体MSC生产。其分泌组模拟天然MSCs，并具有基因编辑和患者特异性治疗的额外安全性。近期研究表明，iPSCs或iPSC-MSCs来源的细胞外囊泡（包括微囊泡和外泌体）通过增强角质形成细胞迁移、胶原合成和血管生成来促进创面愈合。例如，iPSC来源微囊泡通过miRNA介导的信号通路（如miR-16-5p激活p38/MAPK）加速烧伤创面中的创面闭合和再上皮化，从而促进角质形成细胞迁移。类似地，iPSC-MSC来源外泌体已被证明通过刺激胶原合成和新生血管形成来促进皮肤创面愈合。在糖尿病足溃疡（DFU）模型中，iPSC-MSCs已显示出通过调节炎症、通过增加VEGF表达促进血管生成以及将巨噬细胞极化为支持组织修复的M2表型来发挥治疗效应，从而导致更快的创面修复和减少的炎症。这些效应通过增强缺血性和慢性创面中的血管化和组织再生来帮助改善溃疡愈合。因此，iPSC-MSCs及其分泌组代表了DFU和创面愈合的有前景的细胞治疗，结合了自体细胞来源的优势与促进组织修复和免疫调节的有效旁分泌因子。
4.11 DFU治疗的比较优势、局限性和来源选择考虑
不同组织来源的间充质基质细胞（MSCs）表现出不同的生物学特征，影响其分泌组组成，并可能导致其在糖尿病创面愈合中的治疗潜力差异。脐带来源MSCs（UC-MSCs）表现出高增殖能力、低免疫原性和强大的促血管生成生长因子（如血管内皮生长因子（VEGF））分泌，这可能因其增强血管化和组织再生的潜力而在缺血性创面中具有优势。然而，其同种异体来源需要严格的供者筛查、可追溯性和监管监督。脂肪组织来源MSCs（AD-MSCs）易于获取并提供高细胞产量，而其分泌组表现出有效的抗炎和内皮保护特性，可能在高度炎症性创面中有益。然而，供者相关因素如年龄、肥胖和代谢紊乱可能影响分泌组组成和治疗一致性。骨髓来源MSCs（BM-MSCs）产生表征良好的分泌组，富含VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和抗炎细胞因子，支持新生血管形成、炎症调节和组织再生。尽管其具有有希望的再生潜力，包括BM-MSC条件培养基在高血糖条件下增强受损人脐静脉内皮细胞修复的能力，但骨髓采集仍然具有侵入性，且通常比脂肪组织来源产生更少的细胞。此外，供者特征、组织来源、培养条件和分泌组生产方案的变异继续对标准化和大规模临床转化构成挑战。总之，现有临床前证据表明，不同组织来源的MSC分泌组具有不同的生物学特征，可能影响其在不同病理条件下的再生性能。然而，当前证据主要来自独立实验研究而非直接比较研究。因此，尽管特定MSC来源可能基于其生物学特征提供理论优势，但在针对不同糖尿病足溃疡表型提出来源特异性建议之前，需要进一步的比较性临床前研究和 adequately powered 临床试验。不同组织来源MSCs的生物学特征和分泌组组成为其治疗潜力提供了基础，评估其在糖尿病创面愈合中的疗效需要在相关临床前模型中验证。以下部分总结支持MSC分泌组及基于分泌组制剂用于糖尿病创面愈合的现有临床前证据。
5 MSC分泌组的局部递送系统
在评估创面愈合治疗制剂的有效性时，释放速率是关键因素。与同时释放药物不同，控释和缓释的概念指治疗药物浓度在较长时间内维持的递送方法。缓释是药物在较长时间内的持续可用性，而控释是药物以速率控制的释放以获得最佳可用性。这在糖尿病足溃疡等慢性创面中尤其关键，其中血管生成、再上皮化、炎症调节和重塑等持续过程依赖于MSC分泌组产生的生长因子和EVs等生物活性剂的持续信号传导。
5.1 水凝胶
嵌入Pluronic F-127水凝胶中的脂肪来源MSC外泌体通过改善保留和保持生物活性显著加速创面修复和皮肤再生。该系统允许外泌体在创面部位持续释放，增强再上皮化、胶原沉积（I型和III型）和血管生成，并通过调节IL-6、TNF-α和免疫细胞浸润等重要标志物减少炎症。水凝胶的治疗优势超越其作为被动载体的作用。通过维持湿润创面环境并保护细胞外囊泡免受酶降解，水凝胶延长生物活性分子的局部可用性。缓释使血管生成、成纤维细胞增殖、角质形成细胞迁移和细胞外基质重塑等再生通路的持续激活成为可能，从而克服直接应用分泌组常见的快速清除。水凝胶的热敏性和生物相容性特征促进外泌体保留并最小化频繁给药的必要性，从而促进快速有效愈合。含有氧化透明质酸和Pluronic F-127各种制剂的此类系统已被证明在啮齿动物模型中有效促进慢性糖尿病创面愈合。这些复合水凝胶提供改善的机械强度和稳定性以及湿润创面环境。氧化透明质酸在可降解性和生物活性中发挥作用，从而促进愈合因子的持续释放。这导致糖尿病引起的慢性创面（慢愈合创面）中更快的创面闭合、血管生成、再上皮化和炎症调节。
