《Acta Neuropathologica》：CALB1 expression in meningioma: associations with progression-free survival and chromosome arm 6q loss
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分子谱分析已完善了脑膜瘤的风险分层，但相关转录变化的生物学相关性仍未完全阐明。由CALB1编码的Calbindin D28K（Calb）是一种钙结合蛋白，据报道具有抗凋亡和细胞保护功能。既往无监督转录组分析发现，在具有侵袭性细胞特征的脑膜瘤中CALB1上调，但
分子谱分析已完善了脑膜瘤的风险分层，但相关转录变化的生物学相关性仍未完全阐明。由CALB1编码的Calbindin D28K（Calb）是一种钙结合蛋白，据报道具有抗凋亡和细胞保护功能。既往无监督转录组分析发现，在具有侵袭性细胞特征的脑膜瘤中CALB1上调，但其生物学和临床相关性尚未明确。研究人员分析了来自147例患者的231个脑膜瘤组织微阵列（TMA）芯中Calb的免疫反应性，并在一个由110例原发性脑膜瘤组成的独立队列中评估了CALB1转录本表达、DNA甲基化和拷贝数改变。在约30%的原发肿瘤中检测到Calb免疫反应性，在分子队列中以相似频率观察到CALB1转录本水平升高。在原发队列中，调整所纳入的临床变量后，高Calb蛋白表达与较短的无进展生存期（PFS）相关。该关联在组织学WHO 2级脑膜瘤的限制性分析中同样被观察到。特定外显子和内含子CALB1 CpG位点的低甲基化与较高的转录本表达相关，提示表观遗传对其失调的贡献。多变量分析在次要队列中确定了CALB1转录本表达与染色体臂6q缺失、组织学WHO分级、CALB1低甲基化及特定甲基化亚类的关联。对携带6q缺失的肿瘤进行差异表达分析，发现CALB1及转录因子（包括NKX2-5和SOX11）的表达差异。相比之下，相关钙结合蛋白Calretinin（Calr）和孕激素受体（PR）的表达在原发队列中与PFS无显著关联。总之，这些发现支持Calb蛋白表达的潜在预后相关性，尤其是在组织学WHO 2级脑膜瘤中，并在互补队列中将CALB1转录本表达与特定分子特征相关联。因此，Calb免疫组织化学可能为在整合分子检测之前对这一临床异质性肿瘤类型进行风险分层提供实用工具。
脑膜瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，起源于软脑膜的蛛网膜帽细胞。脑膜瘤在生物学上具有高度异质性，表现为多样的组织学亚型和分子改变。尽管大多数脑膜瘤临床病程相对良好，但2021年世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分类（CNS WHO）承认其涵盖从惰性WHO 1级病变到高度侵袭性WHO 3级肿瘤的谱系。除经典的组织病理学标准（包括核分裂活性、脑侵犯和特定形态学特征）外，分子谱分析已大幅完善了预后分层。染色体拷贝数改变已成为肿瘤进展的关键决定因素。基于此，cIMPACT-NOW第8次更新建议将具有1级形态但携带染色体臂1p缺失合并22q缺失和/或致癌性NF2变异的脑膜瘤归为CNS WHO 2级。这些建议将分子风险评估扩展到2021年CNS WHO分类标准之外。6q和14q缺失也常与不良临床结局相关。此外，基于DNA甲基化的分类方案与WHO分级和染色体畸变整合后可提供进一步的预后分辨率，整合分子评分（IMS）即为范例。尽管取得了这些进展，携带这些染色体畸变的侵袭性脑膜瘤所涉及的下游分子程序仍不完全清楚。
