《Frontiers in Pharmacology》：Malus domestica fruit-derived vesicles extract protect against upstream cellular hallmarks of vascular inflammation and epithelial barrier dysfunction
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背景：菌群失调损害肠道屏障，促进炎症分子向血流全身易位，最终促成心血管疾病。本研究评估苹果来源细胞外囊泡（apple-derived extracellular vesicles, ADEVs）作为免疫调节信号的天然载体，以非侵入方式恢复免疫稳态，同时预防血管
背景：菌群失调损害肠道屏障，促进炎症分子向血流全身易位，最终促成心血管疾病。本研究评估苹果来源细胞外囊泡（apple-derived extracellular vesicles, ADEVs）作为免疫调节信号的天然载体，以非侵入方式恢复免疫稳态，同时预防血管炎症和上皮屏障功能障碍。方法：ADEVs通过切向流过滤（tangential flow filtration, TFF）从苹果（Malus domestica）中分离，并通过颗粒浓度、粒径分布和总蛋白含量进行表征。在多种储存温度试验中评估囊泡完整性和货物稳定性。在体外人类细胞系和体内小鼠模型中评估ADEVs对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导炎症的免疫调节作用。结果：通过该可扩展纯化方法分离的ADEVs在冷冻保存后保持结构完整性、浓度和粒径均一性。功能试验显示，ADEVs显著加固肠道上皮屏障、抑制促炎信号传导并阻止内皮活化，有效阻断单核细胞募集的關鍵机制。在小鼠模型中，ADEVs在数小时内被安全代谢，未在主要器官中蓄积。关键的是，ADEVs诱导免疫细胞向促消退和功能状态双重极化，成功重校准全身免疫稳态。结论：ADEVs作为高效、生物相容的天然调节信号载体，可减轻炎症反应。通过同时加固肠道屏障和调节免疫活性，ADEVs代表一种可行的、微创的治疗策略，针对血管炎症和上皮功能障碍的上游细胞驱动因素。
心血管疾病（cardiovascular diseases, CVDs）仍是全球发病率和死亡率的主要原因，涵盖从早期血管功能障碍到急性心肌梗死的广泛病理谱。近二十年来，动脉粥样硬化形成范式发生显著转变，慢性低度血管炎症被确认为内皮功能障碍和斑块进展的主要驱动因素。基础和临床试验证实，选择性靶向白细胞介素-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）先天免疫通路可显著降低心血管事件发生率，且独立于降脂作用。肠道-心血管轴日益被认为是下游血管级联反应的关键上游调节因素。环境应激、不良饮食和缺乏运动常破坏共生肠道微生物群，诱导菌群失调，其特征为产丁酸共生菌丢失和促炎致病菌过度生长。该失调状态损害肠道上皮屏障的结构完整性，促进炎症分子向血流全身易位。进入循环后，这些内毒素触发免疫细胞和内皮上的Toll样受体4（toll-like receptor 4, TLR4）信号传导，诱导严重氧化应激并上调黏附分子。血管通透性增加使低密度脂蛋白（low-density lipoproteins, LDLs）和单核细胞浸润至内皮下空间，加速巨噬细胞泡沫细胞形成和动脉粥样硬化斑块进展。此外，肠道微生物群对膳食磷脂酰胆碱的代谢改变产生促动脉粥样硬化中间体如三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide, TMAO），直接促进血小板高反应性和血管炎症。这些炎症分子的慢性全身易位最终到达心肌，过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）诱导线粒体应激、心肌细胞凋亡和肌成纤维细胞不良细胞外基质重塑，最终导致心室僵硬和心力衰竭。这些病理通路之间的复杂交互突显了一个关键治疗窗口：在炎症信号级联驱动晚期斑块形成和不可逆心脏损伤之前，于肠道-心血管界面拦截这些信号。流行病学证据证实富含全水果的饮食具有广泛心脏保护作用，但生果消费面临严重药代动力学限制。全食物基质中的生物活性货物高度易受胃肠道降解，全身生物利用度差，且存在显著的批次间变异性。此外，仅通过饮食达到抑制血管炎症所需的局部治疗浓度将需要不可行且适得其反的大量生果和糖摄入。为克服这些临床和饮食限制，植物来源细胞外囊泡（plant-derived extracellular vesicles, PDEVs）已成为高度生物相容的天然衍生解决方案。细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）通过运输脂质、蛋白质和核酸主动调节生理过程，是细胞间通讯的关键介质。作为特化天然递送载体，PDEVs具有结构可扩展性、低免疫原性和口服生物利用度，保护脆弱治疗货物免受胃降解，其纳米级尺寸促进跨肠道屏障的主动转运。近年来，PDEVs被认为是跨物种通讯的关键介质，具有加固上皮边界和对抗炎症级联的独特能力。值得注意的是，从甜橙（Citrus sinensis）分离的囊泡通过上调闭合小带蛋白-1（Zonula Occludens-1, ZO-1）和occludin等关键紧密连接蛋白，同时抑制促炎基因网络，积极维持肠道屏障完整性。这一胃保护范式延伸至多种植物来源，指向可食用PDEVs间保守的作用机制。例如，蓝莓来源EVs在模拟胃肠道转运中保持结构稳定性以防止高通透性，而石榴来源囊泡携带包括鞣花酸在内的生物活性亲脂货物，有效缓解肠道渗漏和下游全身器官损伤。此外，工程化生物杂合制剂，如将治疗性siRNA封装在金属有机框架内的姜来源EVs，展示了天然植物囊泡膜靶向局部黏膜炎症和恢复肠道微生物群平衡的临床潜力。总之，这些发现强调水果来源囊泡作为复杂天然递送系统，能够加固紧密连接网络并抑制黏膜炎症，研究人员现将这一框架扩展至苹果（Malus domestica）。