代谢功能障碍相关脂肪性肝病中纤维化年化动态：一项配对活检队列研究

《Journal of Gastroenterology》：Annualized fibrosis dynamics in metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease: a paired-biopsy cohort

　　

背景：纤维化分期是代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）结局最强的组织学决定因素，但常规诊疗下的年化纤维化动态尚未被充分量化。研究人员在一个长期、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂应用前的配对活检队列中表征了纤维化进展率（FPR），以为新兴代谢治疗提供参考数据。方法：研究人员分析了153例MASLD患者，这些患者在单中心接受了重复肝活检，中位间隔为5.9年（范围0.5–24年）。随访期间无患者接受GLP-1受体激动剂或GLP-1/葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）双受体激动剂。FPR定义为纤维化分期的年化变化（分期/年）。采用多变量逻辑回归分析与纤维化改善相关的因素。结果：纤维化改善38例（25%），保持稳定66例（43%），进展49例（32%）。在改善或进展的患者中，FPR差异显著，揭示了仅靠分类分期无法捕捉的双向且异质的纤维化动态。FPR与MASLD活动度评分变化平行移动，且与肝细胞气球样变和小叶内炎症的变化关系比与脂肪变性的关系更密切。男性、基线晚期纤维化和体重减轻≥5%与纤维化改善相关，且随着这些因素的累积，改善可能性增加。结论：在这个真实世界胰高血糖素样肽-1应用前的配对活检队列中，常规诊疗下的纤维化变化是双向且异质的，年化速率差异很大。这些数据为评估新兴代谢治疗如何改变MASLD的纵向病程提供了参考。

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）涵盖从单纯脂肪变性到代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）、晚期纤维化、肝硬化及肝细胞癌的广泛临床病理谱系。在组织学特征中，纤维化分期是长期肝脏相关结局和死亡率的最强决定因素。因此，了解纤维化随时间的变化对于MASLD患者的风险分层、监测和治疗决策至关重要。既往配对活检研究显示，MASLD中的纤维化并非遵循统一的进展过程，而可能随时间进展、保持稳定或消退。许多既往研究以分类方式描述这些变化，即纤维化改善、稳定或进展。然而，这种方法不能完全捕捉纤维化变化的速率，尤其是当患者之间的活检间隔不同时。评估纤维化变化的年化速率可能提供关于纤维化动态方向和节奏的额外信息。解释纵向纤维化变化的一个主要挑战是，临床实践中随访的患者很少未经治疗。他们可能接受生活方式指导、体重管理、代谢合并症治疗和其他常规护理。因此，真实世界配对活检队列不代表未经治疗的自然史；相反，它们提供关于常规纵向护理下纤维化轨迹的临床相关信息，并可作为新兴代谢治疗研究的参考数据。在常规实践中，重复肝活检很少可行，因此可临床评估的有利纤维化动态因素很重要。体重减轻仍然是MASLD管理的核心，并与组织学改善相关，而丙氨酸氨基转移酶（ALT）降低被广泛用作肝损伤减轻的标志物。由于代谢、生化和组织学变化相互关联，表征纤维化改善的因素应在不假设独立因果关系的情况下进行解释。在本研究中，研究人员分析了一个单中心真实世界配对活检MASLD患者队列，随访时间较长。研究人员旨在使用纤维化进展率（FPR）表征纵向纤维化轨迹，检查纤维化动态与组织学活动度之间的关系，识别与纤维化改善相关的基线和纵向因素，并评估其累积是否与更有利的年化纤维化动态相关。