橄榄渣（Olea europaea）对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）幼鱼生产性能及生理响应的影响

《Aquaculture International》：Effects of dietary olive pomace (Olea europaea) on zootechnical performance and physiological responses of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) juveniles

　　

本研究评估了在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）幼鱼饲料中递增添加橄榄渣（OP）对其生长性能、生产性能指标、体组成、能量代谢及脂质过氧化的影响。配制5组等蛋白（37%粗蛋白）和等脂（9%脂质）试验饲料，分别含0%（OP0）、5%（OP5）、10%（OP10）、15%（OP15）和20%（OP20）橄榄渣。幼鱼（0.56 ± 0.11 g）放养于15个水箱中（每处理3个重复），饲喂54天。末体重、增重、特定生长率、摄食量及存活率均无显著差异。然而，饲料转化率（FCR）在OP5和OP10组改善，在OP20组变差，蛋白质效率比（PER）和肥满度呈现类似响应。内脏体指数随添加水平升高而增加，而胴体率逐渐下降。较高添加水平（15%和20%）增加了水分和灰分含量，降低了体蛋白和脂质水平。蛋白质和脂质沉积在OP5和OP10组较高，在OP20组较低。肝糖原水平不受影响，而肌肉糖原水平在所有添加橄榄渣组均升高。血浆葡萄糖水平随橄榄渣添加而降低，而较高添加水平下肝脏葡萄糖、甘油三酯和胆固醇水平升高。OP20组肌肉脂质过氧化较高。FCR和PER的回归模型表明最佳橄榄渣添加范围为7.22%–8.55%。较高添加水平损害饲料利用效率并促进代谢改变，增加肌肉脂质过氧化。因此，橄榄渣可以中等水平添加于尼罗罗非鱼幼鱼饲料中而不损害生长性能。

水产养殖是全球动物蛋白生产中增长最快的行业之一，饲料是水产养殖生产中最重要的投入和限制因素。在此背景下，以植物源农工业副产物部分替代常规原料日益受到关注。橄榄渣（OP）（Olea europaea）是橄榄油提取过程中产生的固体残渣，因其营养特性（含脂质、纤维和寡糖）及高含量的酚类化合物（如橄榄苦苷、羟基酪醇和类黄酮）而成为潜在的替代原料，这些化合物具有抗氧化和抗菌特性。然而，橄榄渣也含有高水平的纤维组分和潜在抗营养因子，可能降低消化率并损害营养物质吸收。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是全球重要的水产养殖品种，在巴西水产养殖生产中占据突出地位。尽管已有研究探讨了橄榄渣在多种鱼类中的应用，但关于其对尼罗罗非鱼营养和代谢影响的信息仍然有限。因此，本研究旨在通过评估生长性能、体组成、能量和脂质代谢相关生化参数以及脂质过氧化指标，评价在尼罗罗非鱼幼鱼饲料中递增添加橄榄渣水平的影响。

