《GeroScience》：Claudin-1 as a potential marker of stress-induced premature senescence in vascular smooth muscle cells
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细胞衰老（cellular senescence）是一种永久性细胞周期阻滞状态，可由外部应激引起，称为应激诱导早衰（stress-induced premature senescence, SIPS），或由细胞分裂潜能耗竭引起，称为复制性衰老（replicat
细胞衰老（cellular senescence）是一种永久性细胞周期阻滞状态，可由外部应激引起，称为应激诱导早衰（stress-induced premature senescence, SIPS），或由细胞分裂潜能耗竭引起，称为复制性衰老（replicative senescence, RS）。尽管已有众多生物标志物，但区分SIPS与RS仍具挑战性。研究人员提出claudin-1（CLDN1）作为血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）中SIPS的潜在细胞特异性标志物。在该研究中，经历RS或SIPS的VSMCs与对照细胞相比表现出更高水平的CLDN1 mRNA。ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）结果表明，在SIPS和RS中，基因启动子区域均呈现更开放的染色质状态，表现为更宽的H3K4me3峰。然而，仅在SIPS中，宽H3K4me3峰和升高的mRNA水平转化为更高的蛋白质水平，这暗示RS中存在不同的调控机制。此外，该蛋白的核积累也仅为早衰细胞的特征。在从动脉粥样硬化斑块（atherosclerotic plaques）中分离的VSMCs中也观察到CLDN1水平升高，尽管这高度依赖于供体。这些发现表明，早衰细胞中CLDN1水平升高可作为VSMCs中SIPS的有前景的细胞特异性标志物，无论在体外（in vitro）还是离体（ex vivo）条件下。研究人员讨论了可能导致claudin-1上调以及造成SIPS与RS之间差异的潜在机制。鉴定不同衰老类型的特异性新标志物可能有助于识别促进加速衰老的条件，从而有助于年龄相关疾病的发生和进展。
心血管疾病每年仍是全球首要死因，其核心病理基础之一是动脉粥样硬化的发生发展。动脉粥样硬化斑块中含有大量表现出细胞衰老特征的血管平滑肌细胞（VSMCs）。细胞衰老被定义为不可逆的细胞周期阻滞，可由复制潜能耗竭引起，即复制性衰老（RS），或由多种外部刺激引起，即应激诱导早衰（SIPS）。RS与SIPS共享大量共同特征，最典型的是衰老相关β-半乳糖苷酶（SA β-gal）活性升高，以及p53、p21、p16蛋白水平升高或Ki67、lamin B1表达降低。然而，迄今尚无明确标志物能够区分SIPS与RS。Claudin-1（CLDN1）与其他24种claudin家族成员、occludin、连接黏附分子（JAM）及闭锁小带蛋白-1（ZO-1）共同构成细胞间紧密连接（TJs），其主要功能在于控制上皮通透性。CLDN1通过与其他紧密连接蛋白及细胞骨架肌动蛋白相互作用，影响细胞组织和迁移能力。此外，claudin家族在维持细胞膜极性、细胞分化及机体发育中发挥关键作用。CLDN1通常表达于血管内皮细胞（尤其是构成血脑屏障者）、表皮及胃肠道上皮细胞。然而，在某些生理和病理情况下，claudin-1也被观察到存在于膜以外的细胞区室，即细胞质和细胞核中。CLDN1上调与细胞迁移潜能增加相关，被认为是支持肿瘤侵袭的机制之一。关于CLDN1在VSMCs中的作用所知甚少，尤其是在衰老背景下，尽管CLDN1的别名即为衰老相关上皮膜蛋白1（SEMP1），首篇描述其mRNA在衰老细胞中上调的论文即以此命名。本研究基于衰老VSMCs的转录组图谱选择CLDN1进行深入分析，旨在探究衰老相关CLDN1上调的机制及其作为SIPS标志物的潜力。
研究人员开展了以下研究：基于衰老VSMCs的转录组学分析筛选出CLDN1，利用已建立的实验体系（包括doxorubicin诱导的DNA损伤依赖性SIPS、curcumin诱导的DNA损伤非依赖性SIPS以及连续传代建立的RS模型），对基因和蛋白表达谱及CLDN1的细胞内定位进行了表征。此外，研究人员深入分析了染色质调控机制，揭示了衰老细胞中CLDN1基因启动子区域存在以更宽H3K4me3峰为特征的开放染色质状态。扩展的实验设置（包括额外的衰老诱导剂H2O2以及静息态和汇合态细胞）证实了SIPS细胞中CLDN1的上调，进而促使研究人员在从动脉粥样硬化斑块分离的细胞中检验CLDN1作为SIPS标志物的可行性。研究得出结论：CLDN1上调可作为VSMCs中SIPS的细胞特异性标志物，在体外和离体条件下均具有应用前景。该研究的重要意义在于首次提出了能够区分VSMCs中SIPS与RS的特异性标志物，有助于识别促进该类型细胞加速衰老的因素，从而为年龄相关疾病的早期识别和干预提供新思路。
