DNA损伤组学：概念、全基因组定位技术与研究展望

《Clinical Cancer Bulletin》：DNA damage omics: concepts, genome-wide mapping technologies, and research perspectives

　　

DNA损伤威胁基因组完整性，并参与肿瘤、衰老及其他疾病的发生。传统检测方法奠定了DNA损伤研究的基础，但多提供低通量、定性或间接的测量结果，无法在全基因组范围内定位损伤位点。DNA损伤组学（DNA damage omics）通过将损伤特异性富集或酶促标记与下一代测序（NGS）相结合，以全基因组分辨率、并在部分情况下以单碱基或单细胞分辨率对损伤进行图谱分析，从而弥补了上述局限。本综述首先总结DNA损伤的主要来源与类型以及经典检测方法的能力。随后按照捕获原理、分辨率和生物学读出，对双链断裂（DSB）、单链断裂（SSB）、DNA交联和碱基损伤的测序策略进行系统梳理。针对每一类损伤，研究人员将检测方法所捕获的分子事件与其实验要求、主要偏倚来源和最适应用相关联，从而区分直接损伤定位与修复中间产物或下游基因组后果的测量。在上述方法中，与染色质、表观基因组、转录组、单细胞和空间数据的整合表明，DNA损伤呈非随机分布，并受序列背景、染色质状态和三维基因组组织塑造。本综述还比较了主要技术限制，包括富集偏倚、低起始量样本中灵敏度有限、重复序列或极端GC含量区域覆盖不完全，以及标准化分析流程的缺乏。新兴的长读长、时空和单细胞方法有望改善损伤到突变的映射，并支持生物标志物发现和治疗分层。通过将检测原理与适当的生物学问题相联系并明确界定当前局限，本综述为选择DNA损伤测序方法及推进其机制与转化应用提供了实用框架。

引言部分回顾了DNA作为遗传信息载体的重要性及其结构稳定性对个体发育、组织功能和物种生存的关键意义。自20世纪50年代Watson和Crick揭示DNA双螺旋结构以来，DNA损伤应答（DDR）与修复机制研究成为分子生物学核心领域。1956年光复活酶的发现首次揭示了紫外线（UV）诱导DNA损伤的光依赖性修复机制，此后碱基切除修复（BER）、核苷酸切除修复（NER）和错配修复（MMR）等关键修复通路相继被鉴定。2015年该领域获诺贝尔化学奖，相关研究已应用于放射生物学、肿瘤治疗、遗传病研究和基因组稳定性维持等多个领域。准确检测和评估DNA损伤是基因组稳定性研究的基本挑战。传统方法如DNA凝胶电泳和免疫荧光为DNA损伤可视化提供了重要工具，但这些技术多为低通量、定性或半定量，限制了其在不同细胞条件、空间位置和时间维度上全面分析DNA损伤的能力。

DNA损伤的来源、类型及经典检测方法部分指出，基因组稳定性持续受到内外因素威胁，这些因素通过直接或间接机制导致DNA结构损伤，破坏细胞功能并促进疾病发生。直接来源包括：物理因素方面，UVB（280–315 nm）通过光化学反应诱导相邻嘧啶碱基间形成环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和(6–4)光产物（6–4PP），这些扭曲结构干扰复制叉推进并通过激活NER通路触发DNA损伤修复应答；电离辐射（如γ射线、X射线和重离子）可直接断裂DNA磷酸二酯骨架导致链断裂，也可通过电离水分子产生反应性自由基间接诱导碱基损伤、链断裂和DNA-蛋白质交联（DPC）。化学因素方面，烷基化剂在生理条件下自发释放烷基碳正离子，通过亲核取代反应（SN1机制）攻击DNA碱基的O或N原子，导致碱基损伤和链断裂；以铂类化合物为代表的交联剂经水解活化后与DNA嘌呤碱基共价结合，引起螺旋扭曲并严重损害解旋酶活性和复制叉进程。生物因素方面，病毒整合可干扰DNA修复通路，如高危型人乳头瘤病毒（HPV）16和18型通过其癌基因产物E6/E7蛋白破坏关键宿主修复蛋白；自主转座子如LINE-1通过涉及逆转录的"复制-粘贴"机制移动，直接导致插入突变。间接来源包括内源性代谢副产物、环境毒素和酶活性异常。活性氧（ROS）和活性氮（RNS）作为正常代谢副产物，通过攻击DNA碱基或糖骨架导致氧化损伤和链断裂；砷等重金属通过破坏修复通路显著降低BER效率；拓扑异构酶催化错误可导致DPC；DNA聚合酶在微卫星区域重复序列上易发生滑动，导致插入/缺失突变；MMR系统缺陷进一步加剧这种不稳定性。

DNA损伤类型部分归纳了上述来源共同导致的复杂损伤谱，包括但不限于：DNA链断裂，分为SSB和DSB。哺乳动物细胞每天自发产生约10⁴个SSB，其修复依赖BER通路的正常功能；未修复的SSB在复制叉崩溃时可导致DSB。DSB是最具细胞毒性的损伤类型之一，其积累可导致错误修复过程，引起染色体易位、缺失、基因融合和其他基因组重排。DSB的主要修复机制为非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）。碱基修饰包括氧化损伤（如8-氧代-2′-脱氧鸟苷[8-oxoG]）、烷基化（如O⁶-甲基鸟嘌呤）、甲基化、脱氨基（C→U转换）和无碱基（脱嘌呤/脱嘧啶[AP]）位点，这些修饰在DNA复制过程中若发生错配可导致突变率升高。DNA交联指链间交联（ICL）、链内交联（CL）或DPC。ICL未修复时阻断复制叉并可导致DSB；DPC阻止修复蛋白到达损伤位点；CL增加突变负荷，最终触发癌变或细胞死亡。

