《Frontiers in Plant Science》：Speed breeding accelerates the conversion of waxy maize inbreds to C-type cytoplasmic male sterility for hybrid seed production
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杂交玉米种子生产需要雄性不育母本系，然而通过传统田间回交将优良自交系转育为细胞质雄性不育（CMS）系需要数年时间。本研究的目标是开发一套适用于玉米的speed breeding（SB）方案，并将其应用于通过连续回交结合花丝育性的平行表型评价，将母本系快速转育至
杂交玉米种子生产需要雄性不育母本系，然而通过传统田间回交将优良自交系转育为细胞质雄性不育（CMS）系需要数年时间。本研究的目标是开发一套适用于玉米的speed breeding（SB）方案，并将其应用于通过连续回交结合花丝育性的平行表型评价，将母本系快速转育至CMS-C细胞质（Charrua）。研究工作以糯母本系V158wx和WF-9wx为材料，二者为杂优杂交种"Rustark AP"、"Volya"和"Waterloo"（LLC "Agroplazma"）的亲本组分。CMS-C供体与母本系的杂交在田间条件下进行；对于V158wx系，第一次回交亦在田间进行。后续杂交在SB培养箱中进行，并额外应用胚培养。玉米的五个回交世代在13个月内完成。在SB条件下，玉米雄穗平均在52.0–57.1天开花（依基因型而异），花丝晚2.0–2.3天抽出。五个世代的全世代周期平均为79.0–81.2天。尽管存在母本与父本系花期同步等困难，在SB中进行杂交仍被证明非常高效。在所进行的五个回交中，V158wx-C和WF-9wx-C平均每穗分别产生176.3粒和241.4粒杂交籽粒。在SB条件下对BC4F1 WF-9wx-C和BC5F1 V158wx-C植株进行雄穗和花粉育性评估，结果显示其花药皱缩、未从花颖中伸出，且含有无活力花粉。GBS基因分型证实与轮回亲本的相似度逐步提高：WF-9wx-C从F1的50.3%提高至BC5F1的96.5%，V158wx-C从BC1F1的86.7%提高至BC5F1的98.3%。五次回交后，所创建的CMS类似系在田间条件下播种，表现出雄性不育且表型与轮回亲本相似。两套在SB条件下培育的不育类似系（V158wx-C和WF-9wx-C）将被纳入杂优杂交种的工业化种子生产。据研究人员所知，这是将SB与玉米材料中CMS细胞质回交转育相结合、获得商业化杂交种亲本系CMS版本的首次实践性展示。该方法对常规育种项目具有广泛的可及性，不仅适用于玉米，也适用于向日葵、油菜和水稻等其他作物。
研究背景方面，杂种优势是杂交F1后代优于自交亲本的现象，是现代玉米生产的基础。工业化杂交种子生产要求母本植株不被自身花粉授粉，传统上通过人工去雄实现，但该步骤劳动密集且可使自交系种子产量降低多达40%。细胞质雄性不育（CMS）免除了去雄需求，使CMS系成为理想的母本。现代玉米F1杂交种子生产采用CMS与核基因育性恢复（Rf）互补的三系A/B/R系统。玉米已知三种CMS类型：CMS-T、CMS-S和CMS-C，其中CMS-C具有稳定的雄性不育且不降低产量，在杂交玉米实践中尤为重要。然而瓶颈在于优良系向CMS的转育：该过程涉及不育细胞质供体与保持系B杂交，随后进行一系列回交直至轮回亲本基因组恢复至少95–98%，整个过程平均需要约5–6个回交世代，主要限制是时间，回交程序可能延续数年。为缩短这一周期，研究人员正在积极探索生物技术策略，如基于父本单倍体产生的系统、遗传转化和基因组编辑方法（SPT、CRISPR/Cas9编辑Ms26、ASPT系统等），但这些方法依赖基因型特异性的农杆菌介导转化且涉及转基因中间体。Speed breeding（SB）是一种通过加速开花的生长条件结合缩短生殖阶段和打破收获后种子休眠的方法，可显著缩短世代时间，对长日和短日作物每年可达多达六个世代，与标记辅助回交结合时尤为高效。