《Plant and Soil》：Bacterial community dynamics associated with Pinus massoniana across progression stages of pine wilt disease
编辑推荐：
目的：植物微生物组呈现明显的空间分区特征，但其在不同宿主分区和不同病程阶段对病害扰动的响应仍鲜有研究。方法：本研究采用16S rRNA基因扩增子测序和功能预测技术，对马尾松（Pinus massoniana）5个分区（针叶、茎干、根系、根际土壤和非根际土壤）在
目的：植物微生物组呈现明显的空间分区特征，但其在不同宿主分区和不同病程阶段对病害扰动的响应仍鲜有研究。方法：本研究采用16S rRNA基因扩增子测序和功能预测技术，对马尾松（Pinus massoniana）5个分区（针叶、茎干、根系、根际土壤和非根际土壤）在松材线虫病（PWD）4个阶段（健康、早期、中期和晚期）的细菌群落进行了表征。结果：结果表明，细菌群落动态受分区和病程阶段的显著影响。值得注意的是，茎干分区表现出显著变化：Chao1指数在中期显著升高，而Chao1、Shannon和Shannoneven指数在晚期下降。茎干分区晚期以变形菌门（Proteobacteria）的显著富集为特征，伴随假单胞菌属（Pseudomonas）和甲基杆菌属（Methylobacterium）相对丰度的升高。相反，放线菌门（Actinobacteriota）及其所属的酸热菌属（Acidothermus）显著下降。此外，功能预测揭示随着病程进展，化能异养和芳香族化合物降解途径增强（P < 0.05）。相比之下，针叶中的细菌群落在所有阶段保持稳定。在根系中，分枝杆菌属（Mycobacterium）在早期显著富集，但对群落结构影响较小。尽管根际土壤在早期和晚期检测到明显的群落重构，但根际和非根际土壤均含有高比例的共享OTU，且在门分类水平上无显著变化。结论：本研究确定茎干为PWD诱导的微生物失调的核心分区，并为监测和管理马尾松森林病害提供了基于微生物组的理论基础。
研究背景方面，植物与栖息于其内部和外部环境（包括根际、叶际和内部组织）的庞大微生物群落密切共存，这一微生物集合及其遗传和代谢潜力被称为植物微生物组（plant microbiome）。细菌在丰度和物种多样性方面均占主导地位。植物健康与生态系统功能的维持高度依赖于宿主与相关微生物组之间的动态互作，这些微生物群落在调控宿主生长、养分吸收、胁迫响应和生态系统功能中发挥关键作用。然而，当病原体侵染时，这些协调良好的微生物组合可能被破坏，导致微生物失调（dysbiosis），并可能影响病害结局。病害发展扰动宿主的生理状态并触发微生物群落的转变，这些变化可从侵染位点扩展至整个植株及相关土壤，破坏植物微生物组原有的功能网络。因此，理解病害如何破坏植物-微生物互作平衡对于阐明病害机制和改善森林病害综合治理策略至关重要。松材线虫病（PWD）是由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus，PWN）引起的毁灭性维管萎蔫病害，能迅速致死松树并造成严重生态损害。线虫定殖木质部后阻塞水分运输并触发宿主系统性生理崩溃。这种维管损伤可能诱导植物组织组成和根系分泌物的级联变化，从而改变内生和根际微生物群落的动态。传统研究主要集中于线虫的致病机制及其与媒介昆虫的互作，但越来越多的证据表明PWD也显著重塑宿主相关微生物群落结构。已有研究在黒松（P. thunbergii）和马尾松中证明了感染后茎干和根系中特定细菌和真菌类群的转变。特别是空间上不同的微生物分区可能对病害进展表现出发散性响应，阐明这种阶段和分区特异性模式对于揭示PWD潜在的微生物失调机制至关重要。然而，宿主相关微生物组在不同感染阶段和各分区之间如何重组仍知之甚少。全面探究病害进展过程中的植物微生物组对于理解病原体如何改变宿主相关微生物群落和生态系统过程至关重要。这一理解对于森林养分循环十分关键，因为病害诱导的微生物组成变化可影响关键功能性状，如养分循环、病原拮抗和胁迫耐受性。