此外，FPR此前已应用于配对活检研究，研究人员还检查了其相对于传统分类纤维化变化的增量价值和局限性，包括FPR和纤维化结局是否因活检间隔而异。方法部分：本研究为回顾性单中心配对活检研究，纳入1996年至2024年间在川崎医科大学综合医疗中心定期门诊随访并接受两次或以上肝活检的MASLD患者。纳入标准为基线有组织学脂肪变性、符合当代MASLD标准（至少一项心脏代谢危险因素）且有首次和末次活检时的临床和实验室数据。由于研究期间早于MASLD命名，既往诊断为非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎的患者根据当前MASLD标准进行回顾性重新分类。通过临床、实验室、血清学和 histological 评估排除其他慢性肝病。排除标准包括乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、药物性肝损伤、Wilson病、血色病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症和其他遗传性或代谢性肝病。大量饮酒患者也被排除。酒精摄入量通过结构化临床访谈和病历审查评估，要求男性<30 g/天，女性<20 g/天。观察期间无患者接受GLP-1受体激动剂或GLP-1/GIP双受体激动剂。治疗暴露未按方案规定，在整个长研究期间根据常规临床护理而变化。因此，该队列作为真实世界纵向队列进行分析，处于异质性生活方式和常规代谢管理下，而非未经治疗的自然史队列。首次肝活检在临床怀疑MASLD或MASH且认为需要组织学评估以进行诊断或疾病分期时进行。重复活检通常在约5年间隔时作为常规监测的一部分考虑。然而，由于该回顾性队列跨越1996-2024年，活检指征和时机未标准化。较短间隔的重复活检根据主治医师的临床判断或患者偏好进行。组织学和临床评估：肝活检标本经福尔马林固定、石蜡包埋，苏木精-伊红和Azan染色。脂肪变性、肝细胞气球样变和小叶内炎症主要在苏木精-伊红染色切片上评估，而纤维化分期在Azan染色切片上评估。肝组织学由至少两名经验丰富的病理学家和两名肝组织学专家肝病学家组成的审查小组使用首次和末次活检标本进行评估。最终组织学评分通过小组审查和共识确定，审查者对纵向临床结局设盲。纤维化分期为0至4级，MASLD活动度评分（MAS）计算为脂肪变性、肝细胞气球样变和小叶内炎症评分之和。脂肪变性评分0-3，气球样变0-2，小叶内炎症0-3。纤维化结局根据首次和末次活检之间纤维化分期的变化进行分类。纤维化改善定义为纤维化分期至少降低一个分期，纤维化进展定义为至少增加一个分期，纤维化稳定定义为纤维化分期无变化。类似地，MAS和个体组织学成分的改善或进展分别定义为至少降低或增加一分；无任何变化的病例分类为稳定。临床和实验室数据在每次肝活检时获取。包括体重、体重指数、心脏代谢合并症、肝功能、血小板计数、白蛋白、HbA1c、血脂谱和血清IV型胶原7S（COL4-7S）。体重变化、ALT变化和组织学活动度变化作为纵向变量评估。体重减轻≥5%和ALT降低≥17 U/L用作纵向改善的临床可解释指标。纤维化进展率的定义：计算FPR以考虑首次和末次肝活检之间间隔的差异。FPR定义为纤维化分期变化除以活检之间的观察期，表示为分期/年：FPR = （末次活检纤维化分期?首次活检纤维化分期）/活检间隔年数。因此，FPR正值表示年化纤维化进展，负值表示年化纤维化消退，FPR为0表示纤维化稳定。FPR根据纤维化结局类别以及MAS、脂肪变性、肝细胞气球样变和小叶内炎症的纵向变化进行分析。由于纤维化分期是序数组织学变量，FPR被解释为纵向纤维化动态的近似指标，而非严格的连续生物学速率。纵向临床和组织学变量：评估活检之间体重、体重指数（BMI）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、HbA1c和组织学活动度的纵向变化。