尽管玉米在农业生产中地位重要，但针对该作物的SB方案近来才开始出现，且已有研究仅使用单一基因型且未超过一个世代，迄今尚无研究涉及SB在玉米育种项目中的实际应用。糯玉米因其淀粉直链淀粉含量低（0–8%，普通玉米为25–28%）、支链淀粉相对丰富而具有独特的糊化和热学特性及广泛的食品和工业用途，糯性表型由编码颗粒结合淀粉合酶（GBSS-I）的wx1基因赋予，但糯玉米可能表现出对胁迫的高响应性从而导致产量和籽粒品质下降。因此，将SB与糯玉米CMS转育相结合本身即是一项具有挑战性的任务。本研究旨在：（i）开发一套适用于短日玉米的SB方案，并将其应用于糯母本系（V158wx和WF-9wx核背景）向CMS-C细胞质的加速回交转育；（ii）通过评估雄性不育、表型验证转育类似系与轮回系的一致性，并利用基因分型测序（GBS）表征连续回交世代中轮回亲本遗传背景的恢复情况来确认所获得植株的转育；（iii）将转育类似系作为亲本系的CMS版本交付工业化种子生产。据研究人员所知，此前尚无工作将SB应用于CMS转育（无论是在玉米还是其他作物中）。
研究人员开展的研究方面，所用母本系V158wx和WF-9wx为糯杂交种Rustark AP、Volya和Waterloo的亲本系，CMS-C（Charrua）供体为品系stA264c/53c。转育通过连续回交进行，产生两个携带CMS-C细胞质的转育不育类似系：V158wx-C（V158wx核）和WF-9wx-C（WF-9wx核）。初始杂交（细胞质转换）在田间进行，CMS供体作母本、待转育系（轮回亲本）作父本。进一步的轮回亲本核基因组恢复在SB条件下通过一系列连续回交进行：WF-9wx进行五次回交，V158wx第一次回交在田间进行、后续五次在SB中进行，除最后一个SB世代外每个培养箱回交世代均对胚进行胚培养。研究结果表明，SB使玉米在13个月内完成五个回交世代：V158wx-C五个连续世代在395天内完成，WF-9wx-C在406天内完成。在SB条件下，依基因型不同雄穗在52.0–57.1天开花，花丝晚2.0–2.3天抽出，五个世代的全世代周期平均为79.0–81.2天。五个回交中V158wx-C和WF-9wx-C平均每穗分别产生176.3粒和241.4粒杂交籽粒。胚培养再生频率高达93–100%，适应频率为100%。在最后一个SB周期，BC4F1 WF-9wx-C和BC5F1 V158wx-C的100%植株雄穗花药皱缩、未从花颖伸出（评分0），花粉败育；而轮回亲本WF-9wx和V158wx雄穗可育、花药伸出开裂、花粉可育（评分5）。碘液测试证实所有系100%籽粒呈糯性（红棕色）反应。田间条件下创建的C系同样表现雄性不育且表型与轮回亲本相似。GBS基因分型证实轮回基因组恢复：WF-9wx-C从F1的50.3%提高至BC5F1的96.5%，V158wx-C从BC1F1的86.7%提高至BC5F1的98.3%。两套不育类似系将被纳入工业化杂交种子生产。该研究的重要意义在于，据研究人员所知，这是将SB与玉米材料CMS细胞质回交转育相结合、获得商业化杂交种亲本系CMS版本的首次实践性展示，该方法对常规育种项目具有广泛可及性，不仅适用于玉米，也适用于向日葵、油菜和水稻等作物。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究采用适应短日玉米的speed breeding方案，在受控环境培养箱中设置14/10 h光周期、约630 μmol·m?2·s?1光强、28/25 °C温度及控制湿度进行加速栽培，并通过分期播种同步花期；结合胚培养技术（授粉后14天分离未成熟胚接种于不含生长调节剂的MS培养基）缩短世代周期；采用花丝育性分级评估和醋酸洋红压片法显微评估花粉育性；利用Lugol碘液染色鉴定糯性胚乳；通过GBS（ApeKI酶切、SURFSeq 5000测序、比对至Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0）进行全基因组基因分型评估轮回亲本恢复；并在克拉斯诺达尔边疆区开展田间试验。样本队列来源为LLC "Agroplazma"的糯玉米母本系V158wx和WF-9wx及CMS-C供体stA264c/53c。