5.2 纳米颗粒、脂质体和传递体
使用纳米颗粒或脂质囊泡（称为脂质体）可保护MSC分泌组产物免受降解。这些纳米颗粒保护生长因子、细胞因子和核酸免受细胞外分解。封装在纳米颗粒或脂质囊泡内增强分泌组组分的稳定性和生物利用度，同时通过内吞途径促进细胞摄取。这种改善的细胞内递送增加参与血管生成、炎症消退和组织再生的生长因子和EV相关microRNAs的生物活性。此外，在创面微环境中的延长保留允许持续刺激再生信号通路。这将使分泌组更容易进入皮肤并被细胞更好地吸收，这对血管生成和胶原形成等创面愈合过程很重要。使用水凝胶基质屏蔽封装的EVs将改善分泌组渗透和摄取，增强胶原合成和血管生成。这种缓释通过水凝胶基质实现，确保分泌组的生物活性在创面环境中延长，从而促进再生过程并促进组织愈合。这为细胞迁移和增殖提供了框架。关于传递体用于MSC分泌组给药的研究较少；然而，类似的脂质囊泡已被证明使用类似方法成功将外泌体递送到皮肤。这些柔性囊泡能够穿过角质层并允许外泌体货物更深递送以增强创面愈合。
5.3 生物工程支架和ECM基载体
模拟细胞外基质（ECM）的生物工程支架（如胶原、纤维蛋白和透明质酸）提供关键结构支持并使MSC分泌组货物在创面部位持续释放。这些支架模拟人体天然组织环境，帮助细胞黏附、生长甚至移动，从而促进组织修复。在机制上，ECM模拟支架提供生化和结构线索，促进整合素介导的细胞黏附和迁移。这些基质内分泌组来源生长因子的逐渐释放促进成纤维细胞活化、胶原沉积、血管生成和基质重塑，从而重建 closely 类似生理性创面愈合的微环境。综述文章表明，使用脱细胞细胞外基质组织与间充质基质细胞来源外泌体联合的协同效应促进体内组织修复并促进组织中新血管形成，这对创面愈合和再生至关重要。通过用抗炎细胞因子和细胞外基质调节蛋白显著补充MSCs，炎症预处理增强其分泌组并提升其再生潜力。这种预处理产生增强创面愈合质量和速度的分泌组，通过更好地调节免疫应答、降低过度炎症和促进ECM重塑。当使用生物工程支架递送时，这些预处理MSC分泌组结合抗炎和基质调节特性，显著改变创面微环境并促进更快更好的组织再生。
5.4 乳膏、软膏和洗剂
当MSCs被预处理为更强的炎症反应时，其分泌组变得更富含抗炎细胞因子和细胞外基质调节蛋白，从而改善创面愈合。这对再生更有效。这些相对简单的局部制剂有助于确保患者遵循治疗，将生物活性分泌组组分直接给予创面部位。尽管这些制剂不如水凝胶或纳米颗粒系统复杂，但它们促进分泌组来源生物活性分子直接局部递送到创面表面。其治疗效果主要取决于在损伤部位维持足够浓度的生长因子和细胞外囊泡以支持细胞增殖、迁移和组织修复。这些更易操作的半固体载体含有生长因子和生物活性细胞外囊泡，支持细胞增殖、迁移和炎症等基本创面愈合过程。与水凝胶和纳米颗粒制剂等更复杂的递送技术相比，这些制剂中分泌组的稳定化、渗透和缓释有待解决。通过加强和优化这些制剂，其在创面愈合应用中的潜力将增加。
5.5 3D生物打印与MSC分泌组结合
MSC分泌组与3D生物打印技术的结合是治疗糖尿病足溃疡的一项进步。除提供愈合基质外，该技术创建三维基质和水凝胶，可连续向创面部位提供生物活性物质。这可加速愈合过程中若干关键步骤，如新血管形成、受损组织替代、有害炎症减少和细胞外基质重塑。载有分泌组的3D生物打印构建体在糖尿病创面模型中改善细胞活力、加速创面闭合并降低感染率。3D生物打印实现的精确逐层制造允许分泌组因子的受控空间分布，增强治疗效果并可能为DFU患者实现个性化创面护理解决方案。这种空间控制允许创建模拟天然组织结构的仿生构建体，并实现再生因子的位点特异性释放。这种受控递送可增强血管生成、细胞募集和细胞外基质组织，同时最小化创面床生物活性分子的损失。表2提供了MSC分泌组在糖尿病足溃疡治疗中各种递送系统的比较总结。在本综述中，糖尿病足溃疡的总体负担和病理生物学以及基于间充质基质细胞分泌组治疗的理由在整合示意图（图2）中总结。该图强调慢性DFU如何由持续性炎症、氧化应激、缺血和血管生成受损驱动，并将传统细胞MSC治疗的局限与MSC分泌组产品的多因素促愈合作用、多样细胞来源和多功能智能递送形式进行对比。总体而言，基于分泌组制剂的治疗性能不仅取决于分泌组本身的生物活性，还取决于递送平台保存、定位和控制其生物活性货物释放的能力。水凝胶、纳米颗粒、生物工程支架和3D生物打印构建体等先进递送系统通过改善稳定性、延长保留时间、促进细胞摄取和使慢性创面微环境中再生通路的持续激活成为可能来增强治疗效力。