体重减轻定义为较基线降低至少5%。ALT降低定义为降低至少17 U/L，基于报告提示该阈值可作为NAFLD/NASH组织学应答相关的简单生化标志物。ALT降低作为肝损伤改善和有利纤维化动态的支持性标志物进行评估。对于组织学活动度，MAS改善定义为首次和末次活检之间至少降低一分。个体组织学成分（包括脂肪变性、肝细胞气球样变和小叶内炎症）的改善、稳定和进展分别定义为至少降低一分、无变化或至少增加一分。比较不同MAS和组织学活动度成分变化下的FPR，以评估组织学活动度变化与年化纤维化动态之间的关系。PNPLA3基因型（rs738409）作为基线遗传因素评估。其与纤维化结局和纤维化动态的关联与其他基线临床、生化和组织学变量一起检查。为识别与纤维化改善相关的因素，评估基线变量和纵向临床变化。由于ALT降低和MAS改善被认为与体重减轻、肝细胞损伤减少和组织学活动度改善在生物学上相互关联，这些变量未同时进入主要多变量模型以避免潜在共线性和过度调整。体重减轻≥5%被选为主要纵向临床变量，因为它具有临床可解释性且与MASLD管理直接相关。为评估基线和纵向因素与纤维化改善的累积关联，研究人员计算了每位患者满足以下三个因素的数量：男性、基线晚期纤维化和体重减轻≥5%。基线晚期纤维化定义为纤维化3期与0-2期比较。患者根据满足因素数量分为四组：无因素、一个因素、两个因素或全部三个因素。统计分析：表中连续变量以中位数和四分位距[IQR；第25-75百分位]表示，分类变量以数量和百分比表示。箱线图中，中心线表示中位数，箱体表示第25-75百分位，须线表示第10-90百分位。连续变量使用Mann-Whitney U检验比较。分类变量使用似然比卡方检验比较；当任何预期单元格计数小于5时使用Fisher精确检验。配对连续或序数变量使用Wilcoxon符号秩检验比较，配对分类变量使用McNemar检验。FPR被视为连续非正态分布变量。三组或以上FPR比较使用Kruskal-Wallis检验，随后在适当时使用Steel-Dwass检验进行所有成对比较并针对多重检验进行调整。FPR与MAS变化之间的关联使用Spearman秩相关系数评估。组织学活动度分类变化与纤维化结局类别之间的关联使用列联表精确检验评估。为评估活检间隔对FPR的影响，患者根据活检间隔的第25和75百分位分为三组（<3.4年、3.4-9.8年和>9.8年）。比较三组间的FPR和纤维化结局分布，并使用Spearman秩相关系数评估活检间隔与FPR之间的关联。排除活检间隔<1年和<2年的患者后进行敏感性分析。在每个限制队列中，重新评估纤维化结局分布，并使用与主要分析相同的协变量重复纤维化改善的多变量逻辑回归模型。计算首次和末次肝活检之间FIB-4和IV型胶原7S（COL4-7S）的纵向变化。其与纤维化分期变化和FPR的关联使用Spearman秩相关系数评估。排除活检间隔<1年和<2年的患者后重新评估与FPR的相关性。对于探索性PNPLA3分析，比较CC、CG和GG组之间的rs738409基因型。纤维化结局分布使用似然比卡方检验比较，FPR使用Kruskal-Wallis检验比较。PNPLA3 G等位基因剂量（0、1或2）与FPR之间的关联使用Spearman秩相关评估。多变量逻辑回归模型使用隐性模型（GG vs. CC/CG）和加性G等位基因模型评估纤维化改善和进展，调整男性、基线晚期纤维化（3期 vs. 0-2期）和体重减轻≥5%。这些分析为探索性，使用完整病例，未针对多重性进行调整。临床结局分析使用末次肝活检作为地标，因为FPR只能在配对活检后确定。对于每个终点，在末次活检时或之前已经历该终点的患者从相应风险集中排除。肝脏相关事件定义为肝细胞癌或临床诊断的肝衰竭。心血管或脑血管事件定义为心肌梗死或卒中。事件通过电子病历审查确定，事件日期定义为首次记录发生的日期。随访从末次活检延伸至首次后续事件、死亡或最后一次记录的临床评估（视情况而定）。