体细胞突变的产生是癌症起始、进展、异质性和治疗抵抗的基础，然而突变能力通常主要通过DNA复制和基因组维持通路中的组成性缺陷来解释。新兴证据表明，新获得突变的概率、速率和谱系也可随细胞生理和环境背景而变化。本综述考察代谢和线粒体改变、致癌性复制压力、转录和染色质相关过程、炎症和酶促突变、肿瘤微环境压力以及治疗相关适应作为突变产生的潜在决定因素。研究人员将突变产生与DNA损伤、基因组不稳定性（genomic instability）、累积突变负荷、突变地形学和克隆选择区分开来，并根据将细胞或环境扰动与后续突变获得联系起来的证据强度评估这些机制。在经典突变器表型以及应激诱导、适应性和治疗相关突变既往概念的基础上，研究人员提出动态突变器状态（dynamic mutator states）的框架：即协调的细胞构型，其中突变能力通过机制上可识别的过程而与适当的参照状态不同，并伴随新突变的获得、速率或谱系的改变。此类状态可能在肿瘤起始、空间多样化、转移演化、治疗适应、残留疾病和复发过程中呈瞬时性、复发性、持续性或逐步稳定化。研究人员进一步定义了识别动态突变器状态的实验标准，强调前瞻性突变测量、时间顺序、谱系解析、扰动以及逆转或挽救。最后，研究人员考虑突变产生过程本身是否可作为治疗靶点，从而限制后续选择可利用的新遗传变异的供给。基于状态的突变观为连接细胞生理与突变获得以及确定突变供给何时成为癌症演化中动态且潜在可操作的组成部分提供了框架。
1 引言
体细胞突变为癌症起始、进展和克隆演化所依赖的可遗传变异提供了来源。大规模癌症基因组测序揭示了广泛的瘤间和瘤内异质性，并鉴定了与内源性和外源性突变过程相关的反复出现的突变特征。这些进展显著增进了对肿瘤演化基因组后果的理解。然而，在突变累积之后所鉴定的突变并不必然揭示其产生时的细胞条件。突变获得是一个持续进行的过程，新兴证据表明新突变的概率、速率或谱系可随细胞生理、复制、代谢、应激反应和环境暴露的变化而变化。
经典突变器表型为突变产生持续增加提供了最清晰的例子。错配修复和DNA聚合酶校对功能的缺陷可产生显著升高的序列水平突变率，并具有特征性突变模式。同源重组和其他基因组维持通路的缺陷可产生额外形式的基因组不稳定性（genomic instability）和突变累积。这些机制仍然是癌症遗传学的基础，但基因组维持的组成性缺陷并不涵盖能够改变突变活性的全部生物学条件。
癌细胞经历广泛的生理重编程，可改变核苷酸可用性、氧化还原平衡、复制动力学、DNA损伤形成和加工、底物暴露、修复效率以及突变酶的活性。微环境、炎症和治疗压力可进一步改变这些过程，同时对已有遗传多样性施加选择。因此，在解释肿瘤异质性、治疗抵抗和演化变化时，区分突变产生增加与已有变异的选择性扩增至关重要。
这些观察提出了突变能力在肿瘤演化过程中并非固定不变的可能性。在特定情境中，突变产生过程可能是可诱导的、状态依赖的或时间可变的。因此，一种细胞构型可能改变突变获得的概率、速率或谱系，而不需要在经典基因组维持机制中存在永久性缺陷。此类行为的证据强度在各机制之间差异显著，必须与单独的DNA损伤、基因组不稳定性或累积突变负荷的测量区分开来。
本综述考察在癌症中改变突变产生的分子和细胞过程，并评估突变能力可能随细胞状态而变化的条件。特别强调改变的细胞生理与新获得基因组变异之间的机制联系，以及此类变异如何促进基因组多样化和肿瘤演化。
1.1 综述方法与证据整合
证据根据定义明确的细胞或环境扰动能否与能够改变突变产生的过程以及后续基因组变化相联系来评估。
考虑四个互补的证据水平。因果突变证据包括证明新产生突变的获得、速率或谱系发生改变的扰动研究。机制功能证据确立对能够影响突变的过程的影响，即使尚未直接测量前瞻性突变累积。关联性人类证据将生物学特征或通路活性与患者来源样本中的突变模式联系起来。计算或突变特征推断鉴定生物过程与观察到的基因组模式之间合理的历时关系。