5.6 MSC分泌组递送系统的转化挑战与未来考虑
尽管众多递送平台已证明有希望的临床前效力，若干转化挑战继续限制其广泛临床实施。制造可扩展性仍是主要关注点，因为纳米颗粒制剂、负载细胞外囊泡的支架和三维生物打印构建体等复杂递送系统需要可重复的大规模生产，同时保持批次间一致性和生物效价。制剂稳定性也仍然具有挑战性，因为生长因子、细胞因子和细胞外囊泡在加工和长期储存过程中易降解。尽管水凝胶和基于生物材料的载体改善保留并保护生物活性分子免受快速降解，标准化保存策略如冻干和优化储存条件需要进一步验证。控制释放动力学同样重要，因为过度突释可能降低治疗效力，而 prolonged 缓释对于在整个慢性糖尿病创面的长愈合期内维持再生信号是必要的。此外，必须考虑先进递送系统的经济可行性，因为复杂制造工艺、专业生物材料和质量控制测试可能比传统局部制剂显著增加生产成本。最后，由于缺乏普遍接受的制造标准、效价测定和产品表征方案，MSC分泌组制剂的监管批准仍然具有挑战性。这些转化考虑强调，未来发展不仅应关注改善生物效力，还应建立可扩展、成本效益、可重复且符合监管的递送平台，适合临床应用。
6 临床前研究：MSC分泌组及其制剂在糖尿病创面愈合中的应用
近年来，MSC分泌组及其制剂在创面愈合尤其是糖尿病足溃疡模型中的治疗潜力已产生大量临床前数据。研究了许多MSC来源，包括骨髓、脂肪组织、脐带组织和围产期组织，以及各种递送系统，包括用于局部给药的水凝胶和用于胃肠外给药的条件培养基和EVs。以下部分简要概述MSC分泌组在创面愈合中治疗潜力的主要研究。
6.1 骨髓MSC分泌组增强临床前DFU模型中的愈合
Xu等（2023）近期研究考察了骨髓来源MSC-CM在链脲佐菌素（STZ）和高脂饮食诱导的大鼠DFU模型中的作用。CM注射于后肢创面周围。治疗创面表现出显著更快的闭合、更厚的真皮和表皮、增强的细胞增殖（Ki67）和增加的血管生成（CD31）。此外，自噬标志物（LC3B）上调，而焦亡蛋白如IL-1β和GSDMD被抑制，表明对糖尿病创面微环境的免疫调节效应。Balasubramanian等（2017）证明BM-MSCs及其分泌组通过调节炎症、刺激血管生成和ECM重塑在糖尿病创面模型中具有强大再生潜力。
6.2 脂肪来源MSC-CM促进糖尿病小鼠血管生成
De Gregorio等（2020）在db/db糖尿病小鼠中评估了脂肪来源MSCs的CM的效力。该研究还比较了去铁胺预处理CM的效果。两者均改善新生血管形成并上调糖尿病溃疡中VEGF和HIF-1α表达，证实AD-MSC分泌组的促血管生成能力。Huang等（2025）研究了脂肪来源间充质基质细胞条件培养基（AD-MSC-CM）在链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠模型中促进愈合的潜力。当AD-MSC-CM局部应用于创面时，其增强创面愈合，加速创面闭合、内皮细胞生长和创面部位新生血管形成。AD-MSC-CM还增加VEGF、EGF和bFGF等刺激新生血管形成的生长因子的表达，并降低TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子的表达。转录组分析显示，AD-MSC-CM的这种治疗潜力源于TNF信号通路和趋化因子的下调。另一项研究检查了血管生成素-1基因修饰的间充质基质细胞来源条件培养基，并在糖尿病小鼠创面愈合模型中进行测试。这种修饰的MSC-CM与对照相比显著加速创面闭合速率和组织修复以及创面中新血管形成。这表明富含血管生成因子的MSC来源条件培养基可能有益于糖尿病中的血管修复和创面愈合。
6.3 缺氧预处理hUC-MSC分泌组增强创面愈合
在Siufui Hendrawan等（2021）进行的一系列广泛实验室和动物研究中，低氧条件下培养的人脐带间充质基质细胞来源条件培养基（CM）已被证明可加速糖尿病创面愈合。在糖尿病大鼠中，将缺氧处理的人脐带间充质基质细胞条件培养基与抗生素和未治疗对照进行比较。研究显示，缺氧处理的人脐带间充质基质细胞条件培养基比其他两种治疗具有更快的再上皮化和更高的胶原合成。研究得出结论，低氧条件下培养的人脐带间充质基质细胞来源条件培养基具有改善糖尿病创面愈合的潜力，特别是对于组织再生和细胞外基质产生。
6.4 MSC分泌组联合支架在DFU动物模型中的应用