对于非致命终点分析，无事件患者在死亡或最后一次记录的临床评估时删失。使用Kaplan-Meier估计和log-rank检验比较纤维化改善、纤维化稳定和纤维化进展组之间的肝脏相关事件概率。单变量Cox比例风险模型评估FPR作为连续变量，风险比表示为每增加0.1分期/年。由于事件数量少，未进行多变量结局模型，所有临床结局分析均视为探索性。与纤维化改善相关的因素使用多变量逻辑回归检查。主要模型包括临床相关或统计学显著的基线和纵向变量。由于ALT降低和MAS改善被认为与体重减轻和疾病活动度改善在生物学上相互关联，它们未同时进入主要模型以避免共线性和过度调整。最终模型包括男性、基线晚期纤维化和体重减轻≥5%。结果以比值比（OR）及95%置信区间（CI）表示。对于累积分析，患者根据存在的三个因素数量分类：男性、基线晚期纤维化和体重减轻≥5%（0、1、2或3）。因素数量与纤维化改善之间的关联使用单变量逻辑回归评估，以无因素患者为参照组。还比较各组间的FPR以评估因素累积与年化纤维化动态之间的关系。双侧P值<0.05被认为具有统计学显著性。分析使用JMP Pro版本19（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）进行。伦理：本回顾性研究按照赫尔辛基宣言原则进行，并获得川崎医科大学伦理委员会批准（批准号3864-02）。由于研究使用现有临床和组织学数据，免除了书面知情同意的要求。通过公开披露研究信息实施了选择退出方法，经伦理委员会批准。结果部分：研究人群基线特征：共纳入153例接受重复肝活检的MASLD患者。首次和末次活检之间的中位间隔为5.9年，观察期范围为0.5至24年。首次活检时，中位年龄为53岁，男性75例，女性78例，中位BMI为27.2 kg/m2。两名患者基线BMI数据不可用。60例患者存在2型糖尿病。140例患者测量了COL4-7S，127例患者有PNPLA3基因型数据：CC、CG和GG基因型分别为16、65和46例，26例未检测。无患者接受GLP-1受体激动剂或GLP-1/GIP双受体激动剂。基线特征总结于补充表S1。患者选择和最终配对活检队列的组成总结于补充图S1。纤维化改善患者中男性比例高于无改善患者（24/38 vs. 51/115，P = 0.0435）（表1）。基线晚期纤维化在改善组中也更常见，尽管这可能部分反映晚期纤维化患者有更大的可测量改善机会。其他基线临床、生化、遗传和组织学变量在两组间无显著差异。因此，纤维化改善与选定的基线特征相关，特别是男性和基线晚期纤维化。首次和末次活检之间的变化：首次和末次活检之间的临床和组织学变化总结于补充表S2。中位年龄从53岁增至60岁，而中位BMI基本保持不变，从27.2降至26.9 kg/m2。心脏代谢合并症变得更常见：2型糖尿病从39%增至51%，高血压从32%增至40%，血脂异常从81%增至89%。血清肝酶随时间降低。中位ALT从75降至37 U/L，AST从49降至33 U/L，γ-GTP从57降至35 U/L。HbA1c轻度升高从5.9%至6.1%，而COL4-7S保持相似。纤维化分期分布轻度变化，0/1/2/3/4期从14/45/34/60/0变为16/40/37/51/9。相比之下，MAS向较低评分偏移，0-8分从0/6/17/17/29/31/19/30/4变为1/12/20/41/32/24/15/6/2，反映组织学活动度改善。总体而言，常规随访伴随肝酶和组织学活动度改善，而纤维化分期分布仅轻度变化。根据纤维化结局的纵向临床和组织学变化：随访期间，纤维化改善38例（25%），保持稳定66例（43%），进展49例（32%）。ALT降低≥17 U/L在纤维化改善患者中比无改善患者更常见（34/38 [89%] vs. 72/115 [63%]，P <0.001）（表2）。体重减轻≥5%在改善组中也更常见，而HbA1c变化与改善无显著关联。