当可测量的细胞状态改变先于机制相关的突变获得变化，且时间、扰动或可逆性数据支持该关系时，状态依赖性突变的证据最强。这些证据水平贯穿本综述，用于区分直接因果支持与机制性、关联性和推断性观察。
2 超越经典突变器表型的突变产生
癌症中体细胞突变获得的机制通常使用重叠术语讨论，而这些术语描述不同的生物学现象。突变负荷、突变率、DNA损伤、基因组不稳定性和克隆演化相互关联，但均不能与突变产生本身互换。区分这些过程对于确定某一生物学条件是否实际增加新遗传变异的生产至关重要。
突变负荷反映在给定时间可检测于肿瘤或细胞群体内的体细胞改变的累积数量，而突变率描述在定义的时间间隔或细胞分裂次数中新突变获得的频率。因此，高突变负荷不一定表明突变活性正在持续升高。它可能反映延长的演化历史、早期强烈突变事件、组成性基因组维持缺陷或高突变克隆的选择性扩增。相反，突变产生的瞬时增加如果新产生的变异仍然罕见，最初可能产生相对较少的可检测改变。
DNA损伤同样必须与突变固定区分开来。氧化碱基、DNA加合物、链断裂、复制相关损伤和其他分子异常产生潜在突变底物，但它们并不必然成为可遗传的遗传改变。其基因组后果取决于损伤识别、修复效率、复制时序、DNA损伤耐受和下游加工的保真度。因此，突变形成更准确地表示为多步骤过程：损伤或复制错误→加工、耐受或修复失败→复制或分离→固定的遗传改变。
当氧化应激、DNA损伤标志物或复制相关损伤被用作突变的替代指标时，这一区分尤为重要。此类发现证明突变形成机会增加，但单独并不能确立固定突变获得的增加。潜在突变性DNA异常的替代结局，从忠实解析到突变固定，在图1中展示。
[图1：从细胞应激到突变固定。细胞或环境扰动可产生DNA损伤、复制错误或异常DNA中间体，构成潜在突变底物。忠实修复或解析可在无固定突变的情况下恢复DNA完整性，而不准确的加工随后经复制、损伤旁路或染色体分离可将这些异常转化为可遗传的遗传改变。该图强调单独的DNA损伤或复制压力并不等同于突变产生。]
DNA损伤、突变固定、突变累积和后续选择之间的区分源于解析该过程不同阶段的互补实验方法。体细胞突变率的测量确立突变获得可独立于群体中已存在的总突变数进行量化。损伤加工和DNA损伤耐受研究进一步证明，潜在突变性损伤可被准确修复、无突变旁路或转化为突变，取决于所参与的修复和复制通路。更近期的前瞻性突变累积实验和纵向基因组测序允许从定义的起始群体测量新获得的突变，从而将从头突变产生与已有基因组变异分开。与此同时，克隆、系统发育、单细胞和谱系解析方法表明，突变在肿瘤内的频率还反映突变产生后的差异存活和扩增。这些进展共同确立了实验上可分离的阶段：损伤或复制错误→突变固定→突变累积→选择性克隆扩增，而非单一的致瘤潜力连续测量。
基因组不稳定性（genomic instability）代表涵盖多种遗传改变形式的更广泛表型，包括升高的点突变率、微卫星不稳定性、结构重排、拷贝数改变、染色体错误分离和非整倍体。这些表现通过不同机制产生，且不必平行变化。染色体不稳定性可产生广泛的核型异质性而无单核苷酸突变率的成比例增加，而酶促或复制相关突变可产生显著的序列水平变异而无同等严重的染色体破坏。因此，基因组不稳定性应被视为伞形表型而非突变产生的同义词。
突变产生还必须与已有变异的选择分开。肿瘤包含异质性亚克隆群体，经历营养可用性、免疫监视、组织结构、转移环境和治疗所施加的选择压力。 resistant或高度增殖的克隆可在无同时突变产生增加的情况下扩增。相反，突变活性增加的事件可产生变异，这些变异在后续条件有利于其扩增之前保持罕见。突变产生决定新变异的供给，而选择决定哪些变异被演化性扩增。
2.1 经典突变器表型
经典突变器表型为突变率持续增加提供了最成熟的机制框架。基因组维持通路的组成性或持久性破坏增加复制错误或DNA损伤逃脱忠实校正并固定为可遗传改变的概率。