Calb是EF手型钙结合蛋白家族成员，在钙稳态中具有缓冲和传感器样功能。在人类中，其表达主要限于小脑浦肯野神经元、特定神经元亚群以及远端肾单位和集合管的上皮细胞。除生理作用外，越来越多的实验证据提示其具有促肿瘤特性。Calb已被证明可抑制caspase-3介导的凋亡、促进细胞衰老逃逸并影响增殖。与这些发现一致，Calb表达已在多种上皮性和中枢神经系统肿瘤实体中被报道。然而，在脑膜瘤中，关于Calb的数据仍然稀少且存在矛盾。CALB1此前在脑膜瘤的无偏转录组分析中被鉴定为与侵袭性和耐药肿瘤表型相关的干性相关基因特征的一部分。具有侵袭性生长特征的相应原代脑膜瘤细胞系也表现出较低的核caspase-3免疫反应性。然而，早期在一小群后颅窝脑膜瘤队列中的免疫组织化学分析未检测到Calb免疫反应性。因此，Calb在脑膜瘤中的存在、调控机制和临床相关性仍未解决。鉴于其抗凋亡潜力和对分子定义的高危脑膜瘤相关转录变化的不完全理解，研究人员假设CALB1表达与临床结局和不良分子特征相关。研究人员在原发免疫组织化学队列中研究了Calb蛋白表达及其临床病理和预后关联。在一个独立的次要队列中，全面分析了CALB1转录本表达、DNA甲基化和复发性拷贝数改变。这些互补分析旨在表征CALB1相关生物学并评估其潜在预后相关性。
研究人员为开展此项研究，采用了以下主要关键技术方法：构建原发队列的组织微阵列（TMA），包含来自147例患者的231个TMA芯（对应179个样本），样本由UCT Biobank Frankfurt提供；纳入110例公开可用的原发性脑膜瘤数据集作为次要队列（来源于GSE189672和GSE139651）；采用免疫组织化学（IHC）检测Calb、Calr和PR蛋白表达，并使用Aperio AT2扫描仪进行数字化，通过QuPath 0.5.0软件进行半自动化定量评分；利用RNA测序（RNA-seq）数据分析CALB1转录本表达（edgeR和limma包处理）；使用Illumina Infinium MethylationEPIC v1.0 BeadChip和450K甲基化阵列分析DNA甲基化（minfi包处理）；通过conumee R包从甲基化芯片数据推断染色体拷贝数改变（CNA）；使用DESeq2进行差异表达分析。
研究结果如下：
患者数据：原发队列包括147例患者，含133例原发性脑膜瘤和14例非对应复发性肿瘤，按2016版CNS WHO分类标准分类。次要队列由110例公开可用的原发性脑膜瘤组成。在修改后的整合分级方案下，72例（72.0%）归类为WHO 1级，25例（25.0%）为WHO 2级，3例（3.0%）为WHO 3级。致病性pTERT突变（C228T或C250T）见于9.1%的病例。1例肿瘤检测到CDKN2A/B纯合缺失。
Calbindin表达：使用改良H-score系统，28.8%的原发性脑膜瘤检测到Calb免疫反应性。肿瘤内Calb免疫反应性主要同时见于细胞质和细胞核，最常见为弥漫性细胞染色模式。正常脑膜细胞在13例中的9例未见免疫反应性。在原发队列中，Calb高表达组占18.2%。在独立次要队列中，21例（19.1%）显示中等或强CALB1转录本水平，与蛋白水平的分布密切吻合。
临床病理参数的系统评估显示，在两个队列的单变量分析中，Calb表达与患者性别均无显著关联。同样，Calb高表达与低表达肿瘤患者的中位年龄无显著差异。未观察到Calb高表达肿瘤的神经解剖学定位偏好。核分裂活性和增殖指数未能区分Calb低表达和高表达肿瘤。在原发队列中，跨WHO级别的比较未显示显著差异。在次要队列中，调整临床-分子模型协变量后，组织学WHO 2级与较高的CALB1转录本表达相关（p=0.023）。在原发队列中，脊索样肿瘤的Calb H-score高于非典型肿瘤（p=0.038），该关联在多变量模型中同样被观察到（p=0.015）。基于UMAP的降维分析显示Calb阳性和阴性肿瘤广泛分布，未形成独特的甲基化聚类。相对于甲基化亚类"Benign 1"，"Benign 3"与较高的CALB1转录本表达相关（p<0.05），而"Intermediate B"与较低表达相关（p=0.013）。Calb表达与TERT启动子突变状态或IMS类别均无关联。在主要分子驱动改变中，多重检验调整后未发现与CALB1表达保持统计学显著的关联。