经典DNA损伤检测方法部分将传统方法分为三类：凝胶电泳基于电荷效应和分子筛效应在电场中分离DNA分子，适用于大规模损伤分析，新兴技术如Comet-FISH和CometChIP进一步提高了定位精度和标准化程度；免疫荧光标记使用针对损伤应答标志物（如γ-H2AX）的抗体，通过显微镜或流式细胞术定量核焦点，广泛用于评估DDR信号，但γ-H2AX为间接标志物，其丰度和空间扩散不应等同于DSB的一对一计数或核苷酸级图谱；显微镜直接观察方法从数量和结构两方面评估染色体异常，涉及秋水仙素处理、低渗固定和染色，适用于宏观水平损伤评估，仍是染色体异常诊断的传统可靠方法。

经典DNA损伤检测方法的局限性部分指出，尽管这些技术鉴定了多种DNA损伤和片段大小并显著推进了领域发展，但存在若干局限：当前方法多为定性或半定量，缺乏提供DNA损伤绝对定量和生成全基因组分布图谱的能力，难以在不同实验室数据间进行直接比较；这些方法无法精确确定损伤的基因组位置，研究人员难以将检测到的DNA损伤与基因组特定区域（如编码区、调控元件或异染色质区域）相关联，限制了对DNA损伤生物学效应及其在表观遗传调控中特定作用的全面理解；传统方法的低通量特性严重限制了大规模筛选和全基因组扫描，难以探索基因组不稳定性的时空动态和系统关系。这些方法学局限凸显了开发先进DNA损伤分析技术的必要性，核心在于将DNA损伤检测与高通量测序整合，以实现单碱基分辨率、全基因组绝对定量以及损伤位点与表观遗传特征的综合分析。

DNA损伤组学部分阐述，DNA损伤组学旨在分析DNA损伤的身份、基因组分布以及在适当校准条件下的丰度。损伤特异性生化识别与测序相结合，根据检测方法的不同获得片段、核苷酸或单细胞分辨率的图谱。直接损伤图谱必须与修复中间产物、DDR信号和累积突变的测量相区分，这些互补读出报告基因组损伤及其后果的不同阶段。在此基础上，DNA损伤组学进一步将损伤位点与多维分子环境整合，包括染色质可及性、组蛋白修饰景观、转录活跃区域和调控网络。这种高分辨率注释允许将损伤信息精确映射到基因本体、功能基因组元件（如启动子、增强子和绝缘子）和表观遗传修饰域，揭示DNA损伤与基因组功能架构之间的深层相互作用，并为基因组不稳定性驱动的病理过程（如肿瘤发生、免疫逃逸和细胞命运决定）提供新见解。

引入DNA损伤组学的必要性部分从三个方面论述。DNA损伤事件的基因组定位方面，DNA损伤发生在基因组特定位置（如基因或异染色质区域），这些位置对细胞功能和DNA修复能力具有关键影响，缺乏高分辨率基因组定位则难以用传统技术鉴定这些特征。使用高分辨率损伤测序方法，研究人员可精确确定DNA损伤的基因组坐标并分析其与功能元件的重叠，揭示潜在调控脆弱点或损伤应答热点。例如BLESS技术首创了DSB的全基因组核苷酸级定位，GUIDE-seq进一步将方法扩展至CRISPR-Cas脱靶切割位点的精确全基因组定位。DNA损伤负荷的绝对定量方面，全基因组定位本身不提供绝对损伤计数。多数富集型检测测量相对信号，受捕获效率、文库复杂度和测序深度影响。绝对定量需要独立校准的标准品，如定量DSB测序（qDSB-seq）中使用的诱导断裂 spike-in。类似地，连续损伤和修复测量可支持动力学分析，但切除修复产物的丰度不等同于残余损伤负荷。例如XR-seq技术可动态监测切除修复图谱，揭示UV损伤全局修复与转录偶联修复之间的差异；XR-seq捕获含损伤的切除寡核苷酸，因此报告的是正在进行的NER而非所有未修复损伤，将其与直接损伤定位配对有助于分离损伤形成与修复活性。多组学数据整合方面，DNA损伤图谱与转录组、表观基因组和蛋白质组测量的整合可将损伤与转录应答、染色质可及性和修复因子招募相关联，产生关于损伤易感性和修复的机制假设；建立因果关系还需时间采样或受控扰动，仅共定位不足以证明损伤导致了转录或表型变化。Paired-Damage-seq在单细胞中联合分析DNA损伤和转录组，将损伤相关区域与细胞特异性转录状态相关联。

