《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：JNK signalling balances apoptosis and cell survival during tissue stress
编辑推荐：
组织应激后的恢复需要清除受损细胞并相应产生健康细胞。这两类过程如何协调以确保组织恢复目前仍知之甚少。本研究表明，c-Jun N末端激酶（JNK）通路在响应上皮应激时协调了细胞凋亡与增殖这两种看似相反的细胞行为。研究人员利用新型光遗传学工具在果蝇翅原基的特定区域
组织应激后的恢复需要清除受损细胞并相应产生健康细胞。这两类过程如何协调以确保组织恢复目前仍知之甚少。本研究表明，c-Jun N末端激酶（JNK）通路在响应上皮应激时协调了细胞凋亡与增殖这两种看似相反的细胞行为。研究人员利用新型光遗传学工具在果蝇翅原基的特定区域触发JNK信号活动的脉冲，并在时间和空间上对响应进行了图谱分析。在诱导后3小时内，激活区域内的细胞增殖停滞，同时一部分细胞发生凋亡。当JNK信号恢复到基线水平时，凋亡减弱，增殖恢复，从而以高保真度完成发育。使用灵敏的报告系统，研究人员发现虽然JNK触发凋亡，但JNK活性水平与凋亡在单细胞基础上并不相关。研究表明细胞周期时相调节JNK信号的促凋亡活性：G2期阻滞具有保护作用，而在G1期，温和的JNK信号活性即足以触发凋亡。转录组分析鉴定出编码Dally和Dally样蛋白（Dlp）的基因是受过度JNK信号上调最为显著的基因之一。研究表明这些glypican通过增强配体Wingless（一种Wnt）和Dpp（一种BMP）的表面滞留来促进组织修复。研究人员提出，由此产生的形态发生素信号的局部增加提供了后续对JNK信号促凋亡效应的保护，使存活细胞能够重新进入细胞周期并恢复发育。相应地，在Dlp活性降低时，核糖体蛋白缺陷或辐射诱导应激的恢复受损。本研究展示了单一应激通路如何选择性触发凋亡，同时保护能够在正常发育恢复过程中参与组织修复的细胞。
组织应激后的恢复是一个涉及细胞死亡、存活与增殖精确协调的复杂生物学过程。果蝇（Drosophila melanogaster）研究已揭示c-Jun N末端激酶（JNK）信号通路在发育过程中的组织应激响应中发挥关键作用。JNK可被多种组织损伤激活，包括手术创伤、遗传性组织消融及辐射等，在这些情况下JNK均是凋亡的重要触发因素。同时，JNK信号也被证明是损伤后再生和组织恢复所必需的。JNK促进组织恢复的一种方式是通过触发Ilp8的产生——一种延缓发育进程的系统性信号，从而为修复提供时间。此外，所谓"不死"细胞（同时触发应激并阻止凋亡的细胞）的行为暗示了组织自主性修复机制的存在，这些细胞以JNK信号依赖的方式产生旁分泌增殖信号。因此，有研究提出濒死细胞短暂激活JNK信号可暂时促进局部增殖以确保新细胞替代受损细胞。然而，在散在凋亡细胞周围尚未直接证实代偿性增殖的存在，部分原因可能是该过程的瞬时性。因此，代偿性增殖是否为慢性应激的特征仍有待确定，这凸显了解析JNK如何同时激活凋亡与增殖的必要性。
为解析应激诱导的JNK信号如何调控细胞行为和基因表达，追踪和调节JNK信号的工具至关重要。在果蝇中，JNK活性可通过TRE>GFP评估，该转基因包含多聚化AP-1结合位点驱动GFP编码DNA。尽管该报告系统广泛有用，但在灵敏度、时间分辨率、更快折叠、更高周转率和更亮荧光团方面仍有改进空间。在实验性诱导JNK信号方面，表达hemipterous（Hep）编码的JNK激酶组成性活性形式的Gal4依赖性转基因（HepCA）已被证明特别有效。迄今为止，急性诱导已通过Gal4/Gal80ts或DUAL Control系统实现，这些系统在特定区域随温度升高而激活。虽然有效，但这些方法需要温度变化，可能影响应激响应。Shine>Gal4最近被开发为具有优异时间和空间控制转基因激活的替代方案，为精确 delineate JNK信号触发的事件序列铺平了道路。
