一例犬严重自残性损伤并泌尿道感染中产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌的基因组分析

《Veterinary Research Communications》：Genomic analysis of extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from a dog with a severe episode of self-trauma and urinary tract infection

　　

产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的肠杆菌目（Enterobacterales）是兽医临床中日益重要的新兴病原体。本研究描述了一株产ESBL的大肠埃希菌（Escherichia coli）和一株产ESBL的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的临床、微生物学与基因组特征，二者分离自一只患有截瘫并并发肾盂肾炎、慢性膀胱炎及自残性肢体损伤的犬。一只12岁杂交雌性犬在住院期间接受了反复抗菌治疗。通过膀胱穿刺采集的尿液样本与伤口样本进行了培养，产ESBL菌株通过抗菌药物敏感性试验和基于全基因组序列的分析进行了表征。产CTX-M-55的大肠埃希菌属于序列型（ST）457、系统发育群F、O11:H25及fimH145，自尿液和伤口样本中分离获得；而伤口样本还分离出一株产CTX-M-15和SHV-2的肺炎克雷伯菌ST39，KL149:OL2α.2。两株亲缘关系密切的大肠埃希菌尽管具有相同的ST、耐药组、质粒复制子和毒力谱，但相差96个单核苷酸多态性。ESBL阳性菌株携带多个毒力基因，其中大肠埃希菌菌株被归类为肠外致病性大肠埃希菌（ExPEC）。据研究人员所知，这是巴西动物中首次报道产ESBL的肺炎克雷伯菌ST39。产ESBL的大肠埃希菌ST457与肺炎克雷伯菌ST39在同一只犬中的共存，凸显了伴侣动物携带临床相关多重耐药谱系的潜在风险，并强化了该领域持续开展抗菌药物耐药监测和抗菌药物管理的必要性。

研究背景与问题

抗菌药物耐药（AMR）在伴侣动物医学中日益受到关注，尤其是多重耐药（MDR）细菌的出现与传播。肠杆菌目（Enterobacterales）成员是犬感染的重要病因，并可能促进耐药细菌及耐药基因（ARGs）在家庭和兽医诊疗环境中的循环，具有"同一健康"（One Health）意义。其中尤为值得关注的是超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的产生，其可水解超广谱头孢菌素和氨曲南，从而显著限制治疗选择。大肠埃希菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是犬肠外感染尤其是泌尿道感染中最具临床相关性的肠杆菌目成员，产ESBL菌株在犬临床菌株中的报道不断增加，细菌性膀胱炎是与之相关的最常见临床表现之一。除社区相关感染外，兽医住院过程可能促进产ESBL肠杆菌目的获得、持续存在与传播，导致医疗相关感染的发生。全基因组测序（WGS）能够全面表征耐药决定因子并高分辨率评估菌株间的基因组亲缘关系；在涉及多解剖部位感染的背景下，该方法对于判断不同临床标本中分离的菌株是否代表同一菌株以及刻画同一宿主体内不同耐药病原体共存情况尤为有价值。基于此，研究人员报道了一株分离自截瘫犬的产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的临床、表型与基因组特征，该犬表现为泌尿道感染及自残所致感染性肢体损伤。

研究方法

研究人员对一只12岁杂交雌性犬（体重27.35 kg）的临床资料进行了记录。该犬于2025年7月突发非行走性截瘫，2025年11月首次住院，2026年4月因严重自残发作急诊入院。入院当日行肢体病灶外科清创，同时经膀胱穿刺采集尿液、以无菌拭子采集伤口渗出物送细菌培养与药敏试验，并采集静脉血行血液学与生化检查，行腹部超声检查。菌株经革兰染色、触酶试验、凝固酶试验、氧化酶试验及Bactray 1和Bactray 2系统生化鉴定。抗菌药物敏感性试验（AST）采用纸片扩散法，优先按美国临床和实验室标准协会（CLSI）VET01S指南的兽医专用折点判读，头孢曲松、头孢氨苄和头孢羟氨苄因无兽医专用折点而采用欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）标准。对呈现MDR表型的菌株采用双纸片协同试验进行表型ESBL检测。对菌株HV-ENT-001、HV-ENT-002和HV-ENT-003进行基于全基因组序列的分析：以DNeasy Blood & Tissue Kit提取基因组DNA，使用Illumina MiSeq i100平台测序，经SPAdes v.4.3.0从头组装、CheckM v.1.2.2质控；耐药、毒力、质粒复制子及分型通过Pathogenwatch和Center for Genomic Epidemiology网站工具确定；大肠埃希菌系统发育群采用ClermonTyping v.23.06分析；两株大肠埃希菌的基因组亲缘关系采用CSI Phylogeny v.1.4进行单核苷酸多态性（SNP）分析；ESBL基因的基因组定位采用mlplasmids预测，相应重叠群进一步以Nucleotide BLAST检查，仅当ESBL基因与复制子位于同一重叠群时才推断其与特定质粒复制子相关，且因短读长测序的局限性这些关联被视为计算机预测。所有工具均使用默认参数。