DNA损伤组学的关键进展部分系统梳理了各类损伤的测序策略。DSB测序方面，基于高通量测序的DSB检测方法根据捕获策略分为四类。直接标记DSB末端的方法中，接头连接法先将断裂末端补平并加腺嘌呤（A）尾，再与特定接头连接以标记和富集DNA损伤位点，根据接头工程化方式分为四类：生物素化阻断接头（如S1-seq）、生物素化发夹接头（如BLESS、END-seq和i-BLESS）、P5/P7接头（如DSBCapture和INDUCE-seq）以及T7启动子接头（如BLISS和s-BLISS）。BLESS首次实现DSB末端的单碱基分辨率原位标记，其关键创新在于生物素化接头的特异性连接以直接捕获断裂位点，但依赖凝胶回收限制了实际分辨率；改进方法DSBCapture采用修饰的P5 Illumina接头进行原位连接，省去常规文库制备步骤并显著提高检测灵敏度。样本适应性方面的关键突破在于固相载体的创新，S1-seq和END-seq采用琼脂糖包埋策略，绕过细胞核的物理尺寸限制同时保持天然三维基因组组织；END-seq使用双发夹接头，不仅能精确映射断裂位点还可详细分析DNA末端切除动力学；i-BLESS将细胞固定在100–300 μm琼脂糖微珠中，克服了小基因组应用的局限。定量能力提升方面，BLISS通过引入独特分子标识符（UMI）实现DSB相对定量，并结合T7介导的体外转录与线性扩增显著提高低丰度DSB的检测灵敏度；其改进版s-BLISS以细胞或核悬液系统替代固相支持，在文库制备效率和扩增均一性方面大幅提升。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的碱基掺入法中，TdT作为模板非依赖性DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸添加至DNA断裂的3′-OH末端，对单链和双链DNA（包括悬垂、凹陷和平末端）均具有底物兼容性，其模板非依赖性随机加尾活性为高灵敏度DSB检测方法提供了分子基础。根据添加碱基类型分为两类：生物素化单链或发夹结构寡核苷酸（如TrAEL-seq、BrITL、DSB-seq和DBrIC）以及CT富集多核苷酸序列（如DEtail-seq）；Break-seq采用不同方法，在修复过程中直接将生物素-14-dATP掺入DSB末端。值得注意的是，TdT对ssDNA末端的核苷酸添加效率远高于平末端，DEtail-seq利用adaptase高效连接ssDNA 3′末端的特性有效处理各种末端类型；Break-seq依赖T4 DNA聚合酶，其掺入效率受DNA末端结构约束，仅能捕获5′悬垂DSB。蛋白质标记方法中，γ-H2AX ChIP-seq和DISCOVER-seq检测损伤相关染色质或修复因子招募而非直接标记DNA末端；γ-H2AX ChIP-seq测量DDR信号相关染色质域，其范围限制了个体断裂的精确定位；DISCOVER-seq使用MRE11 ChIP-seq鉴定CRISPR诱导DSB位点，MRE11相关读段末端可以单碱基分辨率解析核酸酶切割位置，但信号反映修复因子招募而非断裂末端的直接化学捕获。直接末端标记检测可定位断裂末端，而蛋白质相关检测测量损伤应答因子的招募或扩散，位置分辨率取决于分子读出和分析策略而非是否使用染色质免疫沉淀。定量方面，qDSB-seq使用校准的spike-in DSB估计每细胞绝对断裂频率及其基因组坐标；BLISS使用UMI支持相对定量。样本制备、末端可及性、抗体性能和修复动力学可影响回收率和可比性，因此需对每种方案评估起始量需求和与原代或低起始量样本的兼容性。DSB修复方法方面，NHEJ介导的DSB修复过程中末端连接的易错性常导致基因组不稳定性，包括染色体易位和插入或缺失。其核心机制涉及Ku70/Ku80异二聚体首先识别并结合断裂DNA末端，随后招募DNA-PKcs形成完整酶复合物，经artemis等酶加工DNA末端后，XRCC4–LIG4–XLF复合物被招募以直接连接末端，即使缺乏同源模板。由于该修复通路对微同源性依赖较小且修复酶耐受各种DNA末端结构，修复连接处常发生序列改变。基于NHEJ介导末端连接的易错性，近期高通量DSB检测方法引入外源"诱饵DNA"创建"诱饵-猎物"嵌合体，实现无偏的全基因组断裂位点捕获。根据诱饵DNA的分子形式及其递送方式分为四类：含I-SceI识别序列的诱饵DSB（包括HTGTS、LAM-HTGTS、TC-seq及衍生的PEM-seq、CSR-HTGTS和HTGTS-V(D)J-seq）；双链寡核苷酸标记方法如GUIDE-seq；整合酶缺陷型慢病毒载体（IDLV），如IDLV-Capture；腺相关病毒（AAV）载体系统如ITR-seq。工程化核酸酶诱饵系统以将I-SceI识别序列整合至特定基因组位点为核心，诱导DSB作为检测易位事件的"诱饵"。GUIDE-seq创新性使用平末端双链寡脱氧核苷酸（dsODN），通过NHEJ通路被动掺入RNA引导核酸酶（RGN）诱导的DSB中，实现脱靶切割位点的全基因组定位并克服预定诱饵位点的局限，但平末端连接易受末端修复酶影响。IDLV-Capture利用IDLV通过NHEJ通路被动整合至DSB位点形成稳定标记，但缺乏靶向特异性意味着其标记所有DSB包括脱靶位点和自发断裂。ITR-seq利用AAV载体的倒置末端重复序列（ITR）作为分子锚，提供基因组编辑事件的高灵敏度和定量检测。需强调这些方法有两个主要局限：检测效率很大程度上取决于细胞NHEJ修复通路的完整性，对通过HR等其他通路修复的DSB灵敏度较低；基于病毒载体的方法虽能在核内实现模板驱动的动态修复并为研究修复机制提供独特优势，但其灵敏度受载体转导靶细胞效率约束。CRISPR-Cas9脱靶方法方面，CRISPR-Cas9系统的靶向特异性主要取决于单引导RNA（sgRNA）的靶向序列和原间隔 adjacent基序（PAM）。sgRNA通过碱基配对识别靶DNA链，而PAM通过Cas9 C端结构域（CTD）中的精氨酸残基特异性识别非靶链（NTS）上的"GG"二核苷酸，该相互作用触发局部DNA双链解旋并引导sgRNA与靶链（TS）形成R-loop。研究表明Cas9在催化活性上表现出显著的空间耐受性，其脱靶效应源于关键机制：对PAM远端错配的高耐受性、sgRNA序列中部区域的调控盲区以及非经典PAM的激活。近期CRISPR-Cas9脱靶检测方法根据测试环境分为两类：体外无细胞系统（如Digenome-seq、SITE-seq和CIRCLE-seq）和染色质环境（如DIG-seq和OliTag-seq）。使用纯化基因组DNA（gDNA）在受控生化环境中模拟Cas9活性可绕过细胞环境约束。Digenome-seq捕获含RNA/DNA凸起的潜在脱靶位点，灵敏度高可检测极低频率的脱靶位点；SITE-seq应用浓度梯度同时捕获高频和低频脱靶事件，结合末端标记和富集技术降低背景噪声；CIRCLE-seq在个性化医疗中灵敏度高，可鉴定与单核苷酸多态性相关的细胞类型特异性脱靶位点。基于染色质的检测技术捕获核内表观遗传特征，更准确反映基因组编辑的生理微环境。DIG-seq将染色质DNA测序与体外Cas9切割整合，部分揭示染色质结构如何降低脱靶效应，其关键创新在于使用保留组蛋白和染色质结构的DNA；OliTag-seq作为细胞内检测方法，通过优化dsODN结构和使用三引物扩增大幅提高灵敏度，在诱导多能干细胞（iPSC）中因开放染色质状态尤为有效，与HDAC抑制剂联合使用时检测能力进一步增强。