早在现代药理学出现之前，苹果在传统医学体系中占据突出地位，在经典“食药”框架内运作，膳食成分被有意用于管理循环系统疾病。栽培苹果被广泛认为是多种植物化学物质和必需微量营养素的主要膳食来源，其特征为复杂的生物活性多酚和可溶性膳食纤维谱。这些成分主要浓缩于果皮和果肉中，表现出强大的抗氧化、抗炎和酶抑制特性，支撑苹果在慢性病预防中的传统和现代治疗价值。基于这些生化特征，累积的临床证据表明，定期食用全苹果和苹果衍生品转化为可测量的代谢和心血管益处，包括血脂谱和血压调节的显著改善。此外，近期流行病学发现强调，苹果产品的加工状态和物理形态在临床结局中起决定性作用，对全因死亡率产生不同影响，特别是在高血压患者等高危人群中。虽然现代研究主要将这些益处归因于可溶性纤维和单体多酚，但全苹果消费的历史成功表明存在更复杂的多组分递送系统。新兴范式表明，这些传统“食药”基质在天然纳米颗粒内保护其生物活性货物，导致假设PDEVs代表了解释苹果在血管稳态中历史功效的缺失结构环节。为填补这些知识空白，本研究的主要目标是阐明苹果来源细胞外囊泡（ADEVs）在血管和肠道炎症背景下的机制和转化作用。具体而言，本研究调查ADEVs维持肠道屏障完整性、驱动免疫调节和防止内皮功能障碍的治疗能力。为实现此目标，研究人员使用整合的人类肠道屏障、免疫和内皮细胞模型面板评估ADEVs对急性促炎挑战的保护作用，随后在小鼠模型中对体内生物分布进行初步评估。ADEVs使用基于切向流过滤（TFF）的方案按照细胞外囊泡研究最低信息（Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles, MISEV）指南分离。新鲜苹果清洗后使用榨汁机机械处理获得果汁并分离果渣，提取产率约70%。提取的果汁使用商业酶消化，包括果胶酶，孵育约3小时。消化后样品在4°C过夜倾析以沉淀粗物质。上清通过45 μm纸板过滤器澄清以去除大碎片。澄清果汁随后通过TFF处理，样品在静水压梯度下平行于半透膜循环；低于膜截留值的分子进入渗透物，而较大组分保留在截留物中。后续纯化通过顺序膜基尺寸排阻步骤进行。首先，样品使用0.2 μm聚醚砜（polyethersulfone, PES）膜微滤以去除大颗粒。接着，使用100 kDa PES膜超滤以消除小分子并从微滤渗透物中浓缩囊泡。最后，浓缩囊泡制剂在无菌条件下使用配备0.22 μm PES膜的一次性真空过滤系统无菌过滤。ADEV的粒径分布（nm）和浓度（颗粒/mL）通过纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）使用NanoSight Pro仪器评估。样品根据需要稀释至500倍以保持在仪器最佳灵敏度范围内。如果连续两次稀释产生同一数量级的浓度，则测量被视为有效。监测仪器软件通知以确保测量可靠性。每个样品记录五个30秒视频并用附带软件分析。ADEV形态通过扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）检测。样品在4°C的2.5%戊二醛/0.1 M二甲砷酸钠缓冲液中固定过夜，随后用1% OsO4/0.1 M二甲砷酸钠缓冲液后固定。通过梯度乙醇系列脱水，之后样品包埋于环氧树脂中。腔内分泌物的生物活性和ADEV的膜完整性使用改编自Adamo等人的酶基试验评估。该试验依赖于囊泡内酯酶介导的荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate, FDA）裂解为荧光素。FDA自由穿过脂质膜，但其水解产物荧光素膜不可渗透。因此，仅当FDA进入含功能性酯酶的完整囊泡时才产生荧光信号。简言之，在96孔板中生成荧光素标准校准曲线，将3 × 10^10 ADEVs分装至三个独立孔中。每孔加入FDA（18 μmol），使用多模式微板阅读器在3小时内每15分钟监测荧光动力学。为验证试验特异性，平行对照样品用1% Triton X-100处理。该去垢剂溶解囊泡膜，灭活腔内酯酶保留并消除荧光信号，从而确认未处理样品中的荧光严格来源于完整功能性囊泡。酶活性以nM/min报告。总蛋白浓度使用BCA蛋白测定试剂盒根据制造商说明定量。样品稀释30至50倍以符合测定工作范围，并在96孔板中三重复加载。使用提供的牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）标准品制备校准曲线（0–1 mg/mL）。在562 nm读取吸光度。蛋白质浓度随时间与酶活性一起监测长达4周。分离囊泡的分子身份和纯度谱在研究人员先前研究中建立。由于当前工作中的ADEVs从相同植物来源使用相同的标准化方案分离，其生化组成直接反映先前报道的谱。简言之，总囊泡蛋白用Pierce? BCA蛋白测定试剂盒定量，胰蛋白酶消化，并使用Ultimate 3,000 nanoLC系统偶联Orbitrap Lumos三合一质谱仪在数据依赖采集（data-dependent acquisition, DDA）模式下通过nLC-MS/MS分析。原始谱图使用Proteome Discoverer v2.5对苹果UniProt数据库搜索，过滤至少一个独特肽和错误发现率（false discovery rate, FDR）< 0.1的蛋白质。人内皮细胞、单核细胞和肠上皮细胞在标准化条件下培养以确保实验可重复性。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）维持在补充EGM-2 Single Quots补充剂的内皮生长培养基中。人单核细胞（THP-1细胞）在补充10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中生长。人肠道Caco-2细胞维持在补充10% FBS、1%非必需氨基酸、1% P/S、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠的DMEM中。对于评估ADEVs效果的所有处理试验，细胞首先用磷酸盐缓冲盐水（phosphate-buffered saline, PBS）洗涤，随后在补充外泌体耗竭FBS的完全培养基中孵育而非标准FBS，以防止牛细胞外囊泡干扰。细胞活力使用MTS比色法评估ADEVs的剂量和时间依赖性效应。