研究人员于2024年4月至6月在巴西联邦大学海洋水产养殖站开展了为期54天的实验。所用橄榄渣由巴西Azeite Batalha公司提供，经60 oC烘干约24 h、研磨并过0.6 mm筛以标准化粒径。橄榄渣的近似组成采用AOAC（2007）标准方法测定：水分5.85 ± 1.06%、灰分4.78 ± 0.19%、粗蛋白12.55 ± 0.42%、粗纤维13.66 ± 1.50%、总脂质22.00 ± 0.78%、无氮浸出物41.16%。此外，橄榄渣总酚含量为9.17 ± 0.35 mg没食子酸当量/g，总黄酮含量为1.82 ± 0.08 mg槲皮素当量/g，抗氧化能力为12.55 ± 0.61 mg Trolox当量/g。配制5组等蛋白（37%粗蛋白）和等脂（9%总脂质）试验饲料，橄榄渣添加水平分别为0%、5%、10%、15%和20%。所有饲料均添加维生素和矿物质预混料以满足尼罗罗非鱼的营养需求。将225尾尼罗罗非鱼幼鱼（0.56 ± 0.11 g）放养于15个70 L矩形水箱中（每处理3个重复），在配备机械和生物过滤的循环水产养殖系统中供给约10‰的咸水。实验采用完全随机设计，光周期为12 h光照/12 h黑暗。每日三次（9:00、12:00和16:00）饱食投喂。实验期间监测水温、溶解氧、总氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、总碱度、pH和盐度。实验结束后，所有鱼禁食24 h，用丁香酚（50 mg/L）麻醉，逐尾称重和测量以收集形态计量数据。每箱取3尾鱼经尾静脉采血，血液样品在4 oC下以637 × g离心10 min分离血浆，储存于–80 oC。采血后，同批鱼用丁香酚过量（250 mg/L）处死后解剖收集肝脏和内脏，测量肝脏、内脏和胴体重量及肠道长度以计算生产性能指标。另从每箱取6尾鱼用丁香酚过量处死，其中3尾用于获取肝脏和肌肉组织样品储存于–80 oC用于生化分析，其余3尾用于测定近似组成。生产性能参数包括增重（WG）、日增重（DWG）、特定生长率（SGR）、存活率（SR）、摄食量（FI）、饲料转化率（FCR）、蛋白质效率比（PER）和肥满度（CF）。肝体指数（HSI）、内脏体指数（VSI）、胴体率（CY）和肠道系数（IQ）按相应公式计算。全鱼样品在45 oC下干燥约12 h至恒重后研磨用于近似组成分析，水分、灰分和粗蛋白按AOAC（2007）测定，总脂质按Bligh和Dyer（1959）方法测定。营养物质沉积率（NDR）按公式计算。组织匀浆（肝脏和肌肉）以1:5（w/v）比例在含EDTA（2 mM）和Mg²⁺（5 mM）的Tris–HCl缓冲液（100 mM，pH 7.78）中制备。肝脏和肌肉糖原水平采用苯酚–硫酸法测定。血浆和肝脏葡萄糖、胆固醇、甘油三酯和总蛋白采用Labtest Diagnóstica S.A.商业试剂盒酶法测定。肝脏和肌肉脂质过氧化采用硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）法测定，结果以每毫克组织中丙二醛（MDA）的纳摩尔数表示。统计分析使用RStudio软件（版本4.2.1），数据经Shapiro–Wilk检验正态性和Levene检验方差齐性后，采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验，不满足假设时采用Kruskal–Wallis检验及Dunn事后检验（p < 0.05）。基于FCR和PER值采用二次多项式回归估算最佳橄榄渣添加水平。

研究结果表明，实验期间水质参数为：溶解氧6.00 ± 0.94 mg/L、温度26.67 ± 1.40 oC、pH 7.78 ± 0.33、总氨氮0.24 ± 0.36 mg/L、亚硝酸盐6.15 ± 6.14 mg/L、硝酸盐7.77 ± 7.15 mg/L、盐度10.82 ± 1.32‰、碱度125.72 ± 37.32 mg CaCO₃/L。在生产性能方面，末体重、增重、日增重、特定生长率、摄食量和存活率在各处理间无显著差异（p > 0.05）。FCR在OP5和OP10组更优，而在OP20组显著变差（p < 0.05）。PER在OP5组较高，在OP20组较低（p < 0.05）。基于二次多项式回归，最小FCR点估算最佳橄榄渣添加量为7.22%，最大PER点估算为8.55%。CF值在OP0、OP5和OP10组较高，OP20组最低（p < 0.05）。HSI和IQ在各处理间无显著差异（p > 0.05）。VSI在OP15和OP20组显著升高，OP0和OP5组最低（p < 0.05）。CY随橄榄渣添加水平增加而逐渐下降，OP0组最高，OP20组最低（p < 0.05）。在体组成和营养物质沉积方面，水分含量在OP15和OP20组较高，OP0组较低（p < 0.05）。粗蛋白含量随橄榄渣添加水平增加而下降，OP20组显著较低（p < 0.05）。脂质水平在OP15和OP20组较其他处理降低（p < 0.05），灰分含量在这些组显著升高（p < 0.05）。蛋白质沉积在OP5、OP10和OP15组较高，OP20组最低（p < 0.05）。脂质沉积在OP5和OP10组较高，较高添加水平下显著降低（p < 0.05）。在生化分析方面，饲料中添加橄榄渣未显著影响肝脏糖原水平（p > 0.05）。相反，OP5和OP15组肌肉糖原含量最高，其次为OP10和OP20组，对照组最低（p < 0.05）。血浆葡萄糖水平在对照组最高，随橄榄渣添加逐渐降低，OP20组最低（p < 0.05）。肝脏葡萄糖水平在OP20组最高，OP5和OP10组最低（p < 0.05）。血浆胆固醇在各处理间无显著差异（p > 0.05）。肝脏胆固醇在OP5组最低，OP10组最高，其次为OP15和OP20组（p < 0.05）。血浆甘油三酯在OP0、OP5和OP10组较低，OP20组最高（p < 0.05）。肝脏甘油三酯在OP10、OP15和OP20组显著较高，OP0和OP5组最低（p < 0.05）。血浆总蛋白在OP15和OP20组最高，OP0组最低（p < 0.05）。肝脏总蛋白在OP20组显著升高（p < 0.05）。在脂质过氧化方面，肌肉组织中TBARS水平随橄榄渣添加而升高，OP20组显著最高（p < 0.05）。相反，肝脏TBARS水平在各组间无显著差异（p > 0.05）。