研究结果

病例报告：该犬2025年7月突发非行走性截瘫，当时未明确诊断，被推测为髋关节发育不良。2025年11月因厌食、嗜睡、血尿及继发于活动障碍的急性潮湿性皮炎所致骨盆肢蝇蛆病首次住院，4天住院期间经验性静脉给予头孢曲松（50 mg/kg，IV，q12h）和甲硝唑（15 mg/kg，IV，q12h），出院后口服阿莫西林-克拉维酸（25 mg/kg，PO，q12h）10天。2026年4月因严重自残发作急诊入院，体格检查见嗜睡、高热（39.4 °C）、约5%脱水，左骨盆肢可见大面积污染性病灶伴趾骨外露，并有明显脓尿及恶臭深色腹泻。基于脓毒症和肾盂肾炎的怀疑，给予乳酸林格液（3 mL/kg/h，IV）、多模式镇痛及经验性静脉头孢曲松（30 mg/kg，IV，q12h）、恩诺沙星（10 mg/kg，IV，q12h）和甲硝唑（15 mg/kg，IV，q12h）。血液学显示白细胞增多（17 700/μL）伴中性粒细胞增多（15 930/μL）而无核左移；生化显示血尿素氮升高（71.2 mg/dL），血清肌酐在参考范围内（0.98 mg/dL），并有轻度低白蛋白血症（2.5 g/dL）。腹部超声显示双侧肾病，右肾中度肾积水继发于右输尿管结石相关梗阻，左肾轻度肾盂扩张，双肾肾盂内容物表现提示肾盂肾炎；膀胱表现符合慢性膀胱炎，包括尿沉渣、微结石及少量膀胱内气体，提示早期气肿性膀胱炎可能。住院期间泌尿管理为主要技术难题，因上下泌尿道严重感染相关的脓性物质和碎屑蓄积导致反复尿道导管阻塞，需每2小时以生理盐水冲洗膀胱以维持导管通畅和尿流；患犬虽被紧急转诊至肾脏专科评估，但主人于入院3天后违背医嘱要求出院，未获得后续随访，与患犬失去联系，无法评估最终临床结局。

微生物学与药敏结果：显微镜检查鉴定出4株细菌，包括伤口拭子中1株呈葡萄串状排列的革兰阳性球菌，以及3株革兰阴性杆菌（尿液样本1株、伤口拭子2株）。据此，自尿液样本鉴定出大肠埃希菌（HV-ENT-001），自肢体病灶分离出大肠埃希菌（HV-ENT-002）、肺炎克雷伯菌（HV-ENT-003）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，HV-ENT-004）。两株大肠埃希菌（HV-ENT-001和HV-ENT-002）呈现相同的药敏谱，均对阿莫西林-克拉维酸、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢曲松、恩诺沙星、庆大霉素、多西环素和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑耐药，对呋喃妥因和氯霉素敏感。肺炎克雷伯菌HV-ENT-003在所测抗菌药物中呈现与大肠埃希菌相同的药敏谱，恩诺沙星和呋喃妥因因所采用指南中缺乏肺炎克雷伯菌的判读标准而未予评价。金黄色葡萄球菌HV-ENT-004对恩诺沙星和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑耐药，对阿莫西林-克拉维酸和头孢氨苄敏感。值得注意的是，按Magiorakos等标准，大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌菌株呈现多重耐药谱，且属于世界卫生组织（WHO）列为关键优先级的病原-耐药组合，即第三代头孢菌素耐药大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。基于其耐药谱，这些菌株进一步通过双纸片协同试验进行表型ESBL检测，结果显示阳性协同效应，提供了与ESBL产生一致的表型证据。