所有细胞类型接种于96孔板，用递增浓度的ADEVs处理：0、2.5、10、50、100、500和1,000 μg/mL。HUVECs（1 × 10^4细胞/孔）、THP-1单核细胞（5 × 10^4细胞/mL）和Caco-2细胞（6 × 10^4细胞/孔）与不同浓度ADEVs在37°C、5% CO2湿润气氛中孵育24和48小时。在每个时间点，根据制造商说明向每孔加入20 μL MTS试剂。使用微板阅读器在540 nm测量吸光度。吸光度值通过减去空白孔背景校正并归一化至未处理对照（0 μg/mL ADEVs，设为100%活力）。细胞接种于24孔板：HUVECs 5 × 10^4细胞/孔，THP-1单核细胞和单核细胞衍生巨噬细胞2.5 × 10^5细胞/mL。为诱导巨噬细胞分化，THP-1细胞用50 ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）处理24小时，随后在无PMA完全培养基中休息24小时。Caco-2细胞以6 × 10^5细胞/mL密度接种于0.4 μm孔径聚碳酸酯Transwell膜插入物（12 mm直径，12孔格式）上，在标准培养条件下培养21天以允许完全分化和形成极化肠道上皮单层。培养基每2天更换以支持最佳细胞成熟和功能性屏障表型发展。接种和分化后，细胞用三种选定浓度ADEVs（10、100和1,000 μg/mL）预处理。HUVECs、THP-1单核细胞和单核细胞衍生巨噬细胞与ADEVs孵育过夜，而Caco-2细胞孵育24小时，符合其特定生长特征和响应动力学。为在体外模拟炎症，细胞用LPS刺激。HUVECs、THP-1单核细胞和单核细胞衍生巨噬细胞暴露于1 μg/mL LPS 6小时，而Caco-2细胞用10 μg/mL LPS刺激24小时。总RNA使用RNeasy Mini Kit根据制造商说明提取。RNA浓度和纯度使用NanoDrop? ND-1000分光光度计评估。第一链cDNA从500 ng总RNA使用QuantiNova逆转录试剂盒在SimpliAmp热循环仪上合成。定量实时PCR（qRT-PCR）使用QuantiNova SYBR Green PCR Kit with ROX在StepOnePlus实时PCR系统上进行。使用Primer-BLAST设计的基因特异性引物。相对mRNA表达水平使用2?ΔΔCt方法计算，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, GAPDH）作为内部参考基因。数据表示为相对于未刺激对照条件的平均倍数变化。Caco-2细胞中细胞连接结构的靶向基因谱分析使用RT2 Profiler? PCR Array Human Tight Junctions按照制造商方案进行。简言之，500 ng总RNA用RT2 First Strand Kit在SimpliAmp热循环仪上逆转录。cDNA与RT2 SYBR Green Mastermix混合并加载到RT2 Profiler PCR阵列的96孔中。设置StepOnePlus实时PCR系统进行扩增和解离曲线。相对靶基因表达使用2?ΔΔCt方法计算，以五个管家基因（ACTB、B2M、GAPDH、HPRT1和RPLP0）的几何平均Ct值归一化。结果报告为测试组与对照组相比靶基因的倍数变化。Caco-2细胞培养上清收集、离心澄清并保存于?20°C。分泌细胞因子谱使用商业Human Cytokine Antibody Array评估，能够同时检测80种细胞因子。总蛋白浓度使用Pierce? BCA Protein Assay Kit测定。每样品200 μg蛋白与阵列膜过夜孵育。结合的细胞因子使用生物素偶联抗体和链霉亲和素–HRP检测，化学发光信号用ChemiDoc? Touch Imaging System捕获。半定量密度分析使用ImageJ软件进行。原始像素密度背景减去，归一化至内部阳性对照斑点，并表示为相对于未刺激未处理对照细胞的倍数变化。HUVECs（6 × 10^4细胞/孔）在预涂1.5%明胶的无菌盖玻片上培养24小时。Caco-2细胞（6 × 10^5细胞/mL）接种于0.4 μm孔径聚碳酸酯Transwell膜插入物上培养21天，生长培养基每2天更换。ADEVs（100 μg/mL）和载体对照（等体积PBS）用红色荧光染料PKH26染色。通过添加1 μL PKH26乙醇储备液至1 mL Diluent C制备2×染料工作液。ADEVs（或PBS）与2×染料工作液1:1混合，室温孵育10分钟。未结合染料通过0.22 μm过滤PBS洗涤并将混合物通过100 kDa离心过滤单元在4°C、4,000 × g离心4分钟去除；该洗涤循环重复两次。标记的ADEVs（PKH26-ADEVs）或载体对照（PKH26-PBS）重悬于补充外泌体耗竭FBS的完全培养基中并与细胞过夜孵育。孵育后，细胞用PBS洗涤两次并用4%多聚甲醛（paraformaldehyde, PFA）固定20分钟。细胞核用NucBlue? Fixed Cell ReadyProbes? Reagent复染。盖玻片和Transwell膜使用ProLong? Glass Antifade Mountant安装到玻璃载玻片上。免疫荧光成像使用配备DS-Qi2相机的Nikon Eclipse Ti共聚焦显微镜进行。图像以×63油浸物镜在1,024 × 1,024像素分辨率获取。通过调整激光强度和检测器增益设置避免像素饱和。对于Caco-2，收集z-stack并使用ImageJ软件生成最大强度投影。单层完整性通过使用EVOM伏欧计测量跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）确定。在Transwell插入物上培养的极化Caco-2细胞在存在或不存在LPS的情况下用ADEVs处理。背景减去电阻值乘以插入物生长面积计算比TEER（Ω·cm2），并表示为未处理对照读数的百分比。Caco-2细胞（6 × 10^5细胞/mL）接种于0.4 μm孔径聚碳酸酯Transwell膜插入物上培养21天（培养基每2天更换）。