错配修复缺陷是典型例子，产生微卫星不稳定性以及碱基替换和插入-缺失累积的特征性模式。复制性DNA聚合酶校对活性缺陷同样可产生显著升高的突变率并具有独特突变谱。影响DNA修复、复制监视或损伤耐受的其他缺陷可产生额外形式的突变累积和基因组不稳定性。
这些例子确立了一个核心原则：基因组维持机制的持续损害可在 successive细胞世代中维持升高的突变活性。在许多此类情境中，表型锚定于相对稳定的遗传或功能缺陷，尽管其幅度和基因组后果仍可被细胞背景和次级改变所修饰。
癌细胞也可在没有获得经典基因组维持基因新组成性缺陷的情况下改变突变过程。生理重编程可修饰损伤形成、复制保真度、底物可用性、DNA加工或突变酶活性。这创造了突变能力可能随细胞状态而变化而非在肿瘤演化中保持均匀升高的可能性。
2.2 动态突变能力与动态突变器状态
动态突变能力指癌细胞因其生物学条件变化而产生新遗传改变的倾向性变化。因此，它是突变的属性而非特定分子通路。
动态突变器状态指突变能力可测量地改变的协调细胞构型。此类状态不由氧化应激、缺氧、APOBEC活性、复制压力或染色质重塑等孤立特征定义。这些特征可促进突变产生，但任一单独均不确立突变能力的状态水平变化。
定义性要求是一种整合的细胞构型，通过一个或多个机制上可识别的过程改变新获得突变的概率、速率或谱系。因此，基于状态的解释取决于细胞构型、突变机制和后续突变获得之间的关系，而非仅取决于通路激活。
动态突变器状态框架建立在经典突变器表型以及应激诱导或适应性突变、治疗诱导突变、瞬时突变性、持留细胞突变性和可诱导通路特异性突变的既往概念之上，但与之不同。这些早期概念已确立突变产生过程可响应特定应激、治疗或分子机制而变化。此处提出的框架将解释单元从个体突变机制转变为突变能力被改变的细胞状态。因此，动态突变器状态需要整合相对于适当参照状态的可测量细胞构型、突变产生过程中机制上可识别的改变、突变能力的时间变化以及后续突变获得的证据。它还明确将突变供给的变化与已存在变异的选择性扩增分开。因此，应激诱导突变、APOBEC激活、复制压力耐受、治疗相关突变性或其他可诱导机制可促进动态突变器状态，但任一单独均不等同于该状态本身。
2.3 确立动态突变器状态的生物学标准
动态突变器状态的证据可在三个互补生物学水平上组织。
2.3.1 水平I：细胞状态证据
必须可鉴定可测量且协调的生物学构型。相关变化可能涉及代谢、转录、表观遗传、炎症、复制相关或应激反应程序。这确立独特细胞状态的存在，但不证明突变改变。
2.3.2 水平II：机制突变证据
状态必须改变能够修饰突变产生的过程。相关机制可包括潜在突变性损伤形成增加、核苷酸池失衡、复制保真度受损、ssDNA暴露增加、DNA损伤加工改变、突变酶激活或对易错DNA损伤耐受通路的依赖性增加。这些观察确立机制合理性，但本身不证明固定突变获得的改变。
2.3.3 水平III：突变证据
最强的生物学证据是新产生突变的获得、速率、谱系或累积的可测量变化。理想情况下，候选细胞状态先于基因组改变，且对该状态的扰动修饰后续突变获得。
因此最具说服力的序列是：可测量细胞状态改变→机制相关的突变加工改变→新获得突变的前瞻性变化。
当突变活性随进入状态而出现、在受控扰动后变化或在状态逆转后下降时，时间证据加强此解释。单独可诱导性不足；动态突变需要状态改变与突变获得之间已证明的时间关系。
2.4 跨实验设计的证据强度
不同形式的证据支持关于突变产生的不同推断水平。改变候选过程并产生新获得突变相应变化的扰动研究为因果参与提供最强支持。
证明复制保真度、损伤加工、核苷酸稳态、突变酶活性或DNA损伤耐受改变的功能研究在未直接测量前瞻性突变获得时提供机制支持。此类证据确立生物学合理性，但本身不定义突变的幅度或时间行为。