研究人员为开展本研究采用的主要关键技术方法包括：细胞培养方面，人VSMCs购自ATCC和Gibco，来自至少三个不同年轻男性供体；动脉粥样硬化斑块来源的平滑肌细胞取自六例接受颈动脉内膜切除术的患者。SIPS诱导采用100 nM doxorubicin、7.5 μM curcumin或150 μM H2O2处理7天；RS通过连续传代至第22代获得；静息态细胞通过无血清培养7天获得。衰老评估采用BrdU掺入实验和SA β-Gal染色。基因表达分析采用Affymetrix Gene Atlas系统的DNA微阵列和实时定量PCR（qPCR）。蛋白表达和定位分析采用Western blotting和免疫荧光染色，核质分离使用NE-PER试剂盒。染色质状态分析采用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），使用抗H3K4me3和抗H3K9me3抗体。统计采用单因素方差分析（one-way ANOVA）配合Dunnett事后检验。
结果部分：（1）Claudin-1在SIPS细胞中高表达而在RS细胞中不表达——通过DNA微阵列发现CLDN1在doxorubicin处理的SIPS细胞中表达升高超过十倍，在curcumin处理的SIPS细胞中升高四倍，而在RS细胞中无显著变化；qPCR证实SIPS中CLDN1上调，RS细胞mRNA水平虽较对照高两倍但蛋白水平未升高；Western blotting检测到CLDN1蛋白仅在SIPS细胞中升高；ChIP-seq显示SIPS和RS细胞中CLDN1启动子区H3K4me3峰均较对照增宽，但仅SIPS中转化为蛋白水平升高；免疫荧光和核质分离Western blotting证实CLDN1核积累仅为SIPS细胞的特征。（2）Anillin作为非增殖细胞标志物——微阵列和qPCR数据显示ANLN转录本在两种衰老类型中均显著降低，Western blotting证实蛋白水平下降；免疫荧光显示ANLN在所有条件下均定位于细胞核，衰老细胞信号显著减弱，部分SIPS细胞中出现特征性ANLN焦点。（3）CLDN1表达升高不依赖于细胞汇合度和可逆性细胞周期阻滞——在静息态细胞、汇合态年轻和RS细胞以及H2O2处理的SIPS细胞中检测蛋白水平，发现CLDN1蛋白升高仅见于curcumin、doxorubicin或H2O2处理的早衰细胞，而在年轻、静息态和RS细胞中极低或检测不到；H2O2处理组虽无统计学显著性但每次实验均观察到CLDN1高表达；VSMCs中从未观察到claudin-1的膜定位。（4）CLDN1作为离体评估衰老类型的潜在标志物——从六例不同供体的动脉粥样硬化斑块中分离细胞，比较CLDN1和ANLN蛋白水平与体外年轻、SIPS和RS VSMCs，发现所有供体细胞ANLN条带缺失提示大多不增殖；供体3和4 CLDN1表达显著升高且ANLN降低，提示以早衰为主；供体1和2 CLDN1轻度升高，提示早衰细胞比例较小；供体5和6 CLDN1和ANLN均检测不到，与RS模式一致。
讨论部分总结：研究提出CLDN1作为VSMCs中SIPS的细胞特异性标志物。微阵列分析显示CLDN1 mRNA在早衰细胞中显著上调而在RS中无变化；qPCR显示两种衰老类型mRNA均上调但RS幅度较小，蛋白水平升高仅见于SIPS，提示RS中存在转录后调控。ChIP-seq分析提示CLDN1表达可能受TSS处H3K4me3富集调控，两种衰老类型中均检测到宽H3K4me3峰，可能促进转录因子结合。Sirtuin 1（SIRT1）作为CLDN1负调控因子，其下降是通用衰老标志物，但不能解释SIPS与RS之间的差异。TNFα和IL-1β在两种衰老VSMCs中均未观察到升高。CLDN1蛋白水平在curcumin或doxorubicin处理后48小时开始升高，而应激标志物HO-1在24小时即上调，提示CLDN1可能由应激诱导但非第一响应蛋白。汇合态和静息态细胞中CLDN1未见升高，提示其升高不依赖于细胞间接触增加或暂时性细胞周期退出。VSMCs中CLDN1主要定位于细胞核，核定位已在其他细胞类型中观察到且多与病理条件相关。研究人员提出SIPS中CLDN1上调是细胞对氧化应激等应激条件响应的一部分，RS中sirtuin 1水平逐渐下降可能导致CLDN1表达较低。CLDN1在动脉粥样硬化斑块来源细胞中的差异表达反映了斑块异质性。研究结论翻译：总之，研究人员提出claudin-1上调作为VSMCs中SIPS的标志物。研究人员倾向于排除VSMCs中claudin-1上调由TNFα和IL-1β升高所致的可能性，但不能排除SIPS与RS中CLDN1表达的差异与sirtuin 1水平下降速率有关的可能性。Claudin-1升高可能对衰老并非关键，其下调不会保护 against 衰老，这可基于RS细胞中claudin-1水平未升高这一事实推断。研究人员提出SIPS中claudin-1上调是细胞对应激条件响应的一部分，然而需要更详细的研究来阐明导致claudin-1表达升高的直接机制。现有知识尚不能清晰理解SIPS中claudin-1升高的角色，但其升高伴随衰老，这已由广泛接受的衰老标志物的存在所证实。