基因组分析结果：大肠埃希菌HV-ENT-001（尿液）与HV-ENT-002（伤口拭子）呈现高度相似的基因组特征，均为ST457、系统发育群F、血清型O11:H25及fimH145。耐药组包括bla_CTX?M?55、bla_TEM?1B、aph(6)-Id、aph(3’’)-Ib、aph(3’)-Ia、tet(A)、sul2和dfrA14，此外还有GyrA（S83L和D87Y）、ParC（S80I）和ParE（S458A）的喹诺酮耐药相关突变，与耐药表型-基因型关系相符。鉴定出的质粒复制子包括IncFII(pHN7A8)、p0111、IncI1-I(Alpha)、IncI2、IncFIB(AP001918)和IncFIC(FII)。毒力组包括aslA、air、anr、cba、cea、chuA、cia、cma、csgA、cvaC、eilA、espY2、fdeC、gad、hha、hlyE、hlyF、hra、iss、iucC、iutA、kpsE、kpsMII、lpfA、nlpI、ompT、papA_F1651A、papC、shiA、shiB、sitA、terC、tir、traJ、traT、yehA、yehB、yehC、yehD、yfcV和yghJ。按Johnson等提出的分子标准，两株菌因携带papA、papC、kpsMII和iutA而满足五项毒力标记中至少两项的要求，被归类为肠外致病性大肠埃希菌（ExPEC）。SNP分析显示两株菌间存在96个SNP差异，因此就其整体基因组特征而言，被视为属于同一ST457谱系的亲缘关系密切菌株。肺炎克雷伯菌HV-ENT-003（伤口拭子）属于ST39和血清型KL149:OL2α.2，同时携带bla_CTX?M?15和bla_SHV?2，以及包括bla_OXA?1、bla_TEM?1B、aac(6’)-Ib-cr、qnrB19、oqxA、oqxB、aph(6)-Id、aph(3’’)-Ib、aac(3)-IIa、sul2、dfrA14、catB3Δ和fosA^KP在内的广泛耐药组；质粒复制子为IncFII(K)、IncFIB(K)、IncX1、Col(pHAD28)和ColpVC，毒力基因包括mrkA、mrkB、mrkC、mrkD、mrkF、mrkH、mrkI和mrkJ。bla_CTX?M?55和bla_CTX?M?15基因被预测位于质粒重叠群上，两侧为ISEcp1和wbuC。在大肠埃希菌菌株中，含bla_CTX?M?55的重叠群还携带IncFIB(AP001918)/IncFIC(FII)复制子序列及毒力相关基因，包括iutA、iucC、hlyF、ompT、sitA、traT、cma、traJ、anr、cvaC和cba。在肺炎克雷伯菌菌株中，bla_CTX?M?15嵌入一个Tn3相关耐药模块，该模块包含bla_CTX?M?15、bla_TEM?1B、aph(6)-Id、aph(3’’)-Ib和sul2，但同一重叠群上未检测到质粒复制子；另一方面，bla_SHV?2被预测位于染色体上，其周围区域缺乏任何可移动遗传元件。