在讨论部分，研究人员指出，将橄榄渣作为鱼类饲料替代原料的研究因其改善生产性能、饲料效率和免疫反应的潜力而受到关注，同时有助于部分替代鱼油和农工业副产物的再利用。在本研究中，中等剂量橄榄渣添加有利于尼罗罗非鱼幼鱼的生长性能、生产性能指标和体组成，但高水平添加产生不利影响。5%–10%橄榄渣添加改善了生产性能，而20%橄榄渣损害了饲料转化、蛋白质效率比和肥满度。末体重、增重、日增重、特定生长率和摄食量无差异表明橄榄渣添加不损害实验期间生长性能和存活率。然而OP20组较差的FCR和降低的PER表明较高添加水平下营养物质利用效率降低，可能与较高粗纤维含量限制消化率以及更多抗营养因子（如单宁）干扰蛋白质消化吸收有关。二次多项式回归估算最小FCR的饲料添加水平为7.22%，最大PER为8.55%。这些结果与其他鱼类研究一致，较低水平橄榄渣（2.5–50 g/kg）添加改善了饲料利用和生产性能。这种响应可能与橄榄渣中酚类化合物（如橄榄苦苷、羟基酪醇和类黄酮）的毒物兴奋效应有关。毒物兴奋效应是指剂量依赖的双相响应，低浓度促进刺激效应，高浓度产生抑制效应，导致增强适应性和整体健康的适应性反应。橄榄苦苷和羟基酪醇具有抗氧化、降血脂、心脏保护和抗菌特性，低浓度下可增强生产性能，但较高添加水平下与增加的纤维组分和抗营养因子相关时变得有害。本研究中试验饲料总多酚和总黄酮浓度随橄榄渣添加逐渐增加，与毒物兴奋效应假说一致。较高橄榄渣添加水平饲料中粗纤维和其他纤维组分的逐渐增加与较低消化率相关，因为鱼类降解木质纤维素组分的能力有限。酚类化合物和抗营养因子（包括单宁）可与蛋白质形成复合物并抑制消化酶，降低氨基酸可用性并损害蛋白质利用。这些机制被提出来解释高纤维饲料中饲料效率降低和体组成变化。类似地，Harmantepe等（2016）报道罗非鱼饲喂含24%–36%橄榄渣饲料时生长、摄食量和蛋白质效率降低，将较差生产性能归因于较低蛋白质质量和可能必需氨基酸缺乏。体组成反映了这一模式，橄榄渣水平增加导致水分和灰分含量升高、蛋白质和脂质沉积降低，尤其在OP15和OP20组，表明营养物质利用受限，可能与抗营养因子和纤维组分干扰消化和肠道吸收有关。本研究中15%和20%添加水平饲料粗纤维含量显著增加（与对照组相比分别增加172.4%和261.2%）。蛋白质和脂质含量降低可能促进组织水分保留增加，解释较高水分含量，而OP15和OP20组灰分增加可能与橄榄渣较高矿物质贡献有关。生产性能指标支持这一解释。尽管HSI和IQ不变，较高添加水平下VSI增加表明胃肠道对较高纤维含量的形态生理适应，可能是优化消化和营养物质吸收的代偿机制，因为高纤维含量可影响胃肠通过时间并强化这一适应性反应。此外，这种适应伴随胴体率降低，胴体率是与生产效率直接相关的指标。橄榄渣添加诱导了鱼类能量和脂质代谢变化，取决于饲料添加水平，与观察到的生产性能、体组成和生产性能指标响应相关。关于能量代谢，肝脏糖原水平在各处理间无差异，表明即使在最高添加水平下该碳水化合物的储存能力得以维持。