Palumbo等（2024）将MSC分泌组整合到多孔透明质酸基水凝胶中，用于小鼠糖尿病溃疡的直接局部应用。生物活性水凝胶显著加速创面闭合、改善上皮增厚、增加CD31阳性微血管数量并下调慢性炎症标志物，为局部治疗提供可扩展的递送系统。人围产期MSCs来源分泌组，包括脐带（hUCMSCs）、绒毛膜绒毛（hCVMSCs）和蜕膜（hDCMSCs），被嵌入三组分水凝胶支架（PEGDA/SA/Col I）中。该递送系统支持成纤维细胞、内皮细胞和角质形成细胞的体外活力、迁移和管形成，所有这些对创面再生至关重要。这些发现支持载分泌组支架用于未来转化应用的可行性。
6.5 MSC来源细胞外囊泡（EVs）在糖尿病创面模型中的应用
Bailey等（2022）的一项全面meta分析回顾了18项涉及MSC来源EVs在糖尿病创面模型中的临床前研究。根据该综述，EV治疗可一致改善毛细血管密度、再上皮化、创面闭合和瘢痕组织厚度。此外，该工作证明含有miR-126和miR-21等microRNAs的EVs可以更成功地实现这一点，证明如何通过微调分泌组来优化治疗效果。近期初步研究解码了负责这些效应的特定分子“货物”。近期研究表明，EVs的治疗效力很大程度上由其microRNA（miRNA）和蛋白质谱决定，这些谱可以被调节以解决DFUs的“停滞”炎症期。脐带MSC来源外泌体（hUC-MSC-Exos）已被证明通过驱动巨噬细胞从促炎M1表型向修复性M2状态极化来加速创面闭合。表型转变主要由miR-21-5p/KLF4信号轴调节。这在减轻糖尿病微环境中持续性炎症方面发挥关键作用。此外，富含miR-132的细胞外囊泡已被证明可有效恢复暴露于高糖条件下的角质形成细胞受损的迁移和增殖能力。该效应通过TIMP3基因下调介导，最终促进更有效的再上皮化。为增强这些再生信号，MSCs的缺氧预处理已成为一种有效策略；缺氧诱导的EVs显著富含miR-210。与常氧对照相比，这些细胞表现出增强的促血管生成活性并刺激更密集的毛细血管网络形成。总体而言，这些数据强调MSC来源EVs作为高度“可调”的生物学“指令集”来克服糖尿病创面愈合的复杂病理生理障碍。
6.6 当前临床前模型的局限性与转化挑战
尽管临床前研究报告了有希望的治疗结果，但在解释这些发现时必须考虑若干显著局限性。大多数实验研究使用啮齿动物模型，如链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠和遗传性糖尿病db/db小鼠。虽然这些模型复制了糖尿病的某些代谢特征，但它们不能完全捕捉人糖尿病足溃疡（DFUs）的复杂病理生理。人DFUs常与周围动脉疾病、神经病变、复发性感染、生物膜形成、免疫应答受损和多种合并症相关，这些难以在实验动物模型中同时再现。因此，在这些模型中观察到的创面愈合反应可能高估基于间充质干细胞（MSC）分泌组干预的治疗效力。此外，已发表临床前研究之间存在相当大的方法学异质性。MSC组织来源、供者特征、培养条件、预处理策略、分泌组分离方法、细胞外囊泡纯化方案、剂量、给药途径、治疗频率和结局测量的差异使研究之间的直接比较复杂化。缺乏标准化方案也限制可重复性并阻碍确定临床应用的最佳治疗制剂。将有希望的临床前发现转化为人类治疗带来额外挑战。更接近人类皮肤结构和创面愈合的大型动物研究有限，且稳健的药代动力学、生物分布、长期安全性和剂量-反应数据仍然缺乏。此外，在基于MSC分泌组制剂常规在大型随机临床试验中评估之前，必须实现符合良好生产规范（GMP）条件的制造、经过验证的效价测定的建立、批次间一致性和监管合规。因此，尽管当前临床前证据强烈支持基于MSC分泌组治疗的再生潜力，但需要进一步的标准化和临床相关研究来弥合实验效力与糖尿病足溃疡管理成功临床转化之间的差距。
7 临床试验和人体数据：基于MSC分泌组的局部应用在糖尿病创面愈合中的应用
从临床前研究向人类受试者的过渡是再生医学进步的重要里程碑。有少数注册临床试验和试点研究显示MSC分泌组治疗糖尿病足溃疡（DFUs）的有效性和安全性；然而，大规模III期试验数据仍待公布。人脐带MSC分泌组凝胶的II期临床试验：Tan等2023年的研究是证明MSC分泌组治疗慢性创面有效性的最著名研究之一。在该研究中，使用含10%人脐带间充质基质细胞分泌组的局部凝胶治疗41例糖尿病相关创面和麻风病引起的营养性溃疡患者的慢性溃疡。在治疗过程中，观察到创面长度、宽度和总面积的显著减少。最重要的是，未观察到不良事件，表明MSC分泌组治疗不仅安全而且有效促进创面上皮化和组织修复。缺氧预处理MSC（HC-MSC）分泌组凝胶：另一项临床研究评估了缺氧预处理MSC（HC-MSC）分泌组凝胶在糖尿病足溃疡患者中的治疗潜力。已知缺氧培养条件（约5% O