研究人员利用Shine>Gal4诱导的HepCA表达和改进的JNK信号报告系统，证实JNK信号激活触发快速细胞死亡和细胞周期阻滞。尽管凋亡在整个JNK信号诱导区域内被诱导，但区域内单个细胞发生凋亡的决定不一定与JNK信号活性水平相关。因此，研究人员着手鉴定调节JNK促凋亡效应的其他特征。研究发现先前的G2期阻滞可阻止JNK诱导的凋亡，证实了早期关于G2期具有保护作用的提示。JNK诱导后的批量RNA测序鉴定出两个glypican基因dally（人类GPC3/5的同源物）和dlp（人类GPC4/6的同源物）位列JNK信号激活最强的5个基因之中，敲低或去除glypican降低了组织恢复的保真度。因此，本研究揭示了在触发凋亡后，JNK通过诱导细胞周期阻滞和通过glypican上调增强细胞存活/增殖来促进组织恢复。
在研究方法方面，研究人员主要运用了以下关键技术：光遗传学系统Shine>Gal4结合蓝光脉冲（460 nm LED）在果蝇翅原基特定区域（sal结构域）精确诱导HepCA表达；改进的JNK活性报告系统TRE>4xNLS-NeonGreen和TRE>mScarlet；G-TRACE细胞命运追踪技术；DUAL Control系统实现HepCA与细胞周期调节因子的独立时序控制；批量RNA测序（Illumina NovaSeq，配对末端100 bp测序）进行转录组分析；杂交链式反应（HCR）进行RNA原位检测；EdU掺入实验检测DNA合成；以及果蝇遗传学工具包括Rps26条件性敲除等位基因和γ射线辐照（20 Gy或40 Gy）应激模型。
研究结果方面，首先，"JNK信号脉冲触发即时细胞周期阻滞和广泛凋亡"：通过光遗传学在果蝇翅原基中急性激活JNK信号，研究人员发现3小时内在激活区域内JNK信号异质性升高，大部分细胞发生凋亡（通过抗切割型果蝇caspase-1（DCP1）抗体检测），同时磷酸化组蛋白H3（pH3）免疫反应性消失，表明G2期阻滞；这些效应均为暂时性的，18小时后凋亡恢复至低水平，7-9小时后可检测到分裂细胞。其次，"JNK信号活性水平并非凋亡的唯一决定因素"：利用Shine>Gal4初始激活的异质性，研究人员发现促凋亡基因hid的表达与TRE>NeonGreen荧光强度之间相关性较差（r=0.484），而JNK直接靶标mmp1与报告系统相关性良好（r=0.747）；起始caspase DRONC活性报告也与TRE>Scarlet相关性较差，表明高水平JNK信号并不必然触发凋亡。第三，"G2期细胞免受JNK诱导的凋亡"：通过DUAL系统在sal结构域预先进行细胞周期阻滞，研究人员发现通过string RNAi实现G2期阻滞可挽救JNK诱导的细胞死亡，而通过Rbf过表达实现G1期阻滞则轻微增强凋亡，表明G2期细胞对JNK促凋亡效应具有保护性。第四，"Glypican表达受JNK信号上调"：批量RNA测序鉴定出dally和dlp在JNK激活后5小时内显著上调（log2倍数变化分别为0.95和1.21），HCR证实了转录水平升高，抗体证实了Dlp蛋白水平升高，且Dlp蛋白增加与JNK激活持续时间呈累积响应；dally或dlp杂合突变体在HepCA脉冲后成虫翅尺寸减小（dally杂合子减少3%，dlp杂合子减少6%）且毛密度降低，表明glypican基因剂量减少损害组织恢复能力。第五，"Glypicans通过调节形态发生素信号促进组织恢复"：研究发现JNK脉冲后wg和dpp转录水平仅轻微增加（log2倍数变化分别为0.44和0.56），HCR未检测到wg RNA显著增加，但Wg信号报告系统（naked>NeonGreen）在HepCA表达后上调，细胞外Wg染色增强；缺乏Dlp的克隆中naked>NeonGreen活性较低且DCP1阳性凋亡细胞较多；HepCA脉冲还触发pMAD免疫反应性增加（Dpp信号激活标志），而在缺乏Dally时该效应减弱，表明JNK通过上调glypican增强Wg和Dpp信号传导能力。第六，"Dlp保护免受辐射或核糖体蛋白缺陷引起的应激"：在Rps26条件性敲除模型中，杂合失活足以触发TRE>NeonGreen表达和dlp转录增加；Dlp失活单独仅偶尔触发凋亡，但在Rps26杂合背景下Dlp失活显著增加凋亡事件；γ射线辐照（40 Gy）触发JNK激活和Dlp上调，Puc/DUSP10过表达部分减少Dlp上调；dlp敲低增加了辐照诱导的凋亡率，表明在两种不同的组织应激情况下JNK信号触发Dlp上调从而部分保护细胞免受JNK诱导的凋亡。
