基于pH控制补料分批过程的代谢工程谷氨酸棒杆菌以乙酸为唯一碳源生产L-苏氨酸

《Applied Microbiology and Biotechnology》：L-Threonine production from acetate by metabolically engineered Corynebacterium glutamicum using a pH-controlled fed-batch process

　　

乙酸（acetate）作为非粮原料在微生物生物制造中具有相当潜力，但其用于氨基酸生产的研究仍不充分。本研究将理性的、基于基因组的代谢工程与pH耦合补料分批培养相结合，建立了以乙酸为唯一碳源、利用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）生产L-苏氨酸的工艺。工程菌株AT-3携带五个染色体突变，可缓解关键酶的反馈抑制并将碳通量导向天冬氨酸途径。底物供给通过定制的基于Visual Basic的补料脚本控制，该脚本依据在线pH测量自动调节乙酸进料。在从100 mL DASbox至1 L DASGIP生物反应器的十倍放大过程中，工艺性能保持稳健。优化后的工艺实现L-苏氨酸（L-threonine）效价10.04 g/L、得率0.086 g/g乙酸。本研究为进一步开发和改进基于乙酸的氨基酸生产工艺奠定了基础。

研究背景方面，工业生物技术的微生物生产过程多以玉米、小麦、木薯淀粉水解物或甘蔗、甜菜蔗糖为原料，与人food链直接竞争；转向非粮碳源成为具有工业相关性的快速发展的领域。乙酸可由木质纤维素生物质、有机废弃物或气体发酵等可再生碳源"绿色"生产，例如奥地利Lenzing AG公司在亚硫酸盐制浆厂中以吨级规模生产生物基乙酸，产乙酸菌亦可由CO₂与H₂或合成气生产乙酸。谷氨酸棒杆菌（C. glutamicum）是工业生物技术的主力菌株，尤其作为氨基酸大规模生产的细胞工厂，已被证明可利用包括乙酸在内的多种替代碳源，但利用乙酸需乙醛酸循环，且乙酸进入细胞依赖被动扩散（以乙酸形式）与经单羧酸转运蛋白MctC的主动运输（在碱性pH下尤为重要）。已有研究报道了以乙酸为原料生产衣康酸和蛋白，以及顺序发酵中先由Acetobacterium woodii将CO₂和H₂转化为乙酸、再由C. glutamicum生产L-谷氨酸、3-羟基丙酸或甲羟戊酸；多数其他研究将乙酸作为糖的共底物生产L-赖氨酸或L-缬氨酸。总体而言，C. glutamicum以乙酸为唯一碳源生产氨基酸的潜力仍基本未被探索。L-苏氨酸是必需氨基酸，工业发酵市场规模超过70万吨/年，主要用作饲料添加剂。Escherichia coli是目前L-苏氨酸生产的首选宿主，半定义培养基中报道效价高达170.3 g/L；C. glutamicum菌株曾达57.7 g/L及近期78.3 g/L，均以葡萄糖为主要碳源的半定义培养基。尽管效价较低，C. glutamicum具有工艺优势：具有欧洲食品安全局（EFSA）的合格安全性推定（QPS）地位；饲料级氨基酸无需化学纯，如Biolys^?工艺中L-赖氨酸以C. glutamicum生产，细胞灭活后全发酵液蒸发浓缩、喷雾干燥并造粒；且C. glutamicum可耐受高达60 g/L的乙酸浓度，尽管高于10 g/L时生长速率逐渐下降，主要由于乙酸浓度与pH依赖的解偶联效应。本研究旨在建立以乙酸为唯一碳源生产L-苏氨酸的原理验证工艺，构建无质粒的C. glutamicum ATCC 13032菌株，在化学成分确定培养基中采用基于pH的补料分批过程。