人类肿瘤中通路活性与突变模式之间的关联确立生物学相关性并可鉴定候选机制。计算重建和突变特征分析可进一步揭示突变活性的历时模式，但这些方法相对于突变产生时的细胞状态和时机仍属推断性。
因此，动态突变能力最好通过细胞状态定义、机制联系、时间顺序和突变获得改变的直接证据之间的汇聚来评估。各证据水平的相对贡献应根据生物学问题和实验背景来解释。
相应地，第3-7节所考察的机制不应被解释为对突变产生改变具有同等证据支持。一些由直接测量新获得突变的前瞻性扰动研究支持，而另一些主要由对损伤形成、复制、DNA加工、底物暴露或基因组维持的机制效应支持，还有一些主要依赖回顾性关联或突变模式。因此，贯穿本综述，这些机制根据可用的最强证据水平评估，而非仅因其产生DNA损伤、基因组不稳定性或潜在突变通路激活就被归类为动态突变器状态。
本综述使用的术语和概念边界总结于表1。
[表1：癌症突变中的术语和概念边界。DNA损伤：DNA的化学或结构改变，包括修饰碱基、加合物、链断裂、异常DNA结构或其他可能需要加工或修复的损伤——产生潜在突变底物但不必然产生固定突变。突变：在复制、分离、修复或突变加工后固定的可遗传序列或结构基因组改变——代表固定遗传结果而非起始损伤本身。突变负荷：在指定时间细胞群体或肿瘤内可检测体细胞突变的累积数量或密度——反映累积基因组历史，不等同于当前突变产生速率。突变率：在定义的时间间隔或细胞分裂次数中新突变获得的频率——测量持续突变获得，应与累积突变负荷区分。基因组不稳定性：以获取遗传或染色体改变倾向增加为特征的广泛表型，包括序列突变、结构变异、拷贝数改变、染色体错误分离或非整倍体——伞形表型；个别不稳定性形式不必平行增加，不等同于突变产生。突变器表型：突变率的持续增加，经典与DNA复制、校对、修复或其他基因组维持过程的稳定缺陷相关——通常锚定于相对持久缺陷，尽管其幅度可保持背景依赖。动态突变能力：细胞因其生物学条件变化而产生新遗传改变的倾向性变化——突变的属性而非特定通路或细胞状态。动态突变器状态：突变能力与适当参照状态不同且伴随新获得突变可测量变化的协调细胞构型——不由孤立应激、通路或分子特征定义；需要细胞状态、突变机制和突变获得的整合。克隆选择：遗传变异根据其在特定生物环境中的适应度差异存活或扩增——改变已有变异的代表性而非必然增加新突变产生。]
癌症中突变条件可产生的主要细胞内在和背景依赖途径总结于图2。
[图2：促进癌症突变产生的分子途径。该图将第3-7节考虑的主要机制途径组织为从上游细胞或环境条件，经突变的近端决定因素和通路依赖的加工或固定，到新获得基因组变异的共同序列。代谢和线粒体改变、致癌性复制压力、转录和染色质变化、炎症和酶促突变以及微环境或治疗压力可汇聚于DNA损伤形成、复制保真度丧失、异常复制中间体、修复或损伤耐受改变、突变酶活性与底物暴露或区域基因组易感性。随后的损伤或中间体持续、不准确修复、易错旁路或重启、复制和分离可将这些异常转化为新获得的碱基替换、插入缺失、结构改变或突变率、谱系或空间分布的变化。所描绘的机制代表突变产生的潜在途径；单独机制活性不确立突变获得增加。]
3 突变产生的代谢和线粒体驱动因素
代谢和线粒体改变可修饰DNA合成、损伤、修复和维持的生化环境。核苷酸可用性和质量、氧化还原平衡、代谢物丰度、线粒体功能和辅因子供应的变化可影响损伤形成、复制保真度、基因组维持活性和异常DNA中间体的加工。因此，其与突变的相关性取决于这些生化变化是否改变复制错误或DNA损伤固定为遗传改变的概率。
这些关系连同其他主要机制途径总结于图2。
3.1 代谢重编程与突变瓶颈
代谢重编程可通过一组有限的机制相关瓶颈影响突变产生：核苷酸供应和平衡、氧化还原控制、反应性或抑制性代谢物的产生、辅因子可用性以及基因组维持通路的调控。葡萄糖、谷氨酰胺、一碳或脂质代谢的突变意义在于这些通路对DNA合成和修复施加的生化约束。