2）增强MSCs促血管生成和抗炎因子的分泌。在这项涉及16名2–3级糖尿病足溃疡患者的随机前瞻性研究中，应用HC-MSC分泌组凝胶导致治疗第一周内创面体积显著减少。创面组织的分子分析进一步显示抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10）增加以及促炎转录因子NF-κB p65减少，表明治疗效果可能通过调节炎症微环境和促进血管生成介导。使用沃顿胶MSC条件培养基的注册临床试验：除已发表研究外，若干研究MSC分泌组治疗的临床试验目前正在注册。在ClinicalTrials.gov注册的一项试点临床研究（NCT04134676）正在评估沃顿胶MSC条件培养基来源局部凝胶治疗慢性溃疡创面的安全性和治疗潜力。该研究旨在评估应用富含生长因子和细胞因子的基于分泌组局部制剂后的创面愈合结局。尽管该试验的最终结果尚未发表，但该研究反映了对使用MSC分泌组作为慢性创面无细胞再生治疗的日益增长的临床兴趣。近年来（2025–2026）临床相关数据的出现只会推动这种无细胞DFU治疗的趋势。在一项涉及110名糖尿病足溃疡患者的沃顿胶来源MSC外泌体随机对照试验中，62%的参与者在研究结束时实现完全创面愈合。在愈合的患者中，治疗组平均6周达到完全恢复，而标准护理对照组为20周。在一项涉及10名Texas II–III级糖尿病足溃疡患者的单中心、开放标签I/II期试验（NCT06825884）中，脐带MSC衍生物的病灶周围注射在平均4.2周内使所有患者实现完全创面闭合。这些发现令人鼓舞，但来自小型、非对照试点研究，需要在更大的随机试验中确认。在分子水平上，这是由于PI3K/AKT信号通路的激活，该通路阻止高血糖诱导的细胞停滞。尽管这些早期临床发现令人鼓舞，但当前支持基于MSC分泌组治疗糖尿病足溃疡的证据仍为初步的，应谨慎解释。大多数已发表临床研究涉及相对较小的样本量、单中心设计和早期临床试验，从而限制其发现的统计效力和普遍性。此外，患者选择标准、溃疡严重程度、MSC来源、分泌组制备方案、剂量、递送方法、治疗持续时间和临床结局测量存在相当大的异质性，使研究之间的直接比较困难。尽管创面闭合、血管生成和组织再生方面的改善已被一致报道，但这些发现需要通过 adequately powered、多中心随机对照试验以及标准化生产方案、更长随访期和全面安全性评估来确认。因此，尽管现有临床证据支持基于MSC分泌组治疗作为糖尿病足溃疡有前景的再生策略的潜力，但尚未能就其长期疗效、安全性和广泛临床适用性得出明确结论。
8 基于分泌组治疗相对于细胞治疗的优势
间充质基质细胞（MSC）治疗已成为再生医学中有前景的候选者，尤其是在创面愈合中。越来越多的证据表明MSC治疗发挥作用的机制不是通过细胞植入，而是通过其分泌的生物活性因子（称为“分泌组”）。与活细胞治疗相比，基于分泌组的治疗具有若干优势。无细胞活力问题：在活细胞治疗中，储存、运输和给药期间维持细胞活力的问题是一项后勤和成本挑战。基于分泌组的产品不含细胞，因此不构成与细胞活力相关的任何问题，并促进更好的稳定性、易操作性和更长保质期。更简单的监管途径：细胞产品将受到严格的先进治疗药品（ATMP）法规约束。这是因为存在致瘤性和分化风险。分泌组制剂作为无细胞生物制品，更快通过监管障碍，更符合制药行业的批准机制。即用型可扩展性：分泌组可在标准化GMP条件下大规模生产、批次测试并储存直至需要，这允许“即用型”使用，而个体化MSC培养无法实现这一概念。这简化了生产并增加可及性。此外，基于分泌组的治疗提供易于长期储存、成本效益和非致瘤性优势，使其更安全且更适用于临床转化。降低免疫原性：使用细胞治疗存在引发免疫排斥的潜在风险。相反，分泌组主要含有信号分子和细胞外囊泡，表现出较低免疫原性和较低不良免疫反应风险。这将使基于分泌组的治疗更具免疫相容性且更安全。总之，这些特征使基于MSC分泌组的治疗成为创面愈合有前景的下一代无细胞再生方法。尽管有这些优势，基于MSC分泌组的治疗仍面临若干重要挑战。其临床转化受限于缺乏标准化生产方案、经过验证的效价测定和普遍接受的分泌组表征质量控制标准。供者间变异增加进一步复杂性，因为MSCs的组织来源、培养条件和收集方法均可影响每批次的组成，进而影响治疗一致性。储存和运输期间的稳定性也仍是实际问题。此外，临床相关给药策略尚未建立。关于这些产品应如何分类和批准的监管不确定性也持续存在。基于MSC分泌组的治疗相比传统细胞方法提供真正优势，但这些科学、制造和监管挑战需要在常规临床实践使用之前得到解决。