此外，PWD等维管病害加速宿主衰老和死亡，导致凋落物输入增加，定殖于腐烂组织的微生物群落控制分解速率和土壤碳/养分动态。然而，现有研究大多仅比较健康与患病树木，或仅关注单一分区，对于失调在何处、何时发生、如何在植物内传播及其对细菌生态功能的影响仍缺乏全面理解。为填补这些知识空白，研究人员开展了全面研究，考察PWD如何影响中国PWN主要目标树种马尾松的宿主微生物组，系统表征了5个关键分区（针叶、茎干、根系、根际和非根际土壤）在4个视觉病程阶段（健康、早期、中期和晚期）的细菌微生物组。研究目标为：（1）量化不同分区细菌多样性、群落结构和潜在功能变化的阶段特异性变异；（2）鉴定与病害进展相关的细菌分类学和潜在功能的关键转变。本研究旨在阐明马尾松细菌群落对PWD的时空响应模式，并为理解该病害的生态影响提供微生物组导向的视角。
在技术方法方面，研究人员在中国江苏省南京市紫金山南坡中山陵园马尾松林（亚热带季风气候区，年均降水量1000–1050 mm）开展研究，该地区自1982年首次报道PWD以来持续爆发，是研究自然条件下病害进展的代表性样地。研究选取20株树木代表4个PWD严重程度阶段：健康（H，无可见症状且未检测到松材线虫）、早期（E，<10%针叶褪绿）、中期（I，40–60%针叶褪绿或萎蔫）和晚期（L，>80%针叶褐变萎蔫），每阶段5株生物学重复，样树随机分布于约4.2 ha样地，相邻样树最小距离≥30 m。每株树系统采集5个分区样品，共获得100个样本（4阶段×5分区×5重复）。采用土壤DNA试剂盒和植物基因组DNA试剂盒提取总基因组DNA，扩增细菌16S rRNA基因V3-V4高变区（引物338 F/806R），在Illumina MiSeq 6000平台进行双端测序（2×300 bp），原始数据保存于NCBI数据库（PRJNA1474273）。生物信息学处理使用Mothur软件（v.1.48.0）按SOP流程进行，包括reads合并、引物修剪、质量过滤、SILVA数据库比对、嵌合体去除，以97%相似性阈值聚类为操作分类单元（OTU），丢弃所有样本中reads数少于10的OTU，以80%置信度阈值进行分类学注释，所有样本抽平至最低序列数后计算多样性指标。采用FAPROTAX（v.1.1）进行细菌功能潜力预测。统计分析使用R软件（v.4.5.2），α多样性采用Chao1、Shannon和Shannoneven指数并经单因素方差分析和Duncan多重比较检验，β多样性基于Bray–Curtis距离计算并采用置换多元方差分析（PERMANOVA，9999次置换）检验，差异丰度分析采用反正弦平方根转换后的单因素方差分析并以FDR校正P值。
研究结果方面，第一，PWD进展过程中的细菌群落多样性：病害进展对细菌α多样性的影响在茎干和非根际土壤中最为明显。在茎干中，Chao1指数在中期较早期显著升高（P < 0.05），而Shannon指数和Shannoneven指数在晚期显著低于其他所有阶段。非根际土壤呈现类似趋势，三个α多样性指数在晚期均显著降低（P < 0.05）。相反，针叶、根系和根际土壤在各病程阶段间未检测到α多样性的显著变化。第二，不同病程阶段的细菌群落结构：细菌群落结构在病程阶段和分区上均表现出显著差异。主坐标分析（PCoA）解释了不同分区和病程阶段间细菌群落结构总变异的37.2%。在茎干中，中期和晚期的细菌群落与健康和早期显著不同。在根际土壤中，健康与早期之间细菌群落差异显著，晚期较早期和中期均明显分化。类似地，非根际土壤晚期细菌群落与健康和中期显著不同。然而，针叶和根系在任何病程阶段均未观察到细菌群落结构的显著差异。共享（核心）和阶段特有OTU的组成在各分区之间差异显著，反映了病害影响的空间梯度。在针叶中，核心群落仅占各阶段共享OTU的8.8%，茎干中为10.3%，而茎干在晚期表现出较高比例的独有OTU（46.2%）。在根系中，核心OTU比例为18.5%，患病阶段（早期、中期和晚期）的阶段特异性OTU百分比（8.06%–15.3%）高于健康阶段（3.73%）。非根际和根际土壤在所有阶段保留了高比例的共享OTU（分别为35.4%和31.9%），阶段特异性独有OTU保持较低水平（≤7.62%）。