SSB测序部分指出，SSB是常见DNA损伤形式，其修复对维持基因组稳定性至关重要。未修复的SSB可破坏DNA复制和转录，导致RNA聚合酶停滞和复制叉崩溃，可能产生更有害的DSB，干扰基因表达、促进基因组不稳定性并最终导致细胞死亡。SSB相关测序方法采用切口平移、可及3′-OH末端直接捕获或将单链损伤转化为可测序末端，其读出不同：部分定位物理切口，另一些检测修复合成、单链缺口或实验产生的切口酶切割位点。切口平移方法中，切口平移偶联DNA聚合酶I的5′→3′外切酶和聚合酶活性，替换已有切口下游的核苷酸，掺入标记核苷酸使相关DNA得以富集。当反应体系中存在生物素或地高辛标记的脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）时，这些标记核苷酸掺入新合成的DNA链产生标记DNA探针，该策略构成SSB-seq、DENT-seq和Nick-seq等测序方法的基础。SSB-seq在切口平移过程中掺入地高辛标记核苷酸并富集所得片段，提供区域而非单核苷酸定位；DENT-seq结合简并核苷酸掺入与富集切口平移，从工程化突变特征推断切口的链和核苷酸位置；Nick-seq通过交叉互补的切口平移和TdT加尾信号鉴定损伤衍生的切口，以更复杂的流程为代价提高位置特异性。3′-OH捕获方法中，SSiNGLe和GLOE-seq利用可及的3′-OH末端。游离3′-OH是捕获底物而非每个SSB的通用化学特征：氧化阻断末端可能需要末端加工，暴露的DSB末端也可贡献信号，因此需要适当的末端化学对照。SSiNGLe使用MNase产生的3′-磷酸片段化末端降低背景，并通过TdT介导的多聚(A)加尾标记可及3′-OH末端，相邻腺嘌呤可在精确末端指认中产生不确定性；GLOE-seq在变性DNA中将生物素化接头连接至暴露的3′-OH末端，实现断裂和酶转化损伤的核苷酸分辨率定位。由于这些化学特性并非天然独属于分离的SSB，解释时需关注DSB污染、DNA制备伪影和呈递给标记反应的底物。修复合成和其他损伤相关读出提供互补信息：SAR-seq富集EdU标记的修复合成轨迹，ddN-S1-END-seq用双脱氧核苷稳定短暂修复中间体并将易感单链结构转化为可测序DSB末端，这些信号不应被解释为分离切口的未扰动普查；Paired-Damage-seq将可修复标记的损伤与同一细胞的转录组关联；HiDEF-seq通过重复单分子测序解析单链错配和损伤相关序列变化，但不直接枚举SSB末端。其他高分辨率SSB定位方法中，STEEL-seq使用工程化易错聚合酶Sloppymerase在切口下游引入序列特征同时保留侧翼序列背景，与Illumina、PacBio和纳米孔测序的兼容性为研究切口位置和分子背景提供灵活性，其位置分辨率取决于周围模板序列且并非均匀单核苷酸；PEG-seq在预先存在的断裂被阻断且纯化DNA暴露于切口编辑器后捕获3′末端，UMI支持去除重复，读段起点鉴定切口相关位点，局部加工可拓宽信号，因此已发表的peak-calling方法包含小基因组窗口；nDigenome-seq利用切口酶处理DNA全基因组测序中的链特异性读段起点模式鉴定核苷酸定位的切割位点。两者均适用于全基因组发现潜在切口酶脱靶位点，但原始验证为体外实验，命中需在细胞中确认，这些检测测量患者活检中内源性SSB负荷的性能尚待确定。STEEL-seq、PEG-seq和nDigenome-seq补充了SSB-seq、DENT-seq、Nick-seq、SSiNGLe和GLOE-seq，方法选择应遵循生物学问题：内源性游离末端定位、酶诱导切口检测和修复合成分析是相关但不同的任务，坐标精度高的方案对阻断末端、低频损伤或不可及基因组区域的灵敏度可能仍然有限。