CALB1 CpG位点甲基化分析：在Illumina EPIC 850K阵列上代表的12个CALB1相关CpG位点中，7个探针与450K阵列共享并纳入分析。阳性和阴性脑膜瘤之间在三个CpG位点（cg26290632、cg12402251、cg18335796）观察到显著差异，位于CALB1第1外显子或内含子内，其中cg18335796显示最强的相对低甲基化（p=2e?5）。CALB1 CpG评分（三个位点的均值）较低值与较高的转录本表达相关（p=0.0084）。ESR2表达在6q缺失和14q缺失的肿瘤中较低（分别为p=1.94e?5和p=0.019）。ESR1表达在14q缺失的肿瘤中较高（p=0.029），与6q缺失无关联。ESR1和ESR2转录本表达与CALB1转录本表达均无显著关联。
Calretinin表达：Calr蛋白表达稀疏，仅限于小部分肿瘤（132例原发病例中的12例，9.1%），表现为孤立的散在阳性肿瘤细胞。
孕激素受体表达：在所有133例原发性脑膜瘤中评估核PR表达，48.1%为阳性。PR表达增加与分级呈负相关，WHO 3级脑膜瘤的PR评分显著低于WHO 2级肿瘤（p=0.0079），脊索样脑膜瘤（WHO 2级）具有最高的平均PR H-score。PR表达与核分裂活性之间呈负相关。强PR阳性脑膜瘤更常见于年轻患者（p=0.025）。PR表达未预测原发性全切除WHO 2级脑膜瘤的PFS。
脑膜瘤预后影响因素：在原发队列中，高Calb表达、次全切除和WHO 3级肿瘤与较短的PFS显著相关。调整年龄、性别、WHO分级、切除范围和原发与复发疾病状态后，高Calb表达仍与较短的PFS相关（HR 2.62，95% CI 1.21–5.69；nominal p=0.015）。重要的是，高Calb表达与较短PFS的关联在限制于原发性、全切除、未放疗、组织学WHO 2级脑膜瘤的分析中同样被观察到。在进一步限制于仅按核分裂活性增加分类的脑膜瘤（排除脊索样和透明细胞亚型以及基于脑侵犯或其他非核分裂标准升级的肿瘤）后，该关联持续存在（p=0.011）。在次要队列中，限制性多变量模型包括年龄、性别、切除范围、修改后的整合WHO分级和CALB1表达组，较高的WHO分级仍与较短的PFS相关，而CALB1表达无统计学显著性（HR 0.28，95% CI 0.06–1.30；nominal p=0.10）。限制于原发性全切除WHO 1级脑膜瘤的Kaplan–Meier分析显示CALB1表达与PFS无显著关联，但Calb高表达肿瘤显示较短PFS的数值趋势（p=0.17）。
染色体臂6q缺失相关基因表达差异：在110例肿瘤中鉴定出11例6q缺失，包括局灶性（n=1）、节段性（n=8）和整臂缺失（n=2）。将携带节段性或整臂6q缺失的肿瘤与所有剩余合格肿瘤比较，发现多个基因的差异表达，包括CALB1和转录因子NKX2-5和SOX11。在合并1p/22q缺失的肿瘤中，CALB1在伴有额外6q缺失的肿瘤上调基因中显示最强的上调和最低的FDR调整p值。在染色体聚焦的多变量线性回归模型中，调整协变量后6q缺失仍与较高的CALB1转录本表达相关（nominal p=0.037）。在包含批次、1p、6q和22q状态、组织学WHO分级、年龄、性别、TERT启动子状态、甲基化亚类和CALB1 CpG评分的独立临床-分子模型中，6q缺失同样与较高的CALB1表达相关（p=0.023）。