改善组MAS下降比非改善组更明显（中位数[IQR]，?3 [?4至?1] vs. 0 [?2至1]；P < 0.0001）。因此，纤维化改善伴随有利的生化、代谢和组织学变化。纤维化进展率和纤维化动态的异质性：为考虑活检间隔差异，计算FPR作为纤维化分期的年化变化。在这个真实世界配对活检队列中，常规临床实践中随访的患者纤维化并非均匀变化；一些显示消退，而另一些显示进展。因此，FPR在改善组为负值，稳定组为零，进展组为正值，组间差异显著（图1a）。在纤维化分期变化的患者中，年化变化幅度差异很大。改善组显示负FPR值的广泛分布，表明消退速率的个体间变异性。进展患者的正FPR值也有变化，尽管分布较窄。这些发现表明，仅分类纤维化结局不能完全捕捉组织学变化的年化速率异质性。FPR根据活检间隔组差异显著（Kruskal-Wallis检验，P < 0.0001；补充表S3），活检间隔与FPR正相关（Spearman's ρ = 0.37，P < 0.001）。在<3.4年组中，37例患者中18例（48.6%）纤维化改善，2例（5.4%）进展，而在>9.8年组中，38例患者中4例（10.5%）改善，19例（50.0%）进展。这些发现表明年化FPR并非独立于活检间隔，不应被解释为在显著不同观察期之间均匀可比的生物学速率。组织学活动度与纤维化动态的关系：FPR与MAS变化正相关（Spearman's ρ = 0.53，P <0.001）：MAS下降越大与更有利的负FPR值相关，而MAS增加与较不利的正值相关（图1b）。当患者根据MAS改善、稳定或进展分类时，组间FPR差异显著，MAS改善患者FPR最低，MAS进展患者FPR最高（图1c）。在个体组织学成分中，肝细胞气球样变和小叶内炎症的变化与FPR显著相关。这些成分的改善伴随较低的FPR值，而恶化与较高值相关。相比之下，脂肪变性变化与FPR的关系较弱，未根据纤维化动态清楚区分患者。这些发现表明年化纤维化动态与肝细胞损伤和坏死炎症活动度的变化关系比与单独脂肪变性更密切（图1d–f）。绘制个体FPR值与MAS变化、体重减轻≥5%和ALT降低≥17 U/L以可视化患者水平异质性（图2）。负FPR值富集于MAS改善和ALT降低，而MAS进展在正FPR值中更常见。然而，这些变量不能完全区分改善与进展，体重减轻和ALT降低在广泛FPR值范围内观察到。因此，代谢、生化和组织学变化相互关联但在个体患者水平不可互换。无创标志物纵向变化与纤维化动态的关系：FIB-4和COL4-7S的百分比变化与FPR显著相关（FIB-4：n = 153，Spearman's rho = 0.285，P < 0.001；COL4-7S：n = 140，rho = 0.326，P < 0.001；补充图S2）。FIB-4和COL4-7S的百分比变化也与传统纤维化分期变化显著相关（分别为rho = 0.300，P < 0.001和rho = 0.361，P < 0.001）。两种标志物的绝对变化也观察到类似发现。排除活检间隔<1年或<2年的患者后，FPR与FIB-4和COL4-7S百分比变化的相关性仍然显著。与纤维化改善相关的因素：在单变量比较中，ALT降低≥17 U/L、体重减轻≥5%和MAS变化根据纤维化结局差异显著，而HbA1c变化无差异。由于ALT降低和MAS改善可能与代谢改善和体重减轻相互关联，它们未同时进入主要多变量模型。在最终模型中，男性与纤维化改善相关（OR 3.20，95% CI 1.38–7.85；P = 0.0061），基线晚期纤维化（定义为3期与0-2期比较）也相关（OR 2.41，95% CI 1.04–5.67；P = 0.0383）。体重减轻≥5%与改善的关联最强（OR 4.47，95% CI 1.96–10.4；P = 0.0002）（表3）。这些结果确定男性、基线晚期纤维化和体重减轻≥5%为与纤维化改善相关的因素。男性与纤维化改善的关联被视为探索性，因为绝经状态和其他性别相关因素无法评估。