研究人员开展的研究与结论：以模式菌株ATCC 13032为起点，通过引入此前已被证明对天冬氨酸族氨基酸（AFAA）过量生产有效的基因组突变，构建了一系列无质粒L-苏氨酸生产菌株。首先通过氨基酸替换LysC^T311I解除L-苏氨酸与L-赖氨酸对天冬氨酸激酶（由lysC编码）的协同变构抑制，得到菌株AT-1；随后通过氨基酸替换Hom^G378E消除L-苏氨酸对高丝氨酸脱氢酶（由hom编码）的变构反馈抑制；将天冬氨酸氨基转移酶（由aspB编码）的天然启动子替换为强组成型tuf启动子（P_aspB::P_tuf）得到AT-2；再将lysC-asd操纵子的天然启动子替换为tuf启动子（P_lysC::P_tuf）并将lysC起始密码子由GTG改为ATG以提高翻译效率，得到AT-3。在BioLector微培养中，野生型（WT）生长速率为0.57 h^?1、终点背散射为15.20 ± 0.53，而AT-1、AT-2、AT-3生长速率与背散射显著降低；工程菌可过量生产并分泌L-苏氨酸，AT-1积累0.93 ± 0.19 mM L-苏氨酸并产生约2 mM L-赖氨酸、L-异亮氨酸和甘氨酸，AT-2产生两倍量L-苏氨酸（1.94 ± 0.55 mM），AT-3产生4.42 ± 0.19 mM L-苏氨酸及4.0 mM甘氨酸、2.7 mM L-赖氨酸和2.2 mM L-异亮氨酸，证实代谢工程步骤提高了以乙酸为原料的L-苏氨酸生产并使产物谱向L-苏氨酸倾斜。在DASbox微型平行生物反应器（工作体积100 mL）中以20 g/L乙酸钠为唯一碳源分批培养AT-1，最终OD₆₀₀为9.55 ± 0.78，37 h后L-苏氨酸最高浓度2.79 ± 0.72 mM，对应得率0.023 g/g消耗乙酸；与BioLector不同，生物反应器中L-赖氨酸效价较低（1.3 ± 0.2 mM），表明受控生物反应器培养促进了L-苏氨酸过量生产。随后建立pH基补料分批过程：当pH超过7.15时自动按设定速率补加乙酸，乙酸同时作为碳源和pH控制剂，采用与Eppendorf DASware控制软件兼容的定制Visual Basic脚本，初始乙酸钠浓度5 g/L（61 mM），接种后0.5 h启动补料。AT-1在24 h后达最大OD₆₀₀ 64.85 ± 1.20，24 h后检测不到乙酸钠，43 h后L-苏氨酸最高效价42.28 ± 4.31 mM，得率较分批提高一倍以上至0.056 g/g乙酸；副产物有L-赖氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸，但L-苏氨酸始终为主要产物。将补料脚本适配至工作体积1 L的DASGIP系统（10倍放大），培养基与过程设定点保持不变，培养18.5 h后最大OD₆₀₀为63.6 ± 0.56，乙酸谱与DASbox相当，43 h后L-苏氨酸最高浓度44.26 ± 1.49 mM，得率0.054 g/g乙酸；副产物L-赖氨酸效价略高于DASbox，甘氨酸与L-异亮氨酸相当，前24 h检测到高达10 mM L-高丝氨酸后消失，表明补料概念成功转移并具备可放大性。进一步在1 L DASGIP中对AT-3进行补料分批培养，AT-3生长慢于AT-1，42 h后OD₆₀₀为56.50 ± 4.43，乙酸动力学相当；L-苏氨酸生产在24至48 h间特别高，达60 ± 4.67 mM，随后缓慢增至66 h后的68.12 ± 4.67 mM，较AT-1提高54%，得率提高68.5%至0.091 g/g乙酸；副产物甘氨酸和L-赖氨酸形成与AT-1相似，培养1天后乙酸仍检测不到。为进一步优化，除乙酸补料外增加连续0.15 g/L乙酸钠补料（300 g/L母液），使乙酸供给不依赖pH控制的乙酸补料且不酸化培养基，基于此前乙酸消耗曲线于24 h后启动；同时以CGXII_o替代CGXII_m使培养基(NH₄)₂SO₄含量加倍。与前一过程相比，L-苏氨酸生产趋势相似但进一步提高23.8%，72 h后最终效价84.30 ± 6.40 mM（10.04 g/L），得率0.086 g/g乙酸；72 h后L-苏氨酸生产趋于平台，而副产物继续增加，至培养结束时约为前一过程的两倍；OD₆₀₀至29 h增至45.53 ± 2.99，之后增长较慢，至过程结束达61.60 ± 3.46；尽管有额外乙酸钠补料，24 h后仍未检测到乙酸积累，维持了预期的低乙酸浓度。

关键技术方法概述：采用BioLector II或XT仪器在48孔FlowerPlates中进行小规模培养，以620 nm散射光在线测生长；在DASbox^?或DASGIP^?生物反应器系统中进行分批与补料分批培养，配备pH与溶解氧（DO）在线探头，DO通过依次提高搅拌转速、通气速率和气体氧分压维持在30%以上；采用基于Visual Basic定制、整合于DASware^?控制软件的pH耦合补料程序（ChatGPT辅助开发与注释，最终决策与验证由作者完成）；通过高效液相色谱（HPLC）结合邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生与荧光检测定量氨基酸，以折射率检测（RID）定量乙酸；基因组突变经pK19mobsacB质粒双同源重组整合并以菌落PCR和测序验证。菌株为C. glutamicum ATCC 13032衍生株，无样本队列来源。