处理后，通过针对闭合小带蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）的免疫荧光染色评估紧密连接结构。细胞在室温用4% PFA固定20分钟，用PBS洗涤三次，并在室温用0.1% Triton X-100 in PBS透化5分钟。非特异性结合位点通过在室温孵育细胞于封闭缓冲液（2% BSA in PBS）1小时阻断。细胞与小鼠单克隆抗ZO-1抗体在4°C过夜孵育，随后用山羊抗小鼠IgG H + L Alexa Fluor? 488偶联二抗在室温标记1小时。细胞核用NucBlue? Fixed Cell ReadyProbes? Reagent复染。Transwell膜使用手术刀从塑料插入物上小心切下并用ProLong? Glass Antifade Mountant安装到玻璃载玻片上。图像以×40物镜在1,024 × 1,024像素分辨率获取。优化激光功率和检测器增益以防止像素饱和。收集z-stack并使用ImageJ软件生成最大强度投影。无菌盖玻片放入24孔板并用1.5%明胶在37°C涂层30–45分钟。HUVECs以15 × 10^4细胞/孔密度接种于明胶涂层盖玻片上培养24小时。HUVECs随后接受四种不同条件：（I）用ADEVs（100 μg/mL）过夜处理；（II）用LPS（1 μg/mL）处理4小时；（III）用ADEVs过夜预孵育随后用LPS挑战4小时；（IV）未处理HUVECs（基线对照）。THP-1细胞根据制造商说明用绿色亲脂膜染料PKH67荧光标记。PKH67标记的THP-1细胞（4 × 10^5细胞/孔）加入HUVEC单层并在细胞培养箱中维持1小时。未黏附细胞通过PBS洗涤去除，剩余黏附细胞用4% PFA在室温固定20分钟。两次PBS洗涤后，盖玻片用ProLong? Glass Antifade Mountant安装到载玻片上。对于每种条件，同一显微镜视野在荧光下获取以量化绿色标记THP-1细胞，在明场下获取以可视化底层HUVEC单层。每双重复孔随机拍摄四个视野，黏附THP-1细胞数使用ImageJ软件量化。雌性小鼠（6–8周龄）在无特定病原体条件下饲养于温度控制环境，12小时光/暗循环，自由获取食物和水。所有涉及动物及其护理的实验程序按照机构指南进行，动物伦理委员会批准所有实验方案。动物组大小通过G*Power软件先验确定。应用独立均值双尾t检验，显著性水平（α）设为0.05，统计功效（1-β）设为0.85，预期生物效应量（d）为2.17。基于这些参数，确定每组n = 5只小鼠的样本量以确保稳健统计评估同时根据3Rs原则最小化动物使用。小鼠由动物设施工作人员随机分配到实验组。为防止实验偏倚，口服灌胃给药由对特定处理条件不知情的设施操作员执行。处理组通过口服灌胃接受ADEVs（每只小鼠100 μL），含100 μg总蛋白，相当于每只小鼠1 × 10^8颗粒。对照小鼠通过口服灌胃接受等体积载体（PBS）。48小时后，所有指定小鼠通过腹腔注射LPS（1 mg/kg）诱导炎症。LPS注射后2小时，小鼠通过颈椎脱臼安乐死。小鼠器官手术切除并立即放入含TRI Reagent的无RNase管中。组织使用Potter-Elvehjem匀浆器机械匀浆。通过每1 mL TRI Reagent加入200 μL氯仿进行相分离，随后在4°C、12,000 × g离心15分钟。小心收集上层水相，RNA用250 μL异丙醇沉淀。室温孵育10分钟后，样品在4°C、12,000 × g离心10分钟。所得RNA沉淀用500 μL 75%乙醇洗涤两次并在4°C、12,000 × g离心5分钟。风干RNA沉淀重悬于30 μL无核酸酶水中。RNA浓度和纯度使用NanoDrop? ND-1000分光光度计评估。基因组DNA消除和逆转录使用RT2 First Strand Kit按照制造商方案进行。定量实时PCR使用RT2 Profiler PCR Array for Mouse Inflammatory Cytokines & Receptors结合RT2 SYBR Green ROX FAST Mastermix在Rotor-Gene Q热循环仪上进行。热循环曲线包括95°C初始变性10分钟，随后40个循环95°C 5秒和60°C 30秒。所有反应三重复进行。阈值循环值使用阵列内整合的管家基因归一化。相对基因表达水平使用2?ΔΔCT方法计算，并表示为相对于对照组（PBS + LPS）的倍数调节。ADEVs的体内和离体生物分布谱使用近红外（near-infrared, NIR）荧光成像评估。ADEVs根据制造商方案用亲脂染料1,1′-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DiR）标记。简言之，ADEV悬液与2 μM DiR染料在37°C黑暗中孵育20分钟。为去除未结合游离染料，标记的ADEVs（DiR-ADEVs）通过100,000 × g超速离心1小时纯化并重悬于无菌PBS。由单独PBS组成的载体对照接受相同标记和超速离心程序以控制残留游离染料。体内NIR荧光成像在基线（0分钟）和给药后30、60和180分钟进行。成像前，动物用3.0%异氟烷在腔室中麻醉，然后转移到NEWTON 7.0体内成像系统。在终端时间点（180分钟），小鼠被安乐死，主要内部器官（肝、肾、脾和心脏）手术采集用于离体NIR成像。荧光发射信号使用Newton 7.0 Image Software获取为总光子/秒（p/s）。为量化DiR荧光强度随时间的变化，对所有动物在腹部区域定义相同感兴趣区域（regions of interest, ROIs）。放置在载体处理对照小鼠上的等效ROIs作为背景参考标准。所有定量实验至少三个独立生物重复进行，除非另有说明。数据表示为平均值±标准差（standard deviation, SD）。统计评估使用RStudio软件或GraphPad Prism执行。对于多实验组比较（MTS测定、细胞因子分泌阵列谱、TEER测量和THP-1单核细胞黏附计数），数据使用单因素方差分析（analysis of variance, ANOVA）随后Bonferroni事后检验进行成对比较评估。