9 基于MSC分泌组治疗的挑战与差距
间充质基质细胞分泌组已显示出作为无细胞再生治疗的巨大前景。然而，将基于分泌组的治疗转化为临床级、商业可用药物存在特定挑战。制剂的稳定性、不同批次的可重复性、生产方法的可扩展性、监管合规和伦理安全是其中一些困难。尽管已识别众多障碍，利用间充质基质细胞分泌组的治疗已显示出巨大潜力。这包括缺乏长期临床安全性证据、缺乏表征技术以及剂量缺乏共识。已识别问题的解决将决定基于分泌组治疗的实际适用性，特别是对于DFUs等慢性创面。总体而言，这些未解决的挑战表明，MSC分泌组治疗的成功临床转化所需远不止在实验模型中证明治疗效力。在确定负责治疗活性的生物活性成分、建立经过验证的效价测定、优化给药策略以及长期评估疗效和安全性方面仍存在重大科学不确定性。从制造角度看，在良好生产规范（GMP）条件下实现可重复的大规模生产同时最小化供者依赖性变异并保持批次间一致性仍是主要挑战。此外，缺乏管理产品表征、质量控制、放行标准和产品分类的统一监管指南继续使临床开发和监管批准复杂化。通过标准化方案、合作研究和精心设计的多中心临床试验解决这些科学、制造和监管障碍，对于MSC分泌组治疗常规转化为安全、有效和商业可用的糖尿病足溃疡治疗至关重要。
9.1 MSC分泌组的GMP合规生产
然而，对于基于分泌组治疗在临床环境中的应用，有必要建立良好生产规范（GMP）合规的制造过程以确保产品可重复性和安全性。MSC来源分泌组的制造需要优化各种关键参数，如MSCs的传代次数、培养条件、氧水平和预处理刺激如缺氧和炎症。这些参数的标准化对于实现MSC来源分泌组治疗的可重复性和效力至关重要。此外，开发GMP合规生产方案以及严格的质量控制和效价测试对于促进MSC分泌组治疗的临床转化和监管批准至关重要。
9.2 无外源和无血清培养基限制
为符合临床安全要求，采用无外源和无血清细胞培养系统替代传统胎牛血清（FBS）补充培养基的趋势日益增加。然而，无血清可能对细胞活力、分泌组数量和分泌组质量产生不利影响。尽管正在积极开发化学成分明确培养基以克服上述细胞培养基限制，但实现生物效力的挑战仍然存在。此外，蛋白质水平、囊泡释放和信号传导可能受培养基成分影响。因此，标准化不同来源的培养基具有挑战性，这使得在众多实验室和商业制造商之间标准化困难。
9.3 稳定性和批次变异性
分泌组制剂比细胞产品更易保存。例如，含有高水平细胞外囊泡和蛋白质的分泌组制剂可进行冻干。冻干是一种有助于在储存和运输期间维持产品稳定性的保存方法。然而，批次间变异性是分泌组制剂的另一个关注问题。这主要归因于供者变异和加工制造变异。Mocchi M等2021年的一项研究使用MSCs开发了冻干分泌组制剂。研究表明该制剂稳定并较长时间保持生物活性，支持其作为稳定药物级产品的潜力。需要严格的过程控制和质量评估（例如蛋白质组学分析、ELISA和纳米颗粒追踪）以确保产品一致性。全面稳定性研究应遵循ICH Q1A(R2)指南进行实时稳定性（2–8 °C、25 °C、37 °C至24个月）、加速稳定性（40°C 6个月）、冻融研究（至5个循环）、应激研究（光照、pH、振荡）、容器-密封件相容性。对于冻干产品，应评估残留水分、复溶时间和复溶后新鲜样品的生物活性。
9.4 安全性、免疫原性和监管问题
尽管分泌组不含任何活细胞，但如果分泌组过滤不当，仍可能发生宿主来源蛋白、损伤相关分子模式（DAMPs）或不需要的细胞因子引起的免疫反应。此外，正如EMA和FDA所示，关于分泌组产品属于生物制品、组织产品还是药物类产品类别存在争议，这影响其上市后监督和监管过程。分泌组治疗消除活细胞治疗中存在的致瘤性和异位组织发育担忧。然而，供者来源可追溯性、知情同意和长期药物警戒仍然必要。基于MSC分泌组的产品具有相当大的潜力，标准化GMP生产、无外源制剂和严格质量控制方案对临床转化至关重要。对稳定化技术、制造可扩展性和监管协调的持续研究将为分泌组治疗作为复杂创面（如糖尿病足溃疡）即用型解决方案的广泛采用铺平道路。尽管MSC分泌组比细胞治疗免疫原性更低，但其免疫原性潜力不应被忽视。它含有可溶性蛋白（其中一些可触发免疫应答）、可能携带MHC（主要组织相容性复合体）分子的细胞外囊泡以及能够激活抗原呈递细胞的凋亡小体。因此，临床前研究应评估抗HLA抗体形成、补体激活、细胞因子释放综合征风险和致敏潜力。鉴于DFUs的慢性性质和重复给药的可能性，长期安全性监测还应追踪恶性肿瘤风险、全身免疫抑制和自身免疫病潜在发展。