葡萄糖来源的碳同时促进核苷酸生产和氧化还原缓冲。通过磷酸戊糖途径的通量为核苷酸合成提供核糖前体，同时产生抗氧化防御所需的NADPH。因此，这种平衡的扰动可改变复制底物可用性和限制氧化损伤的能力。
谷氨酰胺代谢通过核苷酸生物合成、三羧酸循环回补和谷胱甘肽依赖性氧化还原控制与相同瓶颈交叉。谷氨酰胺利用的变化可同时修饰可用于基因组复制的底物和缓冲氧化应激的能力。在营养限制下，生物合成与氧化还原需求之间的竞争可进一步改变复制错误或DNA损伤产生的条件。
一碳代谢连接核苷酸合成、甲基供体可用性和氧化还原调节。叶酸和甲硫氨酸依赖性反应为一碳单位提供嘌呤和胸苷酸合成，同时支持S-腺苷甲硫氨酸产生和细胞氧化还原平衡。其破坏可促进核苷酸失衡、尿嘧啶掺入、DNA合成改变和代谢物依赖性基因组维持变化。
因此，这些通路汇聚于决定突变产生所在细胞内环境质量的共享生化瓶颈。
3.2 核苷酸池失衡与复制保真度
准确的基因组复制取决于聚合酶保真度以及核苷酸底物的浓度、平衡和化学完整性。快速增殖的癌细胞面临高核苷酸需求，代谢或致癌改变可产生核苷酸耗竭、脱氧核糖核苷酸池之间的失衡或化学损伤核苷酸物种的累积。
失衡的核苷酸池可增加聚合酶错误掺入并改变复制错误逃脱校对或复制后校正的概率。核苷酸不足还可减慢DNA合成并增加对复制应激反应的依赖。此阶段的代谢贡献是创造不利于准确基因组复制的底物环境；停滞或异常复制中间体的后续命运取决于复制加工通路。
核苷酸池的化学质量同样重要。氧化还原应激下产生的氧化核苷酸可被掺入DNA，除非被核苷酸 sanitizing酶移除。因此，当底物质量变化改变突变频率或谱系时，核苷酸合成、平衡或sanitization的改变提供了从代谢状态到突变产生的直接途径。
3.3 肿瘤代谢物与基因组维持调控
癌症相关代谢改变可产生或累积修饰基因组调控和基因组维持酶的代谢物。影响异柠檬酸脱氢酶、延胡索酸水合酶和琥珀酸脱氢酶的突变可改变干扰α-酮戊二酸依赖性双加氧酶和其他代谢物敏感性酶的代谢物浓度。
其与突变的相关性超越表观遗传重塑。代谢物依赖性抑制或调节DNA修复和损伤反应通路可延长DNA异常的持续并改变其经历突变加工的概率。
肿瘤代谢物可同时影响多个基因组维持过程，包括修复活性、氧化还原调节、核苷酸代谢和染色质依赖性可及性。因此，其突变效应可能源于多种生化异常的汇聚而非单一下游通路。
3.4 线粒体功能障碍与核基因组应激
线粒体通过生物能量学、代谢物产生、氧化还原控制、铁处理和应激信号影响核基因组维持。电子传递、线粒体DNA、三羧酸循环活性或线粒体质量控制的变化可因此重塑核基因组复制和修复的细胞内条件。
线粒体功能障碍可修饰NAD+/NADH平衡、NADPH可用性、谷胱甘肽代谢、代谢物通量和铁依赖性化学，对抗氧化能力和DNA修复能力产生影响。这些效应超越线粒体活性氧，可通过生化和信号途径影响基因组维持。
线粒体应激还可通过逆行途径向核发出信号，重编程转录、代谢、炎症信号和细胞应激反应。此类通讯可改变DNA修复酶、抗氧化系统、复制相关因子和与突变易感性相关的代谢通路的丰度或活性。
因此，线粒体功能障碍的基因组后果取决于伴随的适应构型。代偿性抗氧化或代谢反应可缓冲某些扰动，而其他扰动维持增加损伤持续或降低基因组维持能力的生化条件。
3.5 氧化还原失衡、氧化损伤与突变固定
氧化还原失衡提供代谢和线粒体状态影响突变产生的直接化学途径。活性氧可修饰DNA碱基、糖和游离核苷酸前体，产生具有不同突变潜力的分子损伤。
鸟嘌呤氧化为8-氧代-7,8-二氢鸟嘌呤提供了充分表征的例子。跨未修复8-氧代鸟嘌呤的复制可产生特征性碱基替换，而游离核苷酸池的氧化可产生突变底物，除非被核苷酸sanitizing酶移除，否则在DNA合成期间被掺入。
氧化损伤向突变的转化取决于损伤形成后的事件序列。活性物种丰度和定位决定哪些底物受损；抗氧化防御、碱基切除修复和核苷酸sanitization影响损伤持续；复制决定受损模板或核苷酸底物是否产生改变的碱基配对和最终固定。