相反，所有添加橄榄渣组肌肉糖原显著较高。鉴于糖原是肝脏和肌肉组织中葡萄糖储存的主要形式，这种行为表明能量流重新分配，可能与糖酵解和糖异生途径调控有关，并受饲料组成和能量可用性影响。血浆葡萄糖随橄榄渣添加逐渐降低支持这一假说。OP20组肝脏葡萄糖升高，而OP5和OP10组较低肝脏水平伴随较高肌肉糖原积累。这表明中等添加水平下外周葡萄糖摄取和利用效率较高，与这些处理中较优生产性能一致。相反，OP20组肝脏葡萄糖积累伴随较高FCR和较低PER，表明较高添加水平下葡萄糖代谢利用可能受限。关于脂质代谢，各处理间血浆胆固醇无显著差异。然而肝脏胆固醇在各组间变化，OP5组较低，OP10、OP15和OP20组较高。这种行为可能与橄榄渣中酚类化合物的作用有关，低添加水平下可影响调控途径如AMPK参与脂肪生成和胆固醇合成调控。然而在较高添加水平下，这种效应可能被过量橄榄渣导致的代谢改变减弱或掩盖，导致肝脏脂质积累。甘油三酯呈现类似模式，血浆浓度在OP0、OP5和OP10组最低，OP20组最高，表明高添加水平下脂质调控可能受损。肝脏中与胆固醇类似，OP10、OP15和OP20组甘油三酯显著增加。血浆总蛋白在OP15和OP20组较高，伴随OP20组肝脏总蛋白增加。这种模式可能表明与饲料橄榄渣添加生理适应相关的蛋白质代谢改变。尽管总蛋白常被用作鱼类生理状态指标，其升高可受多种因素影响，包括代谢调整和蛋白质合成变化。考虑到较高橄榄渣摄入水平下饲料转化变差、蛋白质效率比降低和肝脏葡萄糖和脂质积累，总蛋白浓度升高可能与代谢需求增加或对营养应激的生理响应有关。这些结果表明饲喂最高橄榄渣水平的鱼尽管维持一致生长性能，但可能承受较高代谢成本以维持稳态。这种响应可能与较高纤维含量（可降低营养物质消化率和利用率）和橄榄渣中天然存在的较高不饱和脂肪酸摄入（这些脂肪酸中的双键使其在氧化条件下更易发生脂质过氧化）的联合效应有关。此外，较高浓度酚类化合物虽然通常被认为具有抗氧化特性，但过量摄入产生促氧化效应并可能促进氧化失衡。因此，较高橄榄渣添加组中观察到的生化改变和增加的氧化应激与过量橄榄渣水平导致的较大代谢负荷一致。关于氧化应激，各处理间肝脏脂质过氧化无显著差异，表明肝脏抗氧化能力得以维持。然而肌肉TBARS水平随橄榄渣添加逐渐升高，OP20组较高。该结果表明高添加水平下肌肉组织对氧化应激的易感性增加。肌肉脂质过氧化增加与肝脏能量底物积累和生产性能变差相关，强化了高水平橄榄渣添加的负面影响。

结论部分，基于FCR和PER的回归模型，建议在尼罗罗非鱼幼鱼饲料中添加7.22%–8.55%的橄榄渣。尽管54天饲喂试验期间生长性能未受影响，但较高添加水平损害饲料效率并促进生化改变，此外增加肌肉氧化应激。因此，橄榄渣作为尼罗罗非鱼幼鱼饲料替代原料具有潜力，但需以适当水平添加。然而，由于本研究实验周期相对较短，需要长期饲喂试验以验证推荐添加水平并评估橄榄渣对鱼类性能、健康和生理状态的长期影响。