第三，门水平细菌群落组成：质量过滤后共获得99,797,701条高质量细菌序列，聚类为13,533个OTU，归属于48个门。整体细菌群落以变形菌门（49.2%）、放线菌门（25.6%）和酸杆菌门（12.1%）为主。在针叶和茎干组织中，变形菌门在所有病程阶段均为优势门（分别为70%–85%和50%–90%）。针叶群落中前10门在病程进展中无显著变化。相反，茎干群落表现出显著阶段依赖性变化，变形菌门丰度在早期和晚期显著增加（P < 0.05）。放线菌门丰度在健康茎干中最高，早期显著下降，中期回升，晚期降至最低水平（P < 0.05）。酸杆菌门在健康和中期相对丰度较高，但在早期和晚期显著降低（P < 0.05）。类似地，拟杆菌门在健康、早期和中期较为丰富，晚期显著下降（P < 0.05）。在地下分区中，根系以Abditibacteriota和酸杆菌门为主，Abditibacteriota在健康期达到最高丰度并随病程逐渐下降，而酸杆菌门在早期和晚期显著富集。土壤中的核心门（变形菌门、放线菌门、酸杆菌门）与地上分区一致，在根际和非根际土壤中各病程阶段均无显著的门水平变化。第四，属水平组成：在属水平上，48.1%的序列被注释到1,539个已知属。在地上分区中，针叶组织维持相对稳定的群落结构，健康针叶以Marivita、Endobacter和Sphingomonas等核心属为主，Massilia在早期富集但在中期和晚期丰度下降。在茎干中，整个病程进展中观察到显著的属变化，健康茎干以甲基杆菌属和酸热菌属为核心属，早期甲基杆菌属相对丰度显著增加，酸热菌属也呈增加趋势（P < 0.05），在中期和晚期整体相对丰度显著下降，假单胞菌属成为晚期唯一优势属。在根系中，酸热菌属为优势属，分枝杆菌属在早期显著富集（P < 0.05）。在根际和非根际土壤中，酸热菌属为优势属，其相对丰度在早期和中期下降，但在晚期显著富集。在根际土壤中，Massilia在早期富集但此后丰度下降。第五，预测功能潜力的阶段特异性变化：预测功能谱的PCoA解释了马尾松不同分区和病程阶段群落总变异的65.3%，PCoA1和PCoA2分别占50.3%和15%。功能结构变异仅在茎干中观察到，晚期形成与其他所有阶段不同的功能结构。共有1,977个OTU（占总OTU的14.6%）成功匹配到FAPROTAX数据库，获得43个潜在功能群和13个簇。群落主要由化能异养（86.22%）、尿素分解（6.70%）、硝酸盐还原（1.79%）和捕食或外寄生（1.43%）组成。在茎干中，功能变化在晚期最为明显，化能异养、尿素分解、捕食或外寄生、光养、芳香族化合物降解和胞内寄生均显著富集，均显著高于健康或早期阶段（均P < 0.05）。在针叶、根系或非根际土壤中，任何病程阶段均未检测到功能变化。
讨论部分总结如下：本研究考察了马尾松5个分区在PWD进展过程中的细菌群落时空动态，结果揭示了分区依赖性和阶段特异性响应，茎干表现出最显著的变化，而针叶保持稳定，地下分区（根系、根际和非根际土壤）表现出适度的重构且仅在特定阶段显现。在α多样性方面，茎干细菌群落α多样性对病害进展表现出显著响应，丰富度在早期下降、中期升高、晚期崩溃，Shannon多样性和均匀度仅在晚期急剧下降，这一模式反映了PWD相关的生理进程：早期线虫侵染触发宿主防御反应释放萜烯和酚类等抗菌化合物抑制细菌定殖导致丰富度早期下降；随着线虫增殖分泌效应蛋白抑制宿主免疫并逐步组织损伤释放细胞内容物（如碳水化合物、氨基酸）促进快速生长细菌种群导致中期丰富度峰值；晚期广泛的木质部功能障碍和水力失效导致组织坏死减少生态位多样性并有利于少数富营养型类群。相反，针叶群落在任何病程阶段均无显著多样性变化，可能因其不直接被线虫侵染，其微生物群落主要受大气条件和叶表面化学调控，在树木濒死前相对不受系统性生理变化影响，这支持了叶际细菌对PWD胁迫具有较高响应阈值的观点。在地下分区中，非根际土壤细菌多样性仅在晚期下降，而根系和根际多样性保持不变，尽管PWD可因茎干维管损伤减少根系碳水化合物供应并改变根系分泌物组成，但根组织中的选择性细胞屏障限制微生物定殖和迁移，降低了根内群落对扰动的敏感性，从而解释了PWD对根系微生物影响较小的原因；根际α多样性在PWD下可能保持不变，可能归因于高微生物扩散性，即功能等效细菌可从非根际土壤迁移至根际；非根际土壤具有更复杂的共现网络和更强的抗扰动能力，其晚期α多样性下降可能由树木死亡诱导的根系腐烂和土壤养分变化驱动。