直接因果支持来自氧化还原条件操纵改变新获得突变频率或谱系且相关修复或核苷酸sanitization途径改变修饰该效应的研究。
3.6 代谢-表观遗传耦合与突变潜力
代谢和染色质调控密切关联，因为许多染色质修饰酶依赖其丰度在癌症进展期间变化的代谢物或辅因子。乙酰辅酶A、S-腺苷甲硫氨酸、α-酮戊二酸、NAD+及相关代谢物可影响组蛋白乙酰化、DNA和组蛋白甲基化以及染色质调控活性。
染色质的代谢控制可通过修饰DNA损伤加工的基因组背景影响突变。染色质可及性的变化可改变修复机制的招募、损伤持续和基因组维持或突变通路的表达。这提供了代谢状态可在不需要对DNA直接化学损伤的情况下修饰突变易感性的途径。
governing染色质可及性、转录应激、复制时序和区域突变分布的详细机制仍与调控它们的上游代谢条件不同。
3.7 代谢状态与突变产生联系的证据
代谢状态依赖性突变的证据在各机制之间不同。在定义的情境中可获得直接扰动证据，包括核苷酸池和氧化还原改变，而其他代谢关联主要由对基因组维持过程的影响支持。因此，这些机制应根据第2.4节定义的证据层级来解释。
4 致癌信号与复制相关突变
致癌信号可通过加速细胞周期进程、增加复制需求、改变起点活性和削弱DNA合成与基因组维持能力之间的协调来重塑DNA复制条件。突变后果不仅取决于复制压力的存在，还取决于产生的异常复制中间体以及其稳定、旁路、重启或修复的通路。
此机制组织将主要增加增殖压力的致癌状态与可测量地改变新获得遗传变异频率或谱系的状态区分开来。
4.1 致癌信号与过度复制需求
生长促进通路的异常激活可在经典DNA修复机制的明显缺陷出现之前施加持续的复制需求。RAS-MAPK、MYC、PI3K-AKT、细胞周期蛋白依赖性激酶及相关增殖程序可加速S期进入、改变起点活性、削弱检查点协调并促进在非忠实基因组复制最优条件下的DNA合成。
RAS通路激活可维持细胞周期进程并修饰起点活性和复制应激反应。MYC可增加S期进入以及转录和生物合成需求，对复制机制施加额外压力。PI3K-AKT信号和细胞周期蛋白/CDK失调同样可使细胞周期进程与准确DNA合成所需分子资源的可用性脱钩。
这些通路的突变相关性在于其产生的复制异常。当增殖需求增加产生异常复制中间体且其后续加工引入固定序列或结构改变时，便具有基因组后果。
4.2 S期进入、复制起点使用与复制资源需求
忠实基因组复制需要S期进入、起点许可和触发、复制叉进程、检查点信号和复制底物可用性之间的协调。致癌信号可通过在复制资源完全准备之前驱动DNA合成来破坏这种协调。
过早或过度的起点触发可重新分配有限复制因子并增加活跃复制叉之间的竞争。核苷酸可用性不足可进一步减慢聚合酶进程并 destabilize正在进行的合成，但核苷酸失衡的代谢起源与此处考虑的复制后果不同。在复制机制内，关键结果是形成需要稳定、旁路或重启的停滞、减慢或不完全进程的复制叉。
改变的起点使用还可增加内在难以复制区域的复制压力，包括重复序列、二级结构和具有受限复制动力学的位点。因此，全球复制需求和局部序列背景共同决定异常复制中间体出现的位置。
4.3 复制叉应激与复制叉去稳定化
当DNA合成被阻碍复制叉进程的障碍减慢、中断或变得不完全时，发生复制叉应激。这些障碍可包括有限复制底物、DNA损伤、致癌基因驱动的起点失调、过度复制需求和结构困难的基因组区域。
停滞的复制叉可通过检查点信号、复制叉保护、损伤旁路、受控重塑和重启来稳定。当这些反应保存新生DNA并恢复准确合成时，复制可在无永久基因组改变的情况下恢复。当复制叉经历 prolonged停滞、病理性重塑、核酸酶降解、崩溃或不准确重启时，突变结局更可能发生。
复制叉崩溃可产生需要专门加工的单端DNA断裂和相关中间体。不完全复制还可持续到有丝分裂，促进染色体断裂、重排或异常分离。因此，基因组后果由复制中间体的身份和命运而非仅由复制叉减慢决定。