9.5 最佳剂量和浓度
分泌组产品给药的剂量和方案仍主要凭经验确定。大多数临床前研究使用不同浓度而没有药代动力学或药效学标准化。例如，Shabbir等证明了MSC来源外泌体在慢性创面模型中增强血管生成和成纤维细胞增殖的潜力；然而，所使用的外泌体浓度可能不适合人类使用。此外，水凝胶、喷雾剂和纳米颗粒等各种制剂的剂量-反应曲线尚未完全表征。没有基于生物标志物的给药，临床有效性可能变化，并且在不同患者组之间总是不一致。
9.6 供者和培养条件变异性
分泌组的组成深受供者类型影响，并基于年龄、一般健康状况和所用组织类型（骨髓、脂肪组织或脐带）。它还基于细胞培养方式，如是否使用血清以及预处理中涉及的氧水平和触发因素类型。这种异质性使治疗一致性复杂化。根据Vizoso及其同事，由骨髓（BM-MSCs）和脂肪组织（AD-MSCs）产生的间充质基质细胞具有不同的细胞因子和外泌体谱，这影响其愈合创面的能力。这提醒我们，为确保可重复性，必须仔细选择供者细胞来源，并标准化细胞分离和培养过程。Kannan等（2024）的近期比较分析表明，汇集来自多个供者的MSCs可最小化供者特异性变异。它增强分泌组组成的一致性，这是可扩展治疗制造的关键优势。
9.7 缺乏标准化表征方案
目前尚无普遍接受的方案用于表征MSC分泌组或其组分，特别是外泌体、细胞因子、miRNAs和可溶性蛋白。纳米颗粒追踪分析（NTA）、ELISA、流式细胞术和质谱等分析技术使用不一致，导致产品定义不清。在2021年的一份立场文件中，Gimona等强调迫切需要质量控制框架来定义生物效价、身份和安全性，正如监管机构所要求的那样。
9.8 长期临床安全性和有效性
尽管MSC分泌组缺乏复制细胞从而避免致瘤风险，但评估免疫应答、脱靶效应和持续效力的长期临床试验很少。迄今为止，大多数数据来自短期动物研究或早期临床试验，对慢性全身暴露风险的理解有限。此外，分泌组是包含促血管生成、抗炎和免疫调节因子的生物活性分子混合物，需要长期药物警戒以排除纤维化和免疫抑制等不可预见效应。MSC分泌组治疗对治疗DFUs等慢性创面具有变革潜力。然而，推进常规临床使用将需要解决关键知识差距，特别是关于给药、供者变异、表征和长期安全性。为建立标准化程序并实现可靠临床转化，学术界、工业界和监管机构之间的合作至关重要。
10 MSC分泌组治疗在糖尿病足溃疡中的未来展望
间充质基质细胞（MSC）分泌组治疗从实验室到床边的转变为再生医学进步提供了有希望的机会，特别是在糖尿病足溃疡（DFUs）等慢性创面的治疗中。有可能克服现有局限并可能改善治疗结果的新方法包括生物工程分泌组、与智能递送系统整合和个体化创面护理。基于间充质基质细胞（MSC）分泌组的DFU治疗开发的逐步转化框架如图3所示。它包括临床前验证和制剂、分阶段临床试验、GMP合规商业化、MSC来源选择和分泌组优化。尽管有这些优势，临床转化仍依赖于克服产品标准化、制造一致性、储存稳定性和监管批准相关的挑战，这些在第9节中讨论。10.1 生物工程和设计者分泌组
通过基因操作或环境刺激预处理MSCs允许工程化分泌组以优化治疗效力。缺氧预处理、用IFN-γ或TNF-α等细胞因子预处理以及3D培养系统等方法已被证明可增加抗炎和促血管生成因子的分泌。此外，已被改造为更有效产生VEGF、HGF或TGF-β3等生长因子的基因工程MSCs有可能用于开发“设计者分泌组”，以满足糖尿病足溃疡面临的挑战，如血管化受损和持续性炎症。这些生物工程分泌组预期提供更有针对性、一致的效果并减少天然MSC产品中观察到的变异性。
10.2 联合治疗：MSC分泌组与生长因子和抗菌剂
糖尿病足溃疡是复杂的慢性创面。这些创面倾向于阻止新血管形成、处于炎症状态、降解细胞外基质，有时发生感染。尽管间充质基质细胞分泌组含有复杂的生物活性剂阵列（如细胞因子、趋化因子、生长因子和细胞外囊泡）有助于创面愈合，近期研究表明分泌组应与其他治疗剂联合使用。这可能进一步增强创面愈合过程。除帮助组织修复外，MSC分泌组还具有自身的抗菌和免疫调节特性。这在糖尿病引起的慢性创面中尤其相关，因为它们常被感染。MSCs分泌的因子可通过刺激角质形成细胞和免疫细胞中抗菌肽的产生来帮助对抗感染。增强MSC分泌组再生潜力的另一种策略是在收集分泌组之前预处理MSCs。例如，药理预处理已被报道可增强分泌组来源EVs的治疗潜力。吡格列酮处理的MSCs来源外泌体通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路显示增强的血管生成潜力，进而在糖尿病创面模型中刺激内皮细胞增殖、新生血管形成和创面愈合。累积证据表明，MSC分泌组治疗、生长因子治疗和抗菌治疗联合可能是糖尿病足溃疡（DFUs）下一代治疗的有前景未来选择。持续研究预期促进这些先进再生治疗的临床转化。