ADEV稳定性数据在每个储存温度条件内单独使用单因素ANOVA分析，随后在检测到显著总体效应时使用Tukey多重比较检验评估储存时间点间的成对差异。两组间直接比较（如体内生物分布参数）使用非配对双尾Student t检验进行。对于RT-qPCR和靶向PCR阵列分析，相对基因表达使用2?ΔΔCT方法计算。成对统计比较由Qiagen GeneGlobe Data Analysis Center使用参数非配对双尾Student t检验假设等方差应用于重复2?ΔCT值进行。对于PCR阵列分析，原始p值使用Benjamini–Hochberg程序对每个组织特异性和实验比较分别进行多重假设检验调整。在所有分析中，p < 0.05被认为统计显著（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。在应用多重比较程序的情况下，报告的p值代表调整后p值。ADEVs的分离和纯化通过多步骤工作流程进行，包括果汁提取、酶消化、倾析、粗澄清、切向流过滤（TFF）、微滤、超滤和最终无菌过滤。NTA分析显示单分散囊泡群体，平均流体动力学直径为123 ± 69 nm，无超过200 nm的颗粒。这些指标由SEM观察证实，显示ADEVs为小于200 nm的球形结构，表面形态光滑，无聚集或成簇。ADEVs的物理稳定性在四种储存条件（?20°C、+4°C、+25°C和+36°C）下在预定时间点（1、2、3、4、6和11周，以及3和6个月）使用NTA系统研究6个月，评估颗粒浓度和流体动力学直径的变化。储存在?20°C的囊泡在整个6个月期间表现出优越的物理稳定性，颗粒浓度（平均（1.50 ± 0.33）×10^11颗粒/mL）和流体动力学直径（平均146.1 ± 13.7 nm）变化极小，仅有归因于固有生物样品变异性的轻微波动。相反，储存在+4°C的ADEVs维持稳定颗粒浓度长达4周（（1.39 ± 0.21）×10^11颗粒/mL），随后逐渐下降至6个月时的（3.35 ± 0.52）×10^9。此外，在4°C组从第11周开始观察到平均粒径的显著变化，平均直径保持稳定至第11周（147.2 ± 10.0 nm），随后在6个月时增加至241.4 ± 20.7 nm。在+25°C，颗粒浓度在第一周后显著下降至（8.93 ± 0.97）×10^10颗粒/mL。同时，从第二周开始观察到平均粒径的显著改变，平均流体动力学直径从164.4 ± 17.4 nm增加至储存期内的201.7 ± 43.5 nm。最后，储存在+36°C导致仅1周后颗粒浓度快速降低至（5.50 ± 1.20）×10^10颗粒/mL，伴随平均粒径同时增加至194.6 ± 14.0 nm。在1个月监测期内，所有储存条件下腔内在第1周后观察到酶活性普遍下降，到第4周显著降低。在高温（+25°和+36°C）储存诱导活性快速时间性丧失，1周内降低超过50%，表明由酶变性、膜降解或两者兼有所致的显著热不稳定性。储存在+4°C同样导致第一周内酶活性约50%降低；值得注意的是，维持在+25°C的囊泡在第4周表现出略高于+4°C的残留活性。相反，储存在?20°C在测试条件中提供最佳酶活性保存，尽管随时间仍可见逐渐下降。总蛋白浓度在所有储存条件下初始数周保持相对稳定，仅在4周时间点观察到适度增加。为评估ADEVs的固有生物相容性，人Caco-2肠上皮细胞在基础非炎症条件下与递增浓度囊泡（2.5–1,000 μg/mL）孵育24和48小时。在两个时间点整个测试浓度范围内，ADEV处理对细胞活力无显著影响（p > 0.05 vs. 未处理对照）。共聚焦显微镜证实这些发现，显示保留的细胞形态，特征为完整细胞核、均匀核染色和无凋亡或坏死特征。与红色标记ADEVs孵育24小时导致强烈细胞内荧光，确认Caco-2细胞对囊泡的有效摄取。为控制染料伪影如胶束或聚集体，同时评估仅试剂对照（PBS与染料混合并经过相同染色、洗涤和旋转柱纯化步骤）。这些对照确认观察到的细胞内信号来源于内化ADEVs而非残留游离染料。重要的是，ADEV内化未引起可检测的急性细胞应激或细胞毒性迹象。为评估ADEVs在炎症条件下的免疫调节作用，在多孔膜插入物上培养的完全极化Caco-2单层用10 μg/mL LPS挑战24小时，有或无先前24小时ADEVs孵育。使用蛋白质抗体阵列分析未处理对照、ADEV处理、LPS挑战和联合ADEV处理与LPS挑战处理组的炎症介质和趋化因子释放谱。单独LPS刺激诱导多种炎症介质和趋化因子的强劲上调，包括CXCL5、CXCL1、ANG、CXCL7、CCL4、IL10、IGFBP2和CCL26，相对于基线倍数增加约2.0至8.0倍。相反，一部分蛋白质保持低水平或显著抑制，包括BLC、NT4和FGF4，以及细胞因子如IL1α、IL4、IL12、TNFα和SCF。在基础条件下单独ADEV处理引起极小细胞因子或趋化因子产生，仅观察到IL2和IL1β适度增加。在联合组（ADEV处理随后LPS挑战），ADEVs选择性调节炎症谱：单独LPS强烈诱导的几种蛋白质在ADEV存在下表达降低（IL10、CCL26、CXCL1、IGF1、IGFBP2和IL8），而一部分保持升高或进一步增强（CXCL7、CCL4、ANG、LIGHT、TNFα、CX3CL1和GDNF）。为评估ADEVs对上皮屏障完整性的功能和分子影响，研究人员通过通路特异性人紧密连接PCR阵列分析基因表达，通过跨上皮电阻（TEER）评估电生理屏障强度，并通过ZO-1共聚焦免疫荧光可视化紧密连接结构。单独ADEV处理上调控制跨膜密封（CLDN18、CLDN8）、细胞质支架（TJP3）、顶端-基底极性（PARD6A）和细胞骨架结构（ACTN3、EPB41）的关键转录本。相反，单独LPS暴露下调广泛的结构和调节基因谱，包括claudins（CLDN3、CLDN8、CLDN14、CLDN18）、细胞极性复合物组分（PARD6A、PATJ）和细胞骨架连接物（CTNNA3）。有趣的是，黏附连接相关CTNNA2在单独LPS刺激和ADEV + LPS处理下均显著上调。除这一共享响应外，ADEV预处理通过显著上调紧密连接密封蛋白（CLDN10、CLDN17、CLDN18）和连接黏附分子A（F11R/JAM-A）选择性抵消LPS诱导的屏障降解。