研究结果方面：3.1 Speed breeding使玉米在13个月内完成五个回交世代——通过受控环境下的连续回交，两系在一年余（13个月）内完成五个回交世代，V158wx-C五个世代395天、WF-9wx-C 406天；SB条件下雄穗平均52–57天开花、花丝晚2–2.3天，全世代周期平均79–81.2天，V158wx-C雄穗开花时间在世代间存在显著差异（p<0.05），WF-9wx-C则无显著差异。3.2 SB条件下玉米杂交籽粒结实与胚培养评估——通过五个连续周期的杂交，WF-9wx-C平均每穗241.4粒、V158wx-C平均176.3粒杂交籽粒；胚培养再生频率93–100%、适应频率100%，所有经胚培养获得并授粉的植株均在穗上形成种子。3.3 转育CMS系的表型、不育性与糯性——通过碘液测试证实原始系和转育类似系籽粒100%呈糯性反应；通过雄穗和花粉育性评估显示BC4F1 WF-9wx-C和BC5F1 V158wx-C全部植株花药皱缩、未伸出、含无活力花粉，而轮回亲本花粉完全可育；田间试验定性确认C系雄性不育且表型与轮回亲本相似。3.4 WF-9wx和V158wx遗传背景恢复动态——通过GBS基因分型（合并调用集含440,952个变异位点，双等位SNP 376,230个；WF-9wx面板4,129个位点、V158wx面板523个位点）证实轮回亲本一致性：WF-9wx-C从F1的50.3%升至BC5F1的96.5%，V158wx-C从BC1F1的86.7%升至BC5F1的98.3%，非轮回等位基因负荷相应下降。
讨论部分总结：在SB玉米方面，本研究方案显示雄穗在播种/胚分离后平均52–57天开花、花丝56–59天抽出，与已发表数据接近但涵盖了两种母本系和五个回交世代，提供了更全面的花期范围认识；胚培养是SB的理想补充，再生频率93–100%、适应频率100%，每个世代约节省15天；平均每穗结实较高但变异大，主要归因于花期不匹配、花丝老化、花粉稀少、授粉频率差异及蓟马和红蜘蛛危害；完全成熟需80–91天。在SB条件下玉米母本系向不育细胞质转育方面，田间杂交和（仅V158wx-C）第一次回交后，后续五个回交在一年内于SB条件下完成，证实了SB的灵活性；不育性在SB和田间条件下均表现稳定；转育系表型与轮回亲本相似且糯性胚乳特征一致；GBS证实轮回基因组恢复，所有数值视为观察下限，因研磨籽粒组织低估恢复度。在前景与局限方面，SB可加速转基因供体植株生产、重组自交系和渗入系培育（约1.5年），本方案约每年4.5个世代，比一年两代的田间转育快两倍以上、比一年一代快约4.5倍，且比双单倍体或遗传转化等生物技术方法更简单；局限包括基础设施投入高、11 L盆占用面积大、植株高大（超过2 m）、高光强成本、电力供应风险以及劳动密集型手工操作；糯玉米对胁迫的响应性可能使非糯玉米在SB条件下挑战更小；该方案也适用于向日葵、油菜和水稻等其他基于CMS系统开发杂优杂交种的作物。
研究结论部分翻译：研究人员开发了一套玉米speed breeding（SB）方案，并将其应用于通过连续回交将糯母本系V158wx和WF-9wx（杂交种"Rustark AP"、"Volya"和"Waterloo"的亲本组分）快速转育至C型CMS（Charrua）细胞质。在speed breeding条件下，雄穗在52–57天开花，花丝晚2.0–2.3天抽出，全世代周期为79–81.2天。结合胚培养的五个回交周期在略超过13个月内完成（V158wx和WF-9wx分别为395天和406天），远快于传统田间回交。在第五个SB周期，雄穗和花粉育性评估显示BC4F1 WF-9wx-C和BC5F1 V158wx-C植株的花药皱缩、未从花颖中伸出且含无活力花粉。GBS基因分型证实轮回基因组恢复：WF-9wx-C从F1的50.3%提高至BC5F1的96.5%，V158wx-C从BC1F1的86.7%提高至BC5F1的98.3%。所创建的CMS类似系在田间表现雄性不育，且在植株习性、开花时间、穗型和籽粒性状方面表型与轮回亲本相似。两个不育系现已可用于工业化杂交种子生产。据研究人员所知，这是SB用于玉米CMS回交转育的首次展示。重要的是，该方法易于适配玉米及向日葵、油菜和水稻等其他作物的常规育种流程。