DNA交联损伤测序部分将交联分为三类：链内交联（CL），通常以UVB/UVC辐射诱导的CPD和6–4PP为代表，扭曲DNA双螺旋小沟，阻碍RNA聚合酶II（Pol II）进程并触发错误的跨损伤合成（TLS）；链间交联（ICL），如双功能烷基化剂诱导的交联，通过烷基化靶向鸟嘌呤N7位点共价连接两条互补DNA链，严重阻碍DNA解旋；DNA-蛋白质交联（DPC），由内源性代谢副产物、外源毒素或辐射诱导，形成永久连接蛋白质与DNA的共价键，不仅破坏染色质动态还可不可逆地锚定复制叉。当前DNA交联检测技术分为五类。免疫沉淀方法中，ChIP-chip是首个实现UV诱导DNA损伤全基因组定位的方法，依赖CPD特异性抗体的免疫亲和捕获；3D-DIP-Chip将ChIP的抗体特异性与微阵列的高通量检测能力整合，适用于多种类型，但两种方法的分辨率均受DNA片段大小和探针密度限制，无法精确损伤定位；DDIP-seq利用CPD特异性单克隆抗体免疫沉淀DNA片段，随后通过NGS分析生成人细胞核和线粒体DNA中CPD损伤图谱。然而这些方法受免疫沉淀固有局限约束，灵敏度和特异性高度依赖抗体质量且缺乏单碱基分辨率，尽管如此抗体介导的富集和全基因组定位策略为高精度DNA损伤定位技术的发展奠定了重要基础。基于NER通路的方法中，UV和化疗药物引起的DNA交联损伤主要通过NER通路修复，该高度保守过程精确识别并切除受损DNA：XPC–HR23B复合物识别损伤后招募TFIIH解旋DNA形成开放复合物，XPF–ERCC1和XPG切除受损链，随后DNA聚合酶δ/ε介导的缺口填充和DNA连接酶催化的磷酸二酯键形成完成修复。人细胞中UV诱导的CPD通过NER通路修复，产生特征性24–32 nt切除寡核苷酸，包含损伤及其侧翼序列。XR-seq利用该分子特征，使用TFIIH或XPG特异性抗体进行初始免疫沉淀，捕获含损伤的切除寡核苷酸片段，随后进行第二轮损伤特异性免疫沉淀；传统XR-seq依赖特定光复活酶逆转UV诱导损伤，限制了其对顺铂等不可逆DNA损伤的应用；tXR-seq的引入通过使用TLS聚合酶在NER产生的缺口处直接合成互补链绕过损伤逆转需求，其优势在于可使用不同TLS聚合酶靶向特定损伤类型，如Pol κ优先处理N2-烷基鸟嘌呤损伤。需强调NER过程中产生的寡核苷酸片段被后续修复机制快速清除，XR-seq和tXR-seq仅捕获特定时间点已切除损伤位点的分布。ATL-XR-seq通过消除抗体免疫沉淀克服潜在技术偏倚，其创新在于用3′-dA尾和5′-接头单端连接替代传统双端连接，防止PCR过程中接头二聚体形成，多聚-dA尾的固有长度异质性也作为分子标识符，实现更多修复热点的定位。聚合酶停滞方法中，化学损伤、ICL或氧化损伤可在复制或延伸过程中导致DNA聚合酶停滞，产生特定合成终止位点，标记复制终点可鉴定损伤位点。Damage-seq利用顺铂交联诱导的聚合酶停滞在体外复制过程中精确映射DNA损伤位点；衍生物Cisplatin-seq的特征是引入HMGB1结构域蛋白A，特异性结合顺铂-DNA加合物引起的DNA沟和螺旋扭曲；PADD-seq将ChIP技术巧妙整合到Damage-seq流程中，实现特定蛋白质-损伤相互作用图谱的构建；为提高低水平损伤的灵敏度，HS-Damage-seq在PCR前增加消减杂交步骤去除未损伤DNA片段，显著降低DNA输入量。值得注意的是Cisplatin-seq专为检测顺铂诱导损伤设计，而Damage-seq和HS-Damage-seq最初分别应用于顺铂和UV诱导损伤，但均已扩展至检测多种DNA加合物。T4内切核酸酶V方法中，T4内切核酸酶V是双功能DNA糖基化酶，具有N-糖基化酶和AP裂合酶活性，特异性识别CPD，首先通过糖基化酶活性切割CPD中5′嘧啶的N-糖苷键释放二聚体并产生AP位点，其AP裂合酶活性随后通过β-消除切割磷酸二酯键，产生5′-磷酸和3′-α,β-不饱和醛并形成单核苷酸缺口。基于此开发了CPD-seq、AdductSeq和Circle-Damage-seq。T4内切核酸酶V产生的3′-α,β-不饱和醛是阻断的3′末端，阻止DNA连接酶接头连接和DNA聚合酶起始；APE1的3′-末端清理活性去除阻断基团，将其转化为适合后续接头连接的标准3′-OH末端。CPD-seq和AdductSeq均采用上述双酶系统但捕获策略不同：CPD-seq通过接头连接捕获暴露的3′-OH末端，可检测转录因子介导的CPD形成增强；AdductSeq利用光复活酶消除CPD损伤后应用半随机引物延伸产生双链末端，其主要优势在于可定量罕见损伤。为提高测序灵敏度，Circle-Damage-seq在T4内切核酸酶V处理前用T4 DNA连接酶环化线性DNA片段，随后用S1核酸酶将单链切口转化为DSB，该环化策略选择性去除未损伤DNA，较常规CPD-seq降低背景信号。紫外损伤内切核酸酶（UVDE）方法中，UVDE作为识别CPD和6–4PP的DNA修复酶，在损伤5′端引入可修复的单链切口，为后续切除修复创造起点并最终释放损伤片段。基于UVDE的测序方法包括Excision-seq和UVDE-seq。Excision-seq在UVDE处理后，损伤特异性光复活酶将二聚体恢复为正常嘧啶以供后续接头连接，CPD和6–4PP的区分取决于所用特定光复活酶；UVDE-seq中首先使用CPD光复活酶从基因组中去除丰度高的CPD损伤，确保UVDE仅切割剩余的6–4PP和TA-PP，实现非CPD UV诱导损伤的检测。两种方法共同缺点在于依赖高剂量UV诱导损伤，可造成基因毒性干扰；为此Post-digestion Excision-seq用切除酶处理已连接接头的片段化DNA，在PCR前去除损伤片段，适用于生理相关损伤。