此外，ADEV预处理恢复多个功能网络的表达，诱导屏障结构（CLDN7、CLDN15、OCLN）、细胞极性调节（LLGL2、PARD6B、PRKCZ）、细胞骨架组织（AMOTL1、CTTN、ILK、SPTA1）和染色质修饰（ASH1L）的上升趋势。在功能水平，LPS暴露诱导TEER值显著下降，反映高通透性。ADEV预处理显著减弱这一下降，维持TEER值接近对照水平。免疫荧光染色证实这些发现。未处理Caco-2细胞沿细胞-细胞边界显示连续、明确的ZO-1定位，呈蜂窝状模式，而ADEV处理细胞显示增强的连接连续性和强度。LPS处理导致ZO-1组织明显破坏，特征为不连续染色和弥漫性细胞质定位。LPS挑战前ADEV预处理恢复ZO-1分布至与对照组相当的连续模式。为建立ADEVs在血管内皮的固有生物相容性，HUVECs在基础非炎症条件下暴露于ADEVs。与PKH26标记ADEVs孵育24小时的内皮细胞共聚焦显微镜显示清晰细胞内荧光，表明囊泡有效内化。同时评估仅试剂对照，确认观察到的细胞内信号来源于内化ADEVs而非残留游离染料。整体细胞结构保留，特征为正常核形态、均匀核染色和无凋亡浓缩或坏死损伤。与这些视觉发现一致，细胞活力测定显示24小时暴露于测试ADEV浓度范围（2.5、10、50、100、500或1,000 μg/mL）后无显著改变。在48小时，观察到适度剂量依赖性活力降低，仅在最高测试浓度（1,000 μg/mL；p < 0.05）达到统计显著性。为模拟急性血管炎症，HUVECs暴露于1 μg/mL LPS 6小时，引起促炎激活，标志为细胞因子/趋化因子介质CCL2、IL6和IL8表达增加。用ADEVs预处理内皮细胞16小时显著且剂量依赖性减弱LPS诱导的CCL2、IL6和IL8表达。接下来，研究人员检查ADEVs对细胞黏附分子表达和单核细胞募集的影响。LPS挑战显著上调细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）的表达。用ADEVs预处理显著剂量依赖性降低LPS诱导的ICAM-1和VCAM-1表达。为确认这一降低的功能影响，使用PKH67标记的THP-1单核细胞进行黏附试验。LPS暴露显著刺激THP-1黏附至汇合HUVEC单层（p < 0.05 vs. 未处理对照）。相反，ADEV共处理显著减弱单核细胞结合（p < 0.05 vs. 单独LPS），当细胞在LPS挑战前用ADEVs预处理时同样维持该效果（p < 0.05 vs. 单独LPS）。为评估ADEVs在原代循环免疫细胞中的固有生物相容性，人单核细胞在基础非炎症条件下用递增ADEV浓度处理。通过MTS测定在24和48小时评估细胞代谢活性显示剂量依赖性代谢活性增加，在较高浓度达到统计显著性（p < 0.05）。显微镜分析证实保留的细胞结构和典型非黏附单核细胞形态，无细胞死亡或向巨噬细胞样表型过早分化证据。为模拟全身炎症，单核细胞用1 μg/mL LPS挑战6小时，触发强劲促炎激活，标志为IL6、IL8、IL1B和TNFA表达增加。用ADEVs预处理单核细胞16小时显著且剂量依赖性减弱LPS诱导的IL6、IL8、IL1B和TNFA表达。为研究ADEVs在巨噬细胞介导炎症中的作用，THP-1单核细胞使用PMA分化为巨噬细胞样细胞。PMA处理的THP-1细胞显示增强黏附、增加细胞大小和细胞骨架重排，与巨噬细胞成熟一致。在基线转录水平，PMA刺激的THP-1细胞表现出TNFA、IL1B、IL6和IL8的适度表达，但需要二次LPS挑战才能强劲细胞因子诱导和释放。在LPS暴露前用ADEVs预处理PMA分化巨噬细胞16小时导致LPS诱导的IL6和IL8表达显著剂量依赖性减弱，伴随IL1B和TNFA水平适度降低。此外，暴露于较高ADEV浓度（100和1,000 μg/mL）诱导巨噬细胞可见形态改变。ADEVs的安全性谱通过口服灌胃给药后小鼠模型的纵向监测建立。为阐明ADEVs的时空分布，口服给药后进行NIR荧光成像。全身体内成像揭示与胃肠道转运和全身吸收一致的动力学谱，显示给药后1小时腹部荧光峰值，随后3小时逐渐下降。离体ROI分析确认肝脏显著荧光信号（p < 0.05），同时在几个肠外器官检测到信号。在心脏、脾或肾中未检测到显著信号（p > 0.05）。为评估ADEVs对LPS诱导炎症的保护能力，在小鼠肠道和心脏组织中进行通路特异性PCR阵列筛选以分析关键炎症介质及其受体。在肠道组织，用ADEVs预处理的小鼠与LPS挑战对照组相比显示基因表达谱的名义差异；然而，在校正多重检验后，分析的基因均未达到统计显著性（q > 0.05）。由于这些数据提示潜在趋势，ADEV给药在数值上与较高相对表达水平的Bmp2、2型相关趋化因子（Ccl11、Ccl24）、Ccl12、Il5、Ccr10和TNF超家族成员（Lta、Ltb、Tnf）相关。相反，ADEV处理的肠道组织显示促炎趋化因子（Ccl5、Ccl6、Ccl7、Ccl8、Ccl9）、造血生长因子（Csf2、Csf3）和引诱剂（Cxcl1、Cxcl10、Cxcl13）较低表达趋势，同时Ccl22、Ccr4、Spp1、Il27、Il2rb和Il33潜在降低。心脏组织平行筛选同样揭示ADEV处理心脏与LPS挑战对照相比炎症相关基因的非显著异质性数值变化（所有基因q > 0.05）。虽无统计显著性，ADEV处理心脏 exhibit 趋化介质和受体（Ccl5、Ccl6、Ccr1、Ccr2、Cxcr2）和细胞因子（Il15、Il17a、Il5、Il7）较低平均表达水平。相反，观察到Ccl19、Il1a、Ifng、Il17f和Ccr10数值增加。使用切向流过滤（TFF）的多步分离纯化方案成功产生高纯度苹果来源细胞外囊泡（ADEVs），具有明确的物理特征。NTA显示单分散颗粒群体平均流体动力学直径123 ± 69 nm，SEM显示均匀非聚集球形形态小于200 nm，与植物来源纳米囊泡的既定物理基准密切一致。这一物理谱进一步得到研究人员先前工作中建立的分子和蛋白质组身份支持。定量蛋白质组分析鉴定187种苹果蛋白质，由32%完全注释蛋白质、30%结构域鉴定蛋白质和37.5%未表征蛋白质组成。