讨论部分总结：本研究在两个独立队列中证明脑膜瘤的特定亚群存在Calb蛋白表达和CALB1转录本水平升高。约30%的原发肿瘤显示可检测的Calb免疫反应性或CALB1转录本水平升高，高表达组约占18–19%。正常脑膜细胞显示Calb免疫反应性缺失或主要为弱且稀疏。在原发队列中，调整所纳入的临床病理变量后，高Calb蛋白表达与较短的PFS相关。该关联在限制于组织学WHO 2级脑膜瘤的分析中同样被观察到。相比之下，CALB1转录本表达在次要队列的限制性多变量模型中与PFS无显著关联。这些发现支持进一步研究Calb免疫组织化学作为风险分层的候选辅助标志物，尤其是在组织学WHO 2级脑膜瘤中。Calb表达此前已在多种肿瘤实体中被报道，本研究将这些观察扩展到脑膜瘤，与Khan等的转录组发现一致，与早期小队列免疫组织化学观察相反。相关钙结合蛋白Calr的表达罕见且主要限于散在肿瘤细胞。在次要队列中，多变量临床-分子分析确定了较高CALB1表达与染色体臂6q缺失、组织学WHO 2级、甲基化亚类"Benign 3"及CALB1相关CpG位点低甲基化的关联，而甲基化亚类"Intermediate B"显示反向关联。尽管脊索样脑膜瘤表现出特别高的Calb表达，但排除脊索样肿瘤的限制性亚组中预后关联持续存在，提示其不限于该组织学亚型。总之，这些发现将CALB1表达与超越传统组织病理学特征的特定染色体和表观遗传特征相关联。CALB1是否积极贡献于该程序或主要代表下游标志物仍未解决。其他细胞系统的实验研究表明Calb可通过抑制caspase-3活性促进细胞存活。此外，Calb已被报道通过激活PI3K/AKT信号通路减少凋亡并促进细胞衰老逃逸。值得注意的是，本研究中的CALB1表达与核分裂活性增加或Ki-67指数无关，反对以增殖驱动的表型为主。相反，既往研究已证明在侵袭性、耐药的原代脑膜瘤细胞系亚组中核caspase-3表达降低，同时转录组证据提示CALB1过表达，支持CALB1表达可能通过增强细胞存活和抗凋亡而非增加增殖来促进肿瘤持续存在的假设。Calb表达的预后相关性在不同肿瘤实体中似乎高度依赖于背景。PR表达与既往报道一致，显示与WHO分级呈负相关。PR表达在单变量Cox和Kaplan–Meier分析中与PFS无显著关联。研究数据支持DNA甲基化对CALB1调控的可能贡献。内含子和第1外显子CpG位点的低甲基化与CALB1表达增加相关，提示表观遗传对其调控的贡献。除DNA甲基化外，CALB1调控还与ΔFosB、维甲酸、维生素D3、内源性逆转录病毒和雌激素信号相关。ESR1和ESR2分别位于染色体臂6q和14q。在本分析中，6q缺失与较低的ESR2表达相关，但与ESR1表达无显著改变。14q缺失与较低的ESR2和较高的ESR1表达相关。然而，两种受体转录本在批次调整的线性或秩基分析中均未显示与CALB1表达的显著关联。这些发现不支持雌激素受体转录本丰度与CALB1上调之间的简单关系。在临床-分子多变量模型中，调整所纳入的临床病理变量、甲基化亚类、选定CNA和源自CALB1相关CpG位点的甲基化评分后，染色体臂6q缺失仍与较高的CALB1表达相关。独立的染色体聚焦模型在调整额外复发性CNA后同样支持该关联。总之，这些发现将脑膜瘤中的CALB1表达与特定表观遗传和染色体特征相关联。其分子机制仍未解决，需要功能研究来确定CALB1是贡献于相关生物学表型还是主要代表下游标志物。
研究结论翻译：总之，这些发现支持Calb蛋白表达的潜在预后相关性，尤其是在组织学WHO 2级脑膜瘤中，并在互补队列中将CALB1转录本表达与特定分子特征相关联。因此，Calb免疫组织化学可能为在整合分子检测之前对这一临床异质性肿瘤类型进行风险分层提供实用工具。