DNA碱基损伤测序部分指出，高通量测序的最新创新大幅提高了碱基损伤检测的灵敏度和规模，在氧化损伤、嵌入核糖核苷酸（rNMP）和AP位点三个主要方向取得特别进展。氧化损伤方面，DNA碱基中鸟嘌呤氧化还原电位最低，尤其易受ROS攻击。羟自由基等通过自由基加成或单电子氧化优先靶向鸟嘌呤C8位，导致8-oxodG形成。其致突变性源于构象异构化（即syn构象），导致DNA复制过程中与腺嘌呤错配，产生G:C到T:A颠换突变。由于其在细胞中的稳定性和与氧化应激的强关联，8-oxodG被认为是DNA氧化损伤的主要生物标志物。亲和富集方法中，OxiDIP-seq使用抗8-oxodG抗体富集含氧化碱基的DNA片段；enTRAP-seq使用催化失活OGG1K249Q突变体结合并富集含8-oxodG的DNA，抗体识别和酶捕获是不同捕获策略，其底物特异性和背景须分别评估。化学标记方法中，8-oxodG氧化形成的亲电中间体可被伯胺亲核试剂捕获，形成稳定胺加合物。基于此原理，OG-seq使用K₂IrBr₆氧化8-oxoG生成亲电中间体，随后由伯胺-生物素化合物捕获并通过链霉亲和素-生物素亲和富集；该方法虽避免抗体相关低效率，但分辨率限于片段水平约150 bp。为提高分辨率，CLAPS-seq在OG-seq基础上引入高保真聚合酶停滞策略，高保真DNA聚合酶在引物延伸过程中精确停滞于8-oxodG损伤紧邻上游的核苷酸，通过测量所得延伸产物长度实现损伤位点单碱基分辨率定位。损伤类型转换方法中，当前使用酶特异性切除8-oxodG并转化为AP位点的测序方法包括Click-code-seq、OGG1-AP-seq和OGAP-seq。Click-code-seq将酶促损伤加工与化学可寻址核苷酸安装及序列标识符连接偶联，实现氧化损伤的核苷酸分辨率定位；后续研究优化该方法用于人类基因组并定位8-oxoG和AP位点包括irofulven诱导的脱嘌呤。酶选择和预处理决定读出代表样本中已存在的AP位点还是由氧化碱基转化的AP中间体，需要末端阻断和适当的无酶对照以区分损伤衍生品与背景断裂。OGG1-AP-seq和OGAP-seq使用OGG1将8-oxoG转化为AP位点，随后由醛反应性探针（ARP）生物素化并富集测序；这些方法分辨率相对较低但受益于OGG1对8-oxodG高特异性带来的优越背景控制。还需考虑其他含醛内源性化合物如5-甲酰胞嘧啶（5-fC）可与ARP反应，需要碱性水解等特定处理防止干扰。嵌入rNMP测序方面，DNA合成过程中DNA聚合酶可能错误掺入rNMP，掺入率因聚合酶类型和序列背景而异，有时高达每千碱基1–2个。这主要因为细胞内核糖核苷酸三磷酸（rNTP）浓度远高于dNTP，且两种分子仅相差一个2′-羟基，使聚合酶活性位点难以区分。RNase H2识别单个rNMP并启动核糖核苷酸切除修复（RER），这是rNMP去除的主要机制。基于切割机制，rNMP检测方法分为碱水解和特异性酶切割法。碱水解法利用RNA核糖2′-OH的碱敏感性，在强碱加热条件下2′-OH作为亲核试剂攻击相邻磷原子切割磷酸二酯键，产生不稳定2′,3′-环磷酸中间体进一步水解为2′-和3′-磷酸产物混合物，该反应对嵌入DNA的rNMP具有特异性。Ribose-seq、HydEn-seq和Pu-seq利用此原理：Ribose-seq使用AtRNL的磷酸二酯酶和连接酶活性将2′,3′-环磷酸末端转化为2′-磷酸末端，随后自连形成环状DNA分子，去除2′-磷酸后扩增测序；HydEn-seq采用两步接头连接，碱水解产生的5′-OH末端先磷酸化并连接第一接头，随后第二链合成和连接第二接头，该模块化设计适用于研究各种突变聚合酶；Pu-seq使用随机引物在ssDNA模板上起始合成产生平末端随后连接接头，其优势在于直接测量复制起点效率，实现复制动态的全基因组定量分析。值得注意的是HydEn-seq和Pu-seq均捕获rNMP下游片段，对应DNA合成方向，从而补充捕获上游片段的emRiboSeq和Ribose-seq；然而碱处理破坏碱基修饰信息且无法区分rNMP与其他损伤，酶法则提供更高特异性。特异性酶切割方法基于核酸内切酶对相邻rNMP的特异性切割，随后末端标记富集损伤片段，如emRiboSeq和EndoSeq。emRiboSeq使用重组RNase H2选择性切割rNMP产生可连接3′-OH末端，实现单碱基分辨率和定量分析；EndoSeq用其他核酸内切酶替代RNase H2，扩展方法至检测非经典核苷酸并为聚合酶保真性研究提供工具。AP位点测序方面，AP位点由自发碱基丢失或BER通路中DNA糖基化酶作用形成，发生频率高——每细胞每天约10,000个脱嘌呤和500个脱嘧啶位点。这些损伤的积累可导致DNA链断裂、复制叉停滞和突变，在衰老、癌症和神经退行性疾病中起重要作用。AP-seq富集醛反应性探针标记的DNA并以约250 bp分辨率定位AP相关区域，不鉴定单个AP核苷酸；snAP-seq将化学捕获与AP位点选择性切割结合获得单核苷酸分辨率并区分AP衍生产物与其他含醛碱基；SSiNGLe-AP在APE1切割和TdT依赖性标记新产生断裂前阻断预先存在的3′-OH末端。末端阻断效率和损伤转化特异性均影响推断的AP景观。AP位点定位还可使用核酸内切酶IV配置的Nick-seq、升级版click-code-seq和DEPACE-seq。Nick-seq可配置核酸内切酶IV将AP位点转化为切口，随后进行互补捕获反应并交叉所得信号，该应用将现有平台扩展至AP位点检测，最初在细菌基因组DNA中验证，为更广泛的损伤转化 repertoire 增加核苷酸级AP定位。升级版click-code-seq使用改进接头和背景控制步骤实现人基因组AP位点的单核苷酸定位，包括内源性和irofulven诱导的脱嘌呤，该AP应用扩展了上述氧化损伤方案。DEPACE-seq将AP位点化学标记与核酸内切酶IV切割及来自两个切割末端的独立文库相结合，其交叉支持哺乳动物基因组中高置信度单核苷酸指认，额外文库需求以实验工作量换取位置置信度。这些方法均不能消除对提取过程中引入损伤或预先存在末端不完全阻断的控制需求。与snAP-seq和SSiNGLe-AP一起，这些方法扩展了可用的高分辨率AP位点工具箱。AP-seq提供区域富集而非单核苷酸定位。对于每种基于转化的检测，无酶样本、末端阻断对照和定义含AP标准品对于区分内源性AP位点与背景切口及故意由其他碱基损伤产生的AP中间体是必要的。