经典EV标记蛋白包括Tetraspanin-3-like（TET-3-like）和Exo70的存在确认真实植物EV谱，富含多囊体（multivesicular body, MVB）来源外泌体和外囊泡阳性细胞器（exocyst-positive organelles, EXPOs）。基因本体（Gene Ontology, GO）映射进一步强化这一囊泡谱。关于细胞定位，货物几乎 exclusively 限制于细胞周边、膜和细胞外空间，确认有效排除细胞内碎片或游离核糖核蛋白污染物。生物过程聚类揭示三个主要功能网络：植物激素（脱落酸/ABA）应激信号传导、通过过氧化氢分解的活性氧（ROS）解毒和细胞输出。总之，这些数据建立高度一致、清洁和特化的植物EV群体。长期保存试验证明ADEV物理稳定性严格温度依赖性。高温（+36°C和+25°C）触发快速囊泡降解和颗粒丢失，而+4°C冷藏仅短期（长达4周）保存物理参数。在测试条件中，?20°C储存成为最合适保存条件，有效保存颗粒浓度和流体动力学大小分布超过6个月。然而，使用囊泡内酯酶试验的功能评估揭示所有条件下1周后腔内酶活性逐渐下降，到第4周显著降低。这种内部活性丧失，伴随延长储存后可测量游离蛋白轻微增加，指向即使总颗粒计数和平均流体动力学直径保持宏观稳定时可能发生的细微亚微米膜通透性改变或蛋白泄漏。因此，虽然?20°C提供物理参数和酶保留相对于温暖条件的最高相对稳定性，这些发现强调腔内功能活性比结构完整性衰减更快。这一区别强调在定义保质期时监测物理指标和功能酶试验的重要性，并指出超低温储存或专用冷冻保护剂作为未来优化的重要途径。Caco-2肠上皮细胞中观察到的优异细胞耐受性强调ADEVs与肠道上皮细胞的高固有生物相容性。即使在高达1,000 μg/mL的升高浓度和延长暴露时间（48小时），ADEVs未引起可检测的细胞毒性效应。此外，观察到的快速有效细胞摄取而不改变基线细胞形态支持ADEVs作为安全、无毒纳米载体用于口服递送应用的潜力。LPS挑战是肠上皮细胞中广泛建立的模型，在短期暴露期间诱导强劲炎症和应激响应而不引起明显细胞毒性。机制上，LPS激活Toll样受体4（TLR4），触发下游NF-κB和MAPK信号通路，促进促炎介质的表达和分泌，同时破坏紧密连接蛋白并增加肠道通透性。在本研究中，LPS作为主导促炎刺激，优先激活趋化因子驱动通路（CXCL1、CXCL5、CXCL7、CCL4、GRO），特征为先天免疫激活和白细胞募集。单独ADEV处理后无广泛炎症激活表明ADEVs在基础条件下基本非炎症性，发挥选择性基线效应而非驱动非特异性先天免疫激活。重要的是，联合ADEV和LPS处理发现表明ADEVs重编程LPS诱导的炎症响应而非全局抑制它。机制上，ADEVs不广泛抑制LPS信号传导而是改变下游输出。IL10和中性粒细胞/嗜酸性粒细胞相关趋化因子（如CXCL1、CCL26）的减弱指向特定调节或募集通路的抑制。相反，CXCL7、CCL4和TNFα的持续或增强表达表明免疫细胞运输所需信号程序的选择性保留。这表明ADEVs可能作为免疫调节缓冲剂，保护受体组织免受过度LPS诱导的白细胞募集，同时维持必要的基线免疫监视。在屏障水平，ADEV处理在基础条件下启动紧密连接复合物的协调加固。跨膜claudins和occludin表达增加加强细胞旁密封，支架蛋白增强锚定至肌动蛋白细胞骨架，结构连接物驱动必要细胞骨架重塑。相反，单独LPS诱导的广泛基因抑制反映紧密连接完整性、细胞旁密封、细胞极性（PATJ）和细胞骨架连接（CTNNA3）的崩溃，特征为炎症屏障功能障碍。值得注意的是，虽然炎症LPS应激单独诱导黏附连接锚定物CTNNA2的代偿性上调，ADEV预处理独特地抵消更广泛的LPS诱导屏障崩溃。具体而言，ADEV预处理选择性恢复细胞旁密封（CLDN10、CLDN17、CLDN18）和连接黏附（F11R），同时加固顶端-基底极性（LLGL2、PARD6B、PRKCZ）和细胞骨架网络稳定性（AMOTL1、CTTN、ILK、SPTA1）。这些分子变化直接转化为保留的电生理电阻（TEER）和重建的ZO-1连接结构。总之，这些发现证明ADEVs在稳定紧密连接结构、减轻LPS诱导屏障破坏和维持炎症条件下黏膜稳态中的保护作用。HUVECs对ADEVs的有效内化而无急性细胞毒性支持其在血管区室中的高生物相容性。仅在延长暴露（48小时）于极高浓度（1,000 μg/mL）后观察到的细胞活力轻微降低指向阈值效应，表明ADEVs在生理条件下被内皮细胞良好耐受。内皮暴露于LPS模拟急性血管炎症，触发持续激活状态，促进白细胞募集、放大炎症级联并破坏血管稳态。CCL2、IL-6和IL-8等关键介质的持续升高促进免疫细胞浸润至血管壁，驱动慢性血管炎症和心血管疾病进展。ADEVs对这些促炎细胞因子和趋化因子的剂量依赖性减弱提示保护作用，有效抑制急性内皮激活并保留血管稳态控制。白细胞-内皮黏附代表血管炎症和动脉粥样硬化形成的关键限速早期步骤。通过下调免疫球蛋白超家族黏附分子ICAM-1和VCAM-1，ADEVs靶向白细胞滚动和牢固黏附所需的关键分子锚定物。功能黏附试验确认这一机制，证明ADEV介导的黏附分子抑制直接转化为减少单核细胞对接至发炎内皮单层。总之，这些发现揭示ADEVs在内皮中具有固有抗炎特性。通过减轻内皮激活、抑制细胞黏附分子表达和限制单核细胞募集，ADEVs干扰血管疾病发病机制核心的早期促炎机制。代谢活性的剂量依赖性增加而无形态改变或自发分化表明ADEVs在生理条件下被原代人单核细胞良好耐受，支持其与循环免疫细胞的固有相容性。在血管功能障碍背景下，LPS引发的细胞因子谱反映持续单核细胞激活状态，放大全身炎症级联并增强与血管内皮的交互。单核细胞衍生介质如IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的持续升高强化内皮功能障碍，促进白细胞黏附和跨内皮迁移，并驱动慢性血管炎症和心血管疾病进展。ADEVs对这些促炎细胞因子的剂量依赖性抑制表明免疫细胞激活的有效抑制。原代单核细胞细胞因子释放减少预期限制下游内皮激活、黏附分子表达和单核细胞募集。结合内皮细胞中观察到的抗炎效应，ADEVs似乎对血管炎症发挥协调调节效应，破坏循环免疫细胞与内皮之间的前馈炎症环路。