讨论部分总结了以下要点：JNK通路是组织应激响应的主调控因子。利用光遗传学手段激活JNK信号，研究人员发现JNK最早的响应是全局性细胞周期阻滞和激活区域内的"盐和胡椒"式凋亡。利用Shine>Gal4初始异质性活性，研究人员发现单个细胞发生凋亡的决定并非仅由JNK信号水平决定，暗示其他特征的参与。先前工作表明通过异位表达String（编码CDC25磷酸酶）缩短G2期可增加JNK诱导的凋亡率，而本研究表明将细胞维持在G2期具有保护作用。由于JNK信号脉冲后7-9小时内未检测到分裂细胞，JNK信号似乎也halt细胞周期进程，可能将细胞维持在G2期以便进行DNA修复等质量控制步骤。为鉴定保护细胞免受JNK促凋亡效应的分子机制，研究人员进行了时间分辨转录谱分析。在JNK信号最上调的基因中，wallenda（wnd）因编码MAPKKK可能参与反馈调节值得进一步研究。研究人员选择聚焦于两个果蝇glypican基因，因为它们指向细胞外空间的共同功能，且其第一内含子含有潜在AP-1结合位点（TGACTCA），提示JNK信号可能直接调控其转录。glypican完全去除阻止组织生长且单突变体活力差，因此难以评估完全功能丧失对组织修复的影响。在dally杂合子中恢复相对正常，可能由于基线基因表达较高；但在dlp杂合子中长期恢复受损，表明该glypican的完整活性是组织应激响应所必需的。glypican已知可调节Wg和Dpp的活性，这两种配体在"不死"细胞或损伤响应中被转录激活。在本研究温和组织应激范式中，JNK诱导的glypican上调足以提高这些信号通路及其他可能信号通路（如JAK/STAT、FGF和Hedgehog）的活性，通过增强其在细胞表面的稳定性或活性。研究人员未检测到光遗传学JNK激活区域及其周围在组织恢复期间增殖率的增加，提示Wg和Dpp信号的轻微增加可能仅促进细胞存活以允许后续增殖恢复。与近期报道一致，研究人员认为代偿性增殖在广泛JNK诱导凋亡后确保正常翅发育中仅发挥次要作用（如果有的话）。这一观点与Ilp8诱导的发育延迟的作用一致——为受损组织提供补充细胞数量的手段而无需代偿性增殖。这些考虑与刺伤或大规模组织消融的响应形成对比，后者与增殖细胞环和损伤周围细胞迁移相关。研究人员提出对轻度或慢性损伤的响应可能与严重损伤有质的不同。为扩展这一建议，研究人员调查了对"自然"应激的响应。在RpS3/+翅原基中，Wg信号增加而wg表达无可检测变化，且凋亡在远离Wg正常来源处尤其高，这些观察可通过研究发现——JNK增强Dlp表达导致细胞外Wg池增加从而增强信号保护免受凋亡——来合理解释。Dlp在辐照后也被发现发挥保护作用，Dally可能通过增强Dpp信号活性发挥类似作用。研究结果表明，根据严重程度不同，发育过程中的应激可引发不同的JNK依赖性修复策略。严重组织损伤需要形成芽基以尽可能快速恢复上皮完整性，随后通过细胞迁移和代偿性增殖补充细胞。研究人员提出，不损害组织完整性的轻度或慢性应激可通过暂时阻止凋亡来修复，特别是在G2期细胞中，可能是因为它们更适合修复。细胞周期的这一效应是否解释了近期证明的不同翅原基细胞群体在辐照后差异调节DRONC活性仍有待研究。研究结果提示glypican表达通过允许促存活信号在细胞表面暂时滞留来调节组织应激后的细胞存活。未来工作将确定glypican是否也在成体组织再生中保护细胞。glypican在人类癌症中常被上调，凸显了进一步研究其是否及如何影响癌性生长的必要性。
研究结论翻译：本研究展示了单一应激通路如何选择性触发凋亡，同时保护能够在正常发育恢复过程中参与组织修复的细胞。