10.3 与智能绷带和可穿戴系统的整合
先进可穿戴敷料通过感测局部条件并相应递送治疗正在改变创面护理。例如，“智能绷带”已证明可加速小鼠创面愈合，实现创面的调节电刺激和实时监测。因此，MSC分泌组可以响应性精确度用于这些系统。
10.4 通过MSC-EV谱分析实现个性化创面护理
MSCs产生的细胞外囊泡（EVs）富含对愈合至关重要的脂质、蛋白质和miRNAs。根据全面分析，这些EVs具有强大再生潜力、优异稳定性和低免疫原性。此外，它们可以被设计或与支架整合以克服释放限制并更有效地靶向创面愈合。通过分析EVs的分子货物，治疗可以定制到每个创面的独特特征。这使得定制再生治疗成为可能。未来方法可能转向个性化护理模式，在選擇最合适的基于分泌组干预之前分析创面液体。分析创面微环境包括基线细胞因子水平（TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10）、MMP/TIMP比值、血管生成介质如VEGF、FGF-2和PDGF以及中性粒细胞与淋巴细胞比值可提供个体创面的生物学特征并指导治疗决策。这种谱分析将允许分泌组制剂匹配特定创面表型。例如，缺血性创面可能对缺氧预处理、富含VEGF的分泌组（促进血管生成）反应最佳，而由持续性炎症主导的创面可能更多受益于富含IL-10、巨噬细胞极化分泌组（驱动炎症期消退）。感染性创面可用富含抗菌肽的分泌组靶向，而慢性难愈性创面可能需要富含HGF和FGF-2的制剂以支持细胞外基质重塑和持续组织再生。
10.5 DFU管理的理想治疗策略
基于现有证据，糖尿病足溃疡最有前景的基于MSC分泌组的治疗策略可能涉及优化分泌组生产、靶向递送和创面特异性治疗选择的组合。富含促血管生成、免疫调节和细胞外基质调节因子的分泌组可同时解决DFUs的主要病理特征，包括血管生成受损、持续性炎症和组织再生缺陷。分泌组的治疗效力可通过缺氧、炎症预处理或三维培养系统等预处理方法进一步增强，这些方法增加参与创面修复的生物活性分子的分泌。此外，将分泌组纳入先进递送平台（包括水凝胶、支架、纳米颗粒基载体或智能创面敷料）可改善创面部位的保留和受控释放。鉴于糖尿病创面的异质性，未来治疗方法还可能受益于根据创面特征（如缺血、炎症负担、感染状态和组织丢失）定制分泌组制剂。因此，结合优化分泌组组成、先进递送系统和个性化创面管理的综合策略可能代表MSC分泌组治疗在DFU治疗中临床转化的最有效方法。
11 结论
糖尿病足溃疡是糖尿病最困难的并发症之一。这些对传统治疗方式反应不佳，具有严重后果。因此，MSCs分泌组作为无细胞治疗在过去几年中受到越来越多关注。在这种方法中，与干细胞治疗不同，使用多种生物活性化合物的组合。生长因子、细胞因子和细胞外囊泡等因子属于MSCs分泌组类别。这种化合物组合通过组织再生、促进血管生成来刺激创面愈合，类似于MSCs的效果。MSC分泌组的实际优势也显著促进了MSC分泌组意识的增加。与干细胞治疗相比，它被认为更安全且更容易开发、维持和给药。以水凝胶、洗剂或纳米颗粒基载体形式直接应用于创面也更容易。其治疗潜力包括糖尿病创面中的快速创面愈合、皮肤再生和慢性炎症管理，已在众多临床前研究中得到证实。同样，MSC分泌组的初步治疗效力及其安全性特征也已在早期临床试验中得到证明。然而，尽管具有潜力，将MSC分泌组转化为临床可用治疗仍是挑战。这是因为仍需要标准化生产和表征过程。此外，需要标准化递送机制。而且，需要标准化分泌组质量。为充分确定MSC分泌组的治疗效力，需要进一步临床试验。研究人员正在积极解决这些问题。MSCs的预处理和基因修饰已在临床前阶段证明其潜力，并提高治疗组合的效率和分泌组的生物活性。MSC分泌组与创新生物材料和递送系统的结合将能够改善稳定性、缓释和局部治疗活性。所有这些方法都处于实验阶段。需要优化技术、创建标准生产过程、进行安全性研究并在临床试验中证明其有效性。使用MSC分泌组的局部治疗是治疗糖尿病足溃疡的有前景的无细胞治疗。然而，仍有若干科学和技术问题需要解决。需要进一步研究和良好实施的临床试验以开发标准化治疗。