DNA损伤组学的临床转化与精准肿瘤学部分指出，肿瘤基因组不稳定性通过DNA修复、复制和染色体分离的多种缺陷产生。转化需要三个不同的测量层面：预先存在的损伤及其修复动力学；当前修复能力；累积的基因组改变包括致病性变异和同源重组缺陷（HRD）相关疤痕。这些层面互补，但支持基因组生物标志物的证据不能自动验证直接DNA损伤定位检测。BRCA之外的遗传定义人群和脆弱性方面，BRCA1/2致病性变异鉴定重要治疗敏感人群，但种系状态、体细胞改变、双等位基因丢失、肿瘤谱系和既往治疗影响解释。OlympiA确立了辅助olaparib在定义的高危、HER2阴性早期乳腺癌伴种系BRCA1/2致病或可能致病性变异人群中的获益。PROfound和TOPARP-B试验评估基因组选择的转移性前列腺癌，说明为何任何DDR基因改变的存在不应被视为PARP抑制剂敏感性的统一度量。PAOLA-1进一步证明HRD阳性无BRCA突变卵巢肿瘤在其特定维持治疗设置中的获益。这些发现支持情境特异性分层而非通用BRCA/HRD应答规则。基因组疤痕记录先前修复缺陷并可在HR功能恢复后持续存在。功能性RAD51焦点测量可通过报告当前HR能力补充测序，尽管它们不是全基因组损伤图谱且依赖细胞周期和损伤背景。一种研究策略是将这些读出与基线和治疗早期损伤图谱结合，以区分高损伤形成、持续未修复损伤和修复恢复，该策略相对于BRCA/HRD分类的增量预测价值尚待前瞻性确立。机制研究鉴定额外修复依赖性。核ZBP1抑制MRE11介导的末端切除和HR；ZBP1增加增强实验性卵巢癌模型中PARP抑制剂敏感性，同一报告描述了新辅助高级别浆液性卵巢癌队列中ZBP1表达、niraparib应答和无进展生存的关联，这是机制证据与探索性临床相关性而非DNA损伤定位检测的验证。结直肠癌模型中Lnc5q21.2与HOXA10相互作用，激活Wnt–ATR信号并在体外和异种移植中增加ATR抑制敏感性。这些研究激发整合表达、修复功能和损伤测量超越仅突变分类。治疗应答和肿瘤微环境影响方面，对于化疗，损伤图谱可帮助分离药物递送和损伤形成与修复介导的去除。配对顺铂损伤定位和XR-seq为研究铂类损伤形成位置和进行切除修复提供机制框架。连续采样可检验持续损伤是否与应答相关，前提是控制暴露、增殖和标本处理；这仍是生物标志物开发策略，因为基于细胞的定位本身不建立临床预测效用。药物特异性生物学至关重要，因为铂类加合物、拓扑异构酶相关损伤和抗代谢物诱导应激涉及不同修复过程。抗HER2抗体-药物偶联物（ADC）也必须通过载荷区分。Trastuzumab deruxtecan（T-DXd）携带拓扑异构酶I抑制剂，使损伤加工和复制相关损伤成为敏感性的合理贡献者，而T-DM1的微管导向载荷需要不同机制解释。2期DAISY研究中连续活检将应答和耐药与HER2表达及额外分子特征关联；耐药时SLX4改变和 supporting knockdown实验 implicating DNA损伤加工，但其预测价值仍为探索性。这些数据激发联合评估靶表达、ADC递送和DNA修复，不确立BRCA/HRD状态或全基因组损伤图谱作为抗HER2 ADC治疗的验证选择器。对于免疫治疗，微卫星不稳定高（MSI-H）/错配修复缺陷（dMMR）在转移性结直肠癌中有随机临床证据支持包括KEYNOTE-177。该读出反映缺陷MMR及其基因组后果而非同期损伤位置。BRCA1缺陷卵巢肿瘤模型中PARP抑制引发STING依赖性抗肿瘤免疫，为研究DDR-免疫联合提供理由；然而仅损伤负荷不确立有效抗原呈递或T细胞活性，前瞻性评估因此应考虑免疫浸润、干扰素信号和抗原呈递能力与损伤和修复测量并行。肿瘤微环境异质性可影响对损伤的生物学应答和活检测量内容。缺氧、增殖状态、基质混杂和区域药物渗透可在同一肿瘤内产生不同损伤和修复图谱。肝细胞癌模型中缺氧诱导SLC6A8依赖性肌酸摄取促进代谢适应并拮抗PARP1依赖性parthanatos despite DNA损伤，这将DNA损伤积累与细胞死亡承诺区分，并非PARP抑制剂必然逆转表型的证据。单细胞配对损伤/转录组分析和空间知情采样可能有助于解决此类异质性，任何预测模型应报告肿瘤纯度、采样区域和采样时间并在独立队列中证明性能。患者选择和治疗策略方面，对于患者选择，直接目标是检验可重复的损伤或修复特征是否在包含肿瘤类型、临床协变量和相关分子生物标志物的既定模型上增加信息。候选特征包括受控暴露后持续损伤负荷和修复通路相关损伤模式。分析验证应确立损伤特异性、背景伪影率、可重复性、最小输入和标本储存下的稳定性；临床验证应使用预设阈值、盲法分析和独立测试，随后评估检测指导决策是否改善结局。对于治疗监测，配对基线和治疗早期活检可区分初始损伤诱导与修复后残余损伤。循环肿瘤DNA提供跟踪肿瘤分数和耐药相关突变的互补途径，但无细胞DNA片段化和序列变异不是活肿瘤细胞损伤的直接图谱；高级别卵巢癌中循环DNA检测到的BRCA回复突变与原发性和获得性rucaparib耐药相关。当肿瘤释放低或机制非遗传时，阴性血浆结果不排除耐药，基于组织的功能测量在这些情况下可能有信息价值。联合选择应遵循观察到的耐药机制。例如共济失调毛细血管扩张突变（ATM）缺失在前列腺癌模型中赋予对ATR抑制比PARP抑制更大的敏感性，TRESR研究报告camonsertib在选定DDR缺陷实体瘤中的早期临床活性，并进行等位基因状态和循环DNA应答的探索性分析。这些结果支持测试分子选择的策略而非所有DDR改变产生相同药物依赖性的普遍预期。PARP抑制剂耐药的临床方法包括与DDR、免疫和表观遗传治疗的联合也已讨论。恢复的HR、改变的PARP生物学和其他耐药状态需要不同干预；PARG缺失不应与抑制PARG的理由混为一谈。有用的转化工作流将特定损伤或修复缺陷与机制脆弱性连接，确认所选治疗产生预期药效学变化，并对照适当比较者测试临床获益。额外毒性和正常组织DNA损伤必须与抗肿瘤活性并行评估。补充表S3中的试验确立DDR相关生物标志物的临床背景；所列检测均非全基因组SSB或AP位点测序作为治疗选择测试的前瞻性验证。

