《European Journal of Plant Pathology》：Sequencing-based quantification of Erwinia amylovora strains identifies contribution of strain?×?strain?×?host interactions underlying apple fire blight severity
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田间多种病原菌株共存，其与寄主基因型的互作可显著影响病害严重度及防控策略。火疫病由Erwinia amylovora（E. amylovora）引起，是全球苹果和梨最具毁灭性的细菌病害之一。寄主遗传背景与物候阶段、病原菌株遗传特性及环境条件之间的互作导致病害暴
田间多种病原菌株共存，其与寄主基因型的互作可显著影响病害严重度及防控策略。火疫病由Erwinia amylovora（E. amylovora）引起，是全球苹果和梨最具毁灭性的细菌病害之一。寄主遗传背景与物候阶段、病原菌株遗传特性及环境条件之间的互作导致病害暴发并改变火疫病感染严重度。苹果园中存在多个E. amylovora菌株，但菌株×菌株互作对病害发展的影响尚不清楚，部分原因在于E. amylovora遗传多样性低，给菌株区分和定量带来挑战。研究人员开发并利用基于扩增子序列（AmpSeq）的方法鉴定菌株间单核苷酸多态性（SNPs），以研究体外和植物体内（in planta）的菌株-菌株互作。体外试验表明，火疫病菌株E2002a生长最快，并在培养接近稳定期时竞争胜过其他菌株（Ea273和E4001a）。在两项独立实验中对四种苹果基因型进行植株接种试验，结果表明菌株组成和寄主基因型均影响病害严重度。总体而言，E2002a和E4001a及含有它们的菌株混合物在苹果基因型（'Empire'、'Gala'和'G.935'）中导致最严重的火疫病感染，表明这些菌株在决定感染严重度方面占主导地位。感染严重度亦强烈依赖寄主。E2002a是从感染组织中分离到的优势菌株。研究结果表明，寄主基因型×菌株互作是火疫病严重度最重要的预测因子，凸显了深入理解菌株×菌株×寄主基因型互作对于可持续火疫病防控的必要性。
**研究背景与问题**
植物病原感染往往涉及不止一个病原菌株。病原基因型、菌株与寄主在感染过程中的互作直接影响植物-病原互作的病害结局。已有研究表明，在多种植物-病原系统中，混合菌株感染的病害严重度取决于寄主基因型。火疫病由革兰氏阴性细菌Erwinia amylovora（E. amylovora）引起，自18世纪在纽约首次报道以来，已扩散至北美、欧洲和亚洲大多数苹果和梨产区。该病原可侵染植株任何部位，包括花器、枝条和砧木。火疫病的防控策略主要为预防性措施，如抗生素施用、铜制剂喷雾、修剪和清除溃疡病斑。然而，在有利天气条件下，易感寄主组织中病原菌的存在可导致大规模流行病并造成巨大经济损失。此外，链霉素抗性菌株的出现使传统化学防控效果下降。火疫病感染严重度取决于寄主抗性基因、病原菌株遗传特性及气候条件之间的互作。苹果园中存在多个具有不同侵袭力的E. amylovora菌株，可能导致不同品种呈现不同感染严重度。E. amylovora菌株在效应子和毒力基因等位基因上存在差异，可调节感染能力。然而，由于E. amylovora基因组高度相似（菌株间相似度>99.5%），区分不同菌株一直是理解菌株×菌株×寄主基因型动态的主要障碍。现有基因分型方法（如脉冲场凝胶电泳、SSR标记、CRISPR等）未能成功区分许多毒力差异显著的菌株。尽管多个E. amylovora菌株可在同一果园中共存，但菌株互作如何影响病害严重度和病原丰度尚知之甚少。因此，本研究旨在确定菌株互作如何改变火疫病严重度和菌株丰度，以及这些互作是否依赖寄主基因型。
**关键技术方法**
研究人员建立了基于基因组测序的方法来鉴定和定量多个E. amylovora菌株。利用AmpSeq方法，针对三个菌株（E4001a、Ea273和E2002a）间10个多态性SNP位点设计引物，通过两轮PCR构建文库并在Illumina MiSeq平台测序，利用SNP位点核苷酸频率实现菌株鉴定和定量。研究材料包括来源于Cornell University Darrow Farm实验果园的'Gala'、'Golden Delicious'和'Empire'三个商业栽培品种及高抗砧木'G.935'。体外竞争试验评估三个菌株单独及混合培养的生长动态；植物接种试验评估菌株混合物对火疫病严重度的影响，并通过LB平板分离感染组织中的细菌后进行AmpSeq分析，量化各菌株相对丰度。