复制扰动还可通过解旋酶-聚合酶解偶联、切除或复制叉重塑产生延长的单链DNA区域。持续ssDNA可支持易错合成或变得可及于次级突变过程，将复制叉不稳定性与多种突变产生途径联系起来。
4.4 脆弱基因组区域与复制依赖性脆弱性
复制压力不成比例地影响内在难以复制的基因组区域。常见脆性位点、重复序列、二级结构形成位点和 other复制挑战区域在局部复制需求超过基因组维持能力时可经历不完全合成、断裂或重排。
由此产生的改变可包括序列水平和结构变化。碱基替换或小插入缺失可通过聚合酶错误或损伤旁路产生，而较大重排可源于复制叉崩溃、染色体断裂和异常修复。
因此，复制压力下的区域易感性反映对特定复制中间体和加工通路的局部脆弱性，而非全基因组突变的均匀增加。
4.5 跨损伤合成与生存相关突变
当复制性聚合酶遇到阻断持续合成的损伤或DNA结构时，专门的跨损伤合成聚合酶可允许跨 otherwise不可通过模板的复制。这种耐受机制可保存复制叉进程和细胞存活，但许多跨损伤聚合酶以低于复制性聚合酶的保真度运作，可增加突变固定的概率。
基因组结果取决于损伤、招募的聚合酶、序列背景、聚合酶参与持续时间和后续校正效率。一些旁路事件相对准确，而其他产生特征性替换或小插入缺失。
在致癌或治疗相关复制压力下对跨损伤合成的依赖性增加可因此将平衡从忠实复制转向生存相关突变。这创造了演化权衡，其中在不利复制条件下持续增殖以增加遗传变异为代价实现。
4.6 替代修复与复制重启通路
异常复制中间体可通过同源重组、复制叉逆转、断裂诱导复制、模板转换、末端连接及相关修复或重启通路加工。其相对使用取决于损伤结构、细胞周期阶段、通路可用性、检查点状态和肿瘤基因型。
许多这些通路通常是基因组保护性的。当通路选择、时机或执行变得不准确时，突变后果出现。易错重启可产生替换、插入缺失、拷贝数改变或结构重排。断裂诱导复制和相关机制可在定义条件下产生延长的非典型DNA合成片段和复杂基因组改变。末端连接通路可恢复染色体连续性同时在断裂位点引入序列丢失或重排。
因此，最终基因组结果不仅反映起始复制扰动，还反映可用于解析它的通路层级。致癌信号可通过检查点活性、细胞周期进程、加工因子表达和修复发生的生理条件间接影响此层级。
4.7 复制压力与次级突变底物
复制压力可产生增加机制上不同于复制本身的突变过程活性的分子底物。停滞复制叉、切除或复制叉重塑产生的持续ssDNA可变得可及于胞苷脱氨酶和其他偏好单链底物的酶。
在此情境中，复制压力主要控制底物可用性，而突变酶的调控构成单独的机制层。例如，APOBEC相关突变可反映酶活性和暴露ssDNA的丰度、持续性和分布的联合影响。
因此，复制扰动可通过异常复制中间体的直接加工和通过为次级突变反应创造底物来放大突变产生。
4.8 从复制压力到固定突变
当异常复制中间体通过产生可遗传序列或结构改变的通路解析时，发生复制相关突变。结果取决于中间体和加工通路，范围从准确恢复到替换、插入缺失、拷贝数改变或结构重排。这种以中间体为中心的关系提供了致癌复制压力与突变获得之间的机制桥梁。
4.9 致癌复制压力与突变获得联系的证据
当致癌基因激活或复制加工的实验扰动产生新获得突变的可测量变化且所得谱系可与定义明确的复制中间体、跨损伤聚合酶、修复通路或重启机制相联系时，复制相关突变的直接支持最强。
5 转录和染色质相关突变
转录活性和染色质组织塑造DNA复制、损伤、修复和最终突变的基因组背景。转录改变DNA拓扑、产生瞬时单链中间体、促进RNA-DNA杂交形成并可干扰复制，而染色质结构调控DNA可及性、损伤识别、修复效率、复制时序和高阶基因组组织。这些过程可影响突变的空间分布以及异常DNA中间体固定为遗传改变的概率。