结论与展望部分总结，DNA损伤组学结合损伤特异性标志物、选择性富集和下一代测序生成全基因组DNA损伤图谱。本综述综合的证据表明损伤分布呈非随机并受染色质状态、序列背景和三维基因组组织塑造。该框架将损伤形成和修复与表观遗传调控连接，同时暴露跨研究比较前必须解决的技术偏倚。DNA损伤传统上被认为在基因组中随机发生，然而DNA损伤组学揭示突变热点源于修复效率差异、选择压力和高初始损伤区域。非B DNA结构如G-四链体、发夹和Z-DNA因其独特构象易积累氧化损伤，转录因子结合位点因频繁动态结合和解离更易受损。然而文库构建过程中携带特定损伤的DNA链在连接效率和稳定性方面与正常DNA不同，导致损伤位点代表性不足。此外高重复含量或极端GC含量区域中低富集效率和高脱靶率仍是重大挑战，使这些基因组"暗区"的损伤景观未获解析。长期以来对染色质状态如何精确调节DNA损伤易感性缺乏全局理解，特别是脆弱开放区域与特定表观遗传特征之间的对应关系。DNA损伤组学通过将损伤图谱与近核小体分辨率表观遗传信息整合，揭示核小体耗竭区域作为损伤热点而异染色质区域积累更高水平损伤，与癌细胞中观察到的突变偏好一致。核仁相关域和核纤层相关域富集异染色质，在复制应激或转录活性下易发生双链断裂。尽管CRISPR-LiveFISH等技术允许在活细胞中以亚微米分辨率实时追踪修复动态，但受低通量和光毒性限制；未来开发高灵敏度微创荧光探针结合高内涵成像可实现DNA损伤动态的高通量长期监测，为核亚结构在损伤应答中的时空作用提供见解。群体平均图谱可掩盖具有不同损伤负荷和修复状态的亚群。单细胞方法和空间转录组信息整合可帮助将这些差异归因于细胞类型和组织区域，尽管直接空间损伤定位技术上仍具挑战性。长读长测序提供额外序列背景和对部分重复区域的可及性。SMAC-seq和nanoNOMe等染色质分析方法提供互补的单分子表观遗传测量，这些检测不连续追踪活细胞中单个DNA损伤的修复。常规短读长测序受读长和扩增偏倚限制，使着丝粒和端粒等重复区域分析复杂化。改进标记、基于UMI的定量和长读长测序可改善这些区域DNA损伤和结构变异的分析，其性能取决于损伤捕获、文库制备和检测特异性验证。区分生物损伤与技术噪声及实现跨分析流程比较仍是重大挑战。低偏倚文库制备兼容长读长平台和低起始量样本，结合标准化计算分析可支持更可靠的机制和转化研究。将初始损伤与后续突变关联仍是重要挑战，匹配的暴露、修复和突变测量可检验损伤是否持续、被准确修复或贡献特征性突变特征。临床转化需要前瞻性队列、标准化标本处理和针对既定生物标志物的外部验证；分子关联或治疗中变化需要增量预测价值和临床效用证据才能指导治疗选择。总之，长读长测序、单细胞和空间方法及标准化计算工作流可将DNA损伤组学从描述性定位推向机制和临床可操作模型。进展将取决于更低偏倚的文库制备、透明基准、跨生物背景验证以及区分生物损伤与技术噪声的方法。这些发展最终可能支持更精确的生物标志物和治疗策略，但临床转化需要前瞻性验证。