排除活检间隔<1年（n = 3）或<2年（n = 10）的患者未实质性改变纤维化结局分布（补充表S4和S5）。排除<1年间隔后，纤维化改善、稳定和进展分别为24.0%、43.3%和32.7%；排除<2年间隔后的相应比例分别为21.7%、44.1%和34.3%。在重复多变量模型中，男性、基线晚期纤维化和体重减轻≥5%均仍与纤维化改善显著相关，点估计与主要分析相似或更强（补充表S5）。PNPLA3基因型与纵向纤维化动态：127例患者有PNPLA3 rs738409基因型数据（CC，n = 16；CG，n = 65；GG，n = 46），26例不可用。纤维化改善、稳定和进展的分布在CC（25.0%、56.3%和18.8%）、CG（20.0%、43.1%和36.9%）和GG（19.6%、41.3%和39.1%）基因型之间无显著差异（P = 0.682）。三个基因型组的中位FPR均为0.000分期/年，无显著差异（Kruskal-Wallis P = 0.450）。G等位基因剂量与FPR无显著相关（Spearman's ρ = 0.102，P = 0.253）。在调整的完整病例模型（n = 123）中，GG基因型和G等位基因剂量均与纤维化改善无关（GG vs. CC/CG：OR 1.08，95% CI 0.39–3.02，P = 0.886；每G等位基因：OR 0.84，95% CI 0.38–1.85，P = 0.658）或进展无关（GG vs. CC/CG：OR 1.02，95% CI 0.44–2.37，P = 0.954；每G等位基因：OR 1.27，95% CI 0.68–2.39，P = 0.451）（补充表S6和S7）。FPR与临床结局的关联：使用末次肝活检作为地标并排除在该活检时或之前有相应终点的患者后，149例患者中发生9例肝脏相关事件，150例中2例肝细胞癌，148例中12例心血管或脑血管事件，153例中7例死亡。肝脏相关事件在纤维化改善组38例中0例发生，稳定纤维化组65例中4例，纤维化进展组46例中5例。Kaplan-Meier比较显示三组间肝脏相关事件概率有差异趋势，尽管差异未达到统计学显著性（log-rank P = 0.059；补充图S3）。在单变量Cox模型中，FPR每增加0.1分期/年与肝脏相关事件HR 1.35相关（95% CI 0.95–1.92，P = 0.099）。FPR与肝细胞癌（HR 1.33，95% CI 0.64–2.76，P = 0.443）、心血管或脑血管事件（HR 1.02，95% CI 0.81–1.28，P = 0.873）或全因死亡率（HR 1.11，95% CI 0.78–1.59，P = 0.553）无显著关联（补充表S8）。基线和纵向因素与纤维化改善的累积关联：最后，患者根据与纤维化改善相关的三个因素数量分类：男性、基线晚期纤维化和体重减轻≥5%。随着因素数量增加，FPR逐渐向负方向偏移，表明更有利的年化纤维化动态（图3a）。纤维化改善患者比例随因素数量增加而增加。无因素32例中3例（9.4%）改善，一个因素65例中9例（13.8%），两个因素47例中20例（42.6%），全部三个因素9例中6例（66.7%）。与无因素相比，一个、两个和三个因素的改善比值比分别为1.55、6.91和18.6，两个或三个因素患者中关联显著（图3b）。因此，基线和纵向因素的累积识别了纤维化动态最有利的患者。讨论部分：MASLD中的纤维化并非均匀进展，而是遵循包括进展、稳定和消退的异质性轨迹。在这个常规护理下的真实世界配对活检队列中，纤维化改善25%，保持稳定43%，进展32%。该队列不代表未经治疗的自然史；相反，其优势在于捕捉真实世界纵向护理（包括生活方式指导和常规代谢管理）期间的纤维化动态。FPR揭示了纤维化变化年化节奏的显著个体间变异，特别是在消退或进展患者中。这些发现表明纤维化动态不仅应通过分类分期变化评估，还应通过随时间的方