讨论与结论

研究人员讨论指出，该犬突发截瘫而无明确病因诊断，但急性胸腰段或腰骶段脊髓病灶被认为是可能的潜在原因，因椎间盘疾病和主动脉血栓栓塞是急诊就诊犬急性瘫痪最常见的原因。脊髓损伤尤其是骶上水平的损伤可导致神经源性下泌尿道功能障碍，包括膀胱排空受损和尿潴留，从而使患犬易患泌尿道感染；本病例中该神经功能障碍可能促进了泌尿道感染的发生，表现为膀胱炎与肾脏受累并存。该犬的肢体自残也可能与突发截瘫后出现的神经功能障碍有关：影响脊髓的神经病灶可改变感觉处理和伤害感受，可能导致神经病理性疼痛、感觉异常或感觉迟钝，临床上表现为过度舔舐、啃咬和自残；截瘫起病与随后肢体自残之间的时间关联提示，神经损伤继发的异常感觉输入可能促成了肢体病灶的发生，而由此产生的自残可能破坏皮肤屏障并促进继发细菌感染，从而可能解释病灶中检出的多种微生物感染。并发的泌尿异常包括慢性膀胱炎、输尿管结石和肾积水，同样可能受到神经功能障碍和下泌尿道功能受损的影响；尽管无法确立直接因果关系，但神经功能障碍、泌尿道疾病和自伤性肢体损伤的共存提示这些状况在该患者的临床进展中可能相互关联。伤口的多微生物性质进一步提示皮肤屏障破坏后的复杂继发感染，尽管各微生物的具体作用无法确定。值得注意的是，经膀胱穿刺采集的尿液和肢体病灶拭子中均鉴定出属于同一ST457谱系的亲缘关系密切的大肠埃希菌菌株；然而，仅凭96个SNP的距离不能支持宿主内直接传播，因为大肠埃希菌基于SNP的亲缘关系高度依赖具体情境。这些菌株存在于肢体病灶可能反映真实的感染过程，尤其考虑到其被归类为ExPEC并携带多个参与黏附与组织定植、生物膜形成、铁获取及逃避宿主免疫应答的毒力相关基因；或者，自肢体病灶回收大肠埃希菌也可能源于尿液的直接或间接污染，可能由啃咬自伤区域及随后接触尿液污染的口腔表面所促进。因此，尽管大肠埃希菌菌株间的遗传相似性提示共同来源，现有数据无法确定大肠埃希菌是主动参与了肢体感染还是通过尿液污染和自伤继发引入。大肠埃希菌ST457此前已在伴侣动物的产ESBL菌株中被发现，是台湾某兽医教学医院犬猫尿液样本产ESBL菌株中最常见的克隆；在巴西，ST457也已在伴侣动物的主要耐超广谱头孢菌素大肠埃希菌克隆中被发现，但所检出的ESBL主要为CTX-M-2和CTX-M-8而非CTX-M-55。值得注意的是，产CTX-M-55的ST457大肠埃希菌已在巴西家禽的ExPEC中被报道，携带与本研究菌株相同的bla_TEM?1B及多个额外的耐药与毒力决定因子。该谱系的人兽共患传播潜力进一步得到其在人类和伴侣动物中被检出的支持，包括葡萄牙一例犬与其主人共享的产CTX-M-55菌株。此外，产CTX-M-55的大肠埃希菌已在人类泌尿道感染和商品肉（包括鸡肉和猪肉）中被报道，凸显了该ESBL变体在人类和食品相关储库中的循环。肺炎克雷伯菌ST39已在人类和伴侣动物中被报道，值得注意的是该谱系在巴西似乎罕见，仅在移植患者的人类菌株中被报道过一次；据研究人员所知，这是巴西动物中首次报道产ESBL的肺炎克雷伯菌ST39。尽管ST39此前已在韩国临床患病伴侣动物中被检出，但其在兽医菌株中的出现及与犬特定感染的关联仍鲜有文献记载。本病例报告中，编码3型菌毛系统的完整mrkABCDFHIJ基因簇的存在可能有利于肺炎克雷伯菌在受损组织中的黏附、生物膜形成和持续存在，因3型菌毛与黏附细胞外基质和生物膜形成相关；然而未对生物膜形成能力进行表型评价，无法确认这些毒力相关基因的功能贡献。此外，由于肺炎克雷伯菌自多微生物伤口中分离，其对该感染过程的具体贡献无法确定，尽管产ESBL肺炎克雷伯菌在伴侣动物中与泌尿道感染和软组织感染均有关联，在一项大型兽医研究中软组织感染是ESBL阳性菌株最常见的来源。该菌株携带两种ESBL：CTX-M-15为全球报道的主要ESBL变体之一，SHV-2则是较老但少见的变体。尽管检出catB3，该肺炎克雷伯菌菌株仍对氯霉素敏感；进一步序列分析发现存在截短的catB3Δ^443–633变体，该变体已被证明无功能、不能赋予氯霉素耐药性，从而解释了所观察到的基因型-表型不一致。整个临床过程中反复暴露于广谱抗菌药物可能施加了选择压力，有利于多重耐药和产ESBL细菌的选择或持续存在；既往抗生素暴露与随后分离或获得耐药细菌一致相关，尽管该效应的幅度和持续时间因抗菌药物类别和细菌种类而异。尽管无法确立本患者中抗菌药物暴露与所鉴定耐药菌株出现或持续之间的直接因果关系，反复抗菌治疗可能促成了其持续存在并可能限制了后续治疗选择。既往发作期间未进行AST也凸显了微生物培养和药敏试验对支持抗菌药物选择的重要性，尤其是在复发或复杂性感染中。产ESBL菌株是在经验性头孢曲松治疗期间分离的，但由于结果在出院后才可获得，无法实施基于AST的治疗。总之，该病例说明了神经功能障碍、泌尿道疾病、自伤和继发多微生物感染之间的复杂相互作用，患犬携带临床相关的产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌谱系。在同一动物中鉴定出产CTX-M-55的大肠埃希菌ST457和产CTX-M-15及SHV-2的肺炎克雷伯菌ST39，提供了伴侣动物可能携带对兽医和人类健康具有临床相关性的耐药谱系的进一步证据，与既往报道一致。这些发现进一步强调了兽医医学中AMR监测和抗菌药物管理的重要性，尤其是广谱抗菌药物的合理使用，以减少MDR细菌的选择和持续存在。从"同一健康"角度看，鉴于伴侣动物携带临床重要多重耐药谱系的潜力，在伴侣动物中负责任地使用抗菌药物尤为重要。