在群落结构方面，β多样性分析揭示茎干细菌群落从中期开始重构，晚期变化最为剧烈，这与早期免疫抑制、中期资源释放和最终坏死崩溃的生理事件序列一致，因此茎干细菌群落可作为病害进展的敏感指示器。茎干中独有OTU数量最高，仅8.8%的OTU在所有病程阶段共享，晚期茎干含有高达46.2%的独有OTU，表明患病茎干胁迫性、资源波动的环境有利于机会性、暂态类群。相反，地下分区保留了大型核心微生物组（31.9%–35.4%共享OTU），反映了土壤异质性、功能冗余和高扩散率的稳定化影响。在门水平上，茎干中观察到显著变化，变形菌门随病程从45.2%增至68.7%并在晚期成为绝对优势门；放线菌门通常与宿主防御相关，在健康茎干中最为丰富但随病程下降；酸杆菌门作为环境胁迫指示物在早期和晚期降低但在中期短暂恢复。在属水平上，群落从健康茎干的甲基杆菌属和酸热菌属主导转变为晚期的假单胞菌属主导，某些假单胞菌物种以降解芳香族化合物著称，随着坏死木质部释放的酚类和萜烯而更加普遍，这一分类学转变反映了濒死茎干化学环境的变化。与茎干的动态变化相反，针叶细菌群落在门和属水平上均无显著变化，这种稳定性可能反映了大气条件和叶表面化学作为针叶微生物群落的主要驱动因素及其对环境波动的高内在耐受性。在地下，根系以酸热菌属和Abditibacteriota为主，前者因死亡根系残留物可利用性增加而在晚期富集。在根际和非根际土壤中，门水平无显著变化，仅属水平有微小波动（如早期Massilia短暂富集），然而根际在早期和晚期均表现出显著的群落重构。值得注意的是，晚期尽管非根际土壤细菌α多样性显著下降，但其整体群落组成仅适度改变，高比例共享OTU和缺乏门水平变化表明α多样性下降主要反映稀有类群的丢失而非优势细菌类群的更替，表明这些分区具有较强的土壤缓冲能力和功能韧性。在预测功能谱方面，显著变化主要在茎干晚期，化能异养、尿素分解、芳香族化合物降解和胞内寄生等功能群显著富集，这些变化对森林养分动态具有直接影响：化能异养增加表明濒死木质部组织的微生物分解增强；尿素分解表明有机氮矿化增强；芳香族化合物降解的富集与坏死木材中木质素来源酚类和萜烯的分解直接相关，可能加速立枯木分解并影响碳周转。然而针叶、根系、根际和非根际土壤在各病程阶段均未检测到显著功能变化，这种功能冗余和土壤缓冲可能阻止了生物地球化学过程在树木死亡晚期之前发生重大中断。值得注意的是，本研究鉴定的分区特异性微生物失调模式对PWD控制和森林管理具有实践意义，由于茎干在病害进展中表现出最强的微生物群落破坏，其可作为马尾松林早期监测的优先靶标，林业工作者可追踪茎干相关变形菌门和放线菌门的转变以支持早期预警，有助于克服仅依赖可见症状导致的延迟诊断。本研究揭示了马尾松细菌群落对PWD的时空响应，鉴定茎干为经历微生物失调的核心分区。然而应承认若干局限性：首先，16S rRNA数据的功能预测反映的是潜在而非实际代谢活性，宏转录组学或代谢组学等方法可验证推断的功能变化；其次，本研究在单一位点对单一松树物种开展，将这些发现推广到其他宿主或环境需要进一步验证；此外，缺乏根系分泌物组成和土壤养分通量的直接测定限制了将植物生理与微生物变化机制联系的能力，未来研究应整合植物代谢组学、土壤生物地球化学和微生物组时间序列以更好地理解病害进展中的植物-微生物-土壤反馈。结论部分翻译如下：本研究证明马尾松细菌群落对PWD的响应高度依赖于分区和病程阶段。茎干作为初始侵染位点，是经历微生物失调的核心分区，该分区在多样性、组成更替（仅8.8%的OTU在所有病程阶段共享）以及从甲基杆菌属和酸热菌属主导向假单胞菌属主导转变方面发生显著变化。此外，晚期功能谱表明化能异养和芳香族化合物降解的富集。相反，针叶群落在整个病程进展中保持稳定，而地下分区表现出较强的韧性，维持大型核心微生物组（31.9%–35.4%共享OTU）且无门水平变化。这些发现增强了对PWD发病机制的理解，并为马尾松林病害监测和管理建立了基于微生物组的基础。