结果部分小结：构建L-苏氨酸过量生产菌株——通过五个染色体突变（LysC^T311I、Hom^G378E、P_aspB::P_tuf、P_lysC::P_tuf及lysC起始密码子GTG→ATG）逐步改造，得到AT-1、AT-2、AT-3，预期增加进入并流经天冬氨酸途径的碳通量。工程菌与WT在微尺度培养中的生长与L-苏氨酸生产比较——以20 g/L乙酸钠的CGXII_m培养48 h，工程菌生长显著降低但L-苏氨酸产量依次升高（0.93、1.94、4.42 mM），证实改造有效并使产物谱向L-苏氨酸倾斜。菌株AT-1的分批生物反应器培养——100 mL DASbox中OD₆₀₀达9.55、L-苏氨酸2.79 mM、得率0.023 g/g，表明受控生物反应器培养促进L-苏氨酸过量生产。菌株AT-1的pH基补料分批生物反应器培养——DASbox中OD₆₀₀达64.85、L-苏氨酸42.28 mM、得率0.056 g/g；10倍放大至1 L DASGIP后效价44.26 mM、得率0.054 g/g，表明补料概念可成功转移并放大。菌株AT-3的pH基补料分批生物反应器培养——1 L DASGIP中66 h后L-苏氨酸68.12 mM、得率0.091 g/g，较AT-1分别提高54%和68.5%，证实pH控制补料过程可转移至更高工程化菌株且代谢工程策略有效。菌株AT-3补料分批培养的优化——增加连续乙酸钠补料并提高氮含量后，72 h效价84.30 mM（10.04 g/L）、得率0.086 g/g，但副产物浓度亦近乎翻倍。

讨论部分总结：本研究通过菌株工程与生物过程开发的整合方法，证明了以乙酸为唯一碳源、利用C. glutamicum生产L-苏氨酸的可行性。BioLector中工程菌生长速率显著低于WT但L-苏氨酸产量递增，证实遗传改造有效触发过量生产；L-异亮氨酸以L-苏氨酸为前体属预期副产物，L-赖氨酸与L-苏氨酸共享天冬氨酸半醛前体、高丝氨酸脱氢酶与二氢吡啶二羧酸合酶竞争该底物，甘氨酸的强合成最可能源于必需酶丝氨酸羟甲基转移酶（由glyA编码）的侧活性——其将L-苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛，后者可经乙醛脱氢酶氧化为乙酸。与微尺度培养相比，AT-1在DASbox分批培养中L-苏氨酸水平高约三倍，可能归因于生物反应器中受控的pH与DO；以乙酸为唯一底物时ATP生成完全依赖电子传递磷酸化，因而依赖充足供氧，C. glutamicum呼吸链包括能量高效的细胞色素bc₁-aa₃超复合物分支与供氧受限时所需的低效细胞色素bd氧化酶分支，Δqcr突变体缺乏细胞色素bc₁复合物几乎不能在乙酸上生长，细胞色素aa₃氧化酶（而非bd氧化酶）活性需两个铜离子，这与铜离子对乙酸生产L-谷氨酸最大产量的需求相符；BioLector微培养在高细胞密度下已知造成氧限制，故DASbox中更好的供氧是差异的可能解释。pH基补料策略维持低乙酸浓度、减少乙酸积累引起的细胞胁迫，使效价与得率较分批翻倍；该概念此前已以MATLAB脚本在42 L生物反应器中成功用于生物量、GFP或衣康酸生产，证实其在中试规模的功能，而本研究的Visual Basic脚本适合小规模多平行重复的过程开发以提高实验通量。与以往多以葡萄糖为底物的C. glutamicum L-苏氨酸研究相比，近期报道以携带thrE表达质粒的工程菌从葡萄糖生产78 g/L L-苏氨酸、得率0.33 g/g葡萄糖；本研究旨在展示以乙酸为唯一碳源、仅含最多五个基因组修饰且不带质粒的C. glutamicum菌株在无机盐培养基中生产L-苏氨酸的可行性，补料分批中72 h内获得高达10 g/L L-苏氨酸与0.09 g/g得率；近期一株携带两个质粒的高度工程化E. coli在乙酸上52 h达45.8 g/L、得率0.22 mol/mol（据称达最大得率的65%），其采用含2 g/L酵母提取物和抗生素的改良M9培养基，并在两阶段补料分批中先以葡萄糖分批培养细胞再切换至乙酸补料。鉴于AT-3仅含有限改造靶点，进一步代谢工程具有提高菌株性能与L-苏氨酸得率的高潜力，例如提高L-苏氨酸生物合成与输出基因表达、减少副产物形成，包括下调glyA表达（此前显示可减少41%甘氨酸形成并提高49%L-苏氨酸积累）、引入反馈抗性二氢吡啶二羧酸合酶（DapA）变体如DapA^K68H以减少L-赖氨酸形成并在不引起L-赖氨酸营养缺陷的情况下将碳通量重定向至L-苏氨酸生物合成、降低苏氨酸脱水酶（IlvA，催化L-异亮氨酸生物合成第一步、将L-苏氨酸转化为α-酮丁酸）活性以减少L-异亮氨酸形成并增强L-苏氨酸积累而不引起L-异亮氨酸营养缺陷；除菌株工程外，过程优化如采用拉曼光谱（Raman spectroscopy）作为pH基乙酸补料的替代或补充亦是潜在手段。结合C. glutamicum生产的饲料级氨基酸可用的简化下游处理，本研究提示以乙酸为原料、利用C. glutamicum生产L-苏氨酸及其他饲料氨基酸是未来具有吸引力的选择。