**研究结果**
**菌株混合物与火疫病严重度**：通过AUDPC评估'Empire'、'Gala'和'Golden Delicious'接种不同菌株混合物后的病害严重度。E2002a在所有品种中均表现高侵袭力，导致最高的AUDPC值之一。Ea273在'Gala'和'Empire'中引起低感染，在'Golden Delicious'中不引起感染。E4001a导致的病害严重度也较低。菌株组合改变了植株病害严重度，但组合间的感病性排序不一致。菌株单独解释51.11%的病变长度变异，品种解释约7.77%，品种×菌株解释14.04%，三因素及其互作均显著影响病变长度（P < 2.6×10?1?）。
**AmpSeq用于菌株鉴定和定量的验证**：AmpSeq能够区分和定量混合物中的E. amylovora菌株。单菌株结果中目标核苷酸占比一般>99%。多菌株混合时，菌株频率与基于区分性核苷酸的预期频率基本一致，个别混合物存在偏差，可能与初始接种浓度差异或扩增偏倚有关。
**E. amylovora体外生长动态**：通过OD600测定和SNP核苷酸比例追踪各菌株在混合物中的生长。E2002a在单独培养和混合培养中均为生长最快的菌株。在M1中E2002a比例至T4时超过90%，在M3中至T4时达71%，在M4中E2002a平均占84.7%。Ea273单独培养时生长迅速，但与其他菌株混合时生长受损。E4001a生长速率最低但存活时间较Ea273长，但无法竞争胜过E2002a。
**E. amylovora菌株混合物与火疫病严重度**：通过15天病程中的病斑长度百分比（PLL）评估症状发展。基因型和接种物间PLL存在显著差异（P < 0.05）。'Gala'为最感病基因型，在所有菌株和组合中PLL和AUDPC最高。'Empire'为中等严重度，'G.935'严重度最低。Ea273单独接种在'Gala'和'G.935'中导致显著较低的病害严重度。在'Gala'中，E2002a和E4001a及含有它们的组合导致显著高于Ea273单独的病害严重度。
**E. amylovora植物体内生长**：E2002a在所有基因型的分离细菌群体中占主导地位。在含有E2002a的混合物（M1、M3和M4）接种的枝条中，E2002a占比超过93%，常达100%。M2（Ea273+E4001a）结果一致性较低，部分重复中检测到E2002a的痕迹，解释了M2接种植物重复间的不一致性。
**讨论与结论**
研究人员发现火疫病感染严重度受苹果寄主基因型和E. amylovora菌株组合的强烈影响。混合菌株感染在多数寄主中导致与单菌株接种不同的火疫病严重度，表明菌株互作可以以寄主依赖的方式改变感染水平。体外竞争试验表明E2002a在含有它的混合物中始终成为优势菌株，提示E2002a在测试条件下对Ea273和E4001a具有竞争优势。混合菌株火疫病感染表明病害严重度取决于菌株混合物和寄主基因型。E2002a和E4001a及含有它们的菌株混合物通常导致最严重的火疫病感染，但具体响应取决于寄主基因型。例如，E2002a和E4001a共感染在'Gala'和'Empire'中导致高病害严重度，但在'Golden Delicious'中病害严重度很低。病害严重度差异的一种可能解释是寄主对不同菌株识别能力的差异。从感染枝条分离的菌株混合物显示E2002a最终在植物体内占主导地位。在含有E2002a的混合物中，感染15天后它是唯一检测到的菌株，甚至在未接种该菌株的枝条中也被检测到，表明E2002a在植物体内具有高度竞争力。然而，含有E2002a的混合接种常呈现中间AUDPC值，提示其他菌株的存在影响病害严重度。总之，研究人员开发并验证了利用AmpSeq和已知SNPs区分三个E. amylovora菌株的方法。体外和植物体内菌株竞争实验表明E2002a在两种条件下均能竞争胜过E4001a和Ea273。菌株的侵袭力取决于品种，表明寄主基因型也改变菌株竞争动态。因此，果园中多个E. amylovora菌株的存在及其与寄主品种的互作可显著影响病害严重度，应在火疫病防控策略中加以考虑。菌株-菌株-寄主互作复杂且在許多病理系统中仍知之甚少，凸显了进一步研究这些互作 underlying 机制及其在病害防控中潜在应用的必要性。