PMA独立于受体接合激活经典和新型蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）同工型，触发下游MAPK和NF-κB通路、转录重编程、细胞骨架重塑和向基础非极化巨噬细胞表型转变。在本模型中，ADEVs有效抑制这些分化巨噬细胞中二次LPS诱导的炎症响应，抑制关键促炎输出（IL6、IL8、IL1B、TNFA）。较高ADEV浓度下观察到的结构改变进一步提示巨噬细胞群体的潜在功能重塑。通过在循环单核细胞和组织 resident/分化巨噬细胞中限制细胞因子分泌，ADEVs减轻内皮功能障碍的早期炎症驱动因素。总之，这些发现强调ADEVs在内皮细胞、原代单核细胞和巨噬细胞中的多靶点协调抗炎能力，强调其减轻驱动血管和全身炎症早期机制的潜力。口服给药后小鼠完全存活和正常行为确认ADEVs的体内安全性和耐受性。这些结果与研究人员体外发现一致，证明无急性细胞毒性，确认ADEVs在细胞培养和动物模型中的生物相容性。时空分布动力学证明ADEVs在生理条件下具有显著结构完整性。合成纳米载体通常需要专门封装以承受胃的酸性和蛋白水解环境；相反，ADEVs天然在胃转运中存活以进行肠道吸收。肝脏荧光选择性积累，伴随心脏、脾和肾中极小信号，与通过门静脉吸收随后由 resident 巨噬细胞或肝细胞首过肝脏隔离一致。此外，3小时荧光减少表明有效代谢清除而无生物蓄积，支持ADEVs用于重复营养治疗给药的可行性。虽然单个基因在校正多重检验后未达到统计显著性（q > 0.05），肠道组织中观察到的转录组模式提示ADEVs在内毒素挑战期间可能与局部微环境相互作用的潜在通路。参与中性粒细胞和单核细胞募集的趋化因子（Ccl5、Ccl7、Ccl8、Cxcl1）表达降低的数值趋势提示急性炎症细胞浸润的潜在抑制。同时，Bmp2和消退相关介质的表观增加可能指向支持组织恢复和基质重塑的机制，而Ccr10和TNF超家族成员的持续水平提示保留的基线黏膜免疫监视。此外，Ccl22、Ccr4、Spp1和Il33的数值下降提示通常驱动慢性免疫细胞滞留和组织损伤的信号环路的可能减弱。总之，这些初步转录组模式值得进一步探索作为从急性炎症向组织修复转变的潜在指标。在心脏中，ADEVs在全身LPS挑战期间引发细微但统计非显著（q > 0.05）的数值免疫调节模式。关键炎症受体和趋化因子（Ccr1、Ccr2、Cxcr2、Ccl5）较低平均表达水平提示急性内毒素血症期间负责白细胞募集至心脏组织的信号通路的潜在减弱。同时，稳态趋化因子如Ccl19的选择性数值保留或轻微升高表明ADEVs可能不引起全局免疫抑制，而是可能微妙影响白细胞运输。总体而言，虽然需要进一步验证，这些转录组趋势提示口服ADEVs在全身炎症攻击期间的潜在多器官免疫调节效应。几个世纪以来，苹果在传统医学中作为预防循环系统疾病的功能性食品发挥突出作用。虽然现代研究将这些心脏代谢益处归因于可溶性纤维和单体多酚，流行病学数据强调水果的物理基质至关重要：全苹果消费使高血压患者全因死亡率降低近一半，并显著降低总胆固醇和LDL胆固醇。然而，生果消费遭受明显药代动力学限制，包括广泛胃肠道降解、低全身生物利用度和高批次间变异性。通过大量水果摄入达到局部治疗浓度将需要不切实际、高糖密集消费。PDEVs克服这些障碍。受天然脂质双层保护，PDEVs保护脆弱生物活性货物免受胃降解，穿越肠道屏障，并促进靶向细胞摄取，递送标准化、有效剂量独立于饮食体积限制。为实现转化可扩展性，研究人员使用TFF建立可靠一致的ADEV制造框架。TFF允许从丰富农业来源高效分离和浓缩高产率、高纯度活性囊泡。通过顺序浓缩级联处理大量原料，数百万稳定囊泡被浓缩成单一可测量剂量，具有明确储存参数和高度可重复生物活性。机制上，研究人员的发现证明ADEVs在代表关键生理屏障的整合人类细胞模型三联体中发挥强劲抗炎效应。在肠上皮细胞中，ADEVs显著增强屏障功能并降低细胞旁通透性，防止腔促炎分子的全身易位。在内皮细胞和白细胞——动脉粥样硬化形成的主要驱动因素——中，ADEVs抑制LPS诱导的炎症级联，抑制单核细胞、巨噬细胞和血管内皮中的关键促炎介质。这些发现与PDEVs调节上皮屏障完整性和全身炎症的既定范式一致。例如，甜橙EVs通过上调紧密连接蛋白同时抑制促炎信号传导保留肠道屏障功能。类似地，蓝莓来源EVs抵抗模拟胃肠道转运以防止高通透性，石榴EVs递送生物活性亲脂货物以缓解肠道渗漏和全身器官损伤。除天然生物活性外，ADEVs作为生物相容、低免疫原性载体提供独特临床优势，能够封装外源性RNA或小分子治疗剂。重要的是，研究人员的体外观察得到体内生物分布和药代动力学评估的证实。口服ADEVs导致快速肝脏清除和全身细胞因子抑制而无心脏组织直接蓄积，确认其心血管保护通过间接全身和代谢调节介导。总之，这些结果建立ADEVs作为营养治疗平台的良好安全性谱。然而，本研究的几个局限性值得考虑。首先，作为预防性研究，研究人员的体外试验和6小时LPS挑战捕获早期细胞事件和急性内毒素毒性。它们未模拟慢性进展性病理。因此，研究人员未使用既定疾病模型，如高脂饮食喂养的ApoE?/?小鼠动脉粥样硬化模型或心肌梗死结扎模型。结果，研究缺乏功能性心血管评估，包括血压监测和超声心动图。此外，宏观病理结局如动脉粥样硬化斑块负荷、射血分数和心肌纤维化未测量。第二，虽然体内光学成像证明快速摄取而无急性组织损伤，监测限于给药后3小时窗口；建立完全无生物蓄积将需要24–48小时或更长的延长纵向追踪。此外，在肠外器官检测到EV相关荧光与胃肠道易位和给药EV制剂相关组分的随后全身分布一致。然而，单独荧光成像无法确定检测信号是否 exclusively 来源于结构完整EVs或部分来源于标记EV衍生膜组分。第三，所有动物实验 exclusively 在雌性小鼠中进行。鉴于心血管疾病进展和先天免疫响应的性别二态性，未来研究必须评估雄性和雌性小鼠以考虑效力和药代动力学的潜在性别特异性差异。最后，虽然研究人员的分离方案严格限制共分离污染物，未来使用结构解组装对照的深入机制研究需要 delineate 哪些特定囊泡内或囊泡外组分驱动这些保护效应。解决这些参数代表关键下一步。在动脉粥样硬化长期临床前模型中评估标准化ADEVs将 essential 确认调节这些急性上游细胞通路是否转化为对慢性心血管疾病的持续保护。