需要在突变地形学和突变能力之间做出核心区分。一些转录或染色质构型主要将突变重新分布到易感基因组区域，而其他增加损伤、复制错误或异常核酸中间体遗传固定的概率。
5.1 致癌转录失调
癌细胞经常经历由致癌信号、改变的转录因子活性、增强子重塑和染色质可及性变化驱动的广泛转录重编程。这些改变可通过改变修复、检查点和复制相关基因的表达以及修饰转录和DNA复制进行的物理环境来影响基因组维持。
高转录活性可增加扭转应力、产生瞬时单链DNA区域、促进RNA-DNA杂交形成并增加转录复合物与复制机制之间的相遇。这些效应在高度表达基因、长转录单元、重复区域和转录与复制程序协调不良的位点尤为相关。
当转录失调产生定义明确的基因组中间体（如持续R环或转录-复制冲突）且随后改变局部突变频率、谱系或固定概率时，突变后果最大。
5.2 R环形成与持续
R环是由RNA-DNA杂交和 displaced单链DNA组成的三链核酸结构。它们在转录期间生理性出现并参与转录调控和终止。然而，其持续或失调累积可为基因组损伤和突变加工创造底物。
displaced DNA链可变得易受化学修饰或核酸酶攻击，而RNA-DNA杂交可阻碍复制叉进程。持续R环还可促进DNA断裂、单链缺口、改变的转录延伸和异常修复中间体。
持续R环创造两个机制相关的脆弱性。 displaced单链DNA更易受化学修饰、核酸酶切割和次级DNA加工反应影响，而RNA-DNA杂交可作为复制叉进程的物理障碍。未能解析这些结构可因此产生单链缺口、停滞或逆转复制叉以及需要修复或复制重启的DNA断裂。R环调控因子的实验扰动已表明改变的R环持续性改变基因组完整性，支持杂交解析与突变DNA中间体形成之间的因果联系。
5.3 转录-复制冲突
转录和复制共享相同DNA模板，必须在时间和空间上协调。转录复合物与复制叉之间的相遇可以同向或迎头方向发生，对复制叉进程和基因组完整性具有不同后果。
转录-复制冲突可减慢DNA合成、促进复制叉逆转、增加ssDNA暴露并产生断裂或不完全复制中间体。其严重性可被升高的转录活性、持续R环、改变的复制时序或解析停滞转录复合物能力有限所放大。
转录-复制相遇的方向和持续性影响所得复制中间体。迎头冲突可对复制叉进程施加特别强的障碍，而未解析的转录复合物或相关RNA-DNA杂交可促进复制叉减慢、逆转、ssDNA缺口形成或断裂。这些中间体随后可经历核酸酶加工、重启期间的DNA合成、损伤旁路或断裂修复。准确加工恢复基因组完整性，而易错重启或修复可将冲突转化为固定碱基替换、插入缺失、拷贝数改变或结构重排。因此，转录-复制冲突通过其产生的复制中间体的加工而非仅通过转录活性变得具有突变性。
5.4 染色质可及性、核小体组织与修复不对称性
染色质结构调控DNA对损伤剂、聚合酶、转录因子和修复机制的可及性。开放和紧凑染色质在损伤暴露、修复可及性和复制动力学方面不同，创造突变易感性的区域变异。
核小体定位增加更精细的空间组织水平。缠绕在组蛋白八聚体上的DNA受到物理约束，旋转定位可改变单个碱基对损伤剂和修复酶的可及性。核小体耗竭区域可经历更大分子暴露，而密集包装区域可表现延迟的损伤识别或修复。
这些效应通过分子暴露与基因组维持效率之间的平衡产生局部突变密度差异。因此，染色质组织可塑造突变优先累积的位置，而不暗示全基因组突变产生的均匀增加。
5.5 组蛋白修饰与染色质重塑复合物
组蛋白修饰和ATP依赖性染色质重塑复合物调控核小体定位、染色质压缩、DNA可及性、转录和DNA损伤反应。这些系统的改变可修饰受损DNA被识别、访问和加工的效率和方式。
组蛋白乙酰化、甲基化及相关修饰可影响修复蛋白的招募和局部染色质结构。染色质重塑复合物可改变损伤暴露、复制进程和修复通路选择。在定义情境中，这些变化可延长损伤持续或偏向具有更大突变潜力的加工通路。
5.6 DNA甲基化与序列背景突变性
DNA甲基化提供了表观遗传修饰直接改变序列水平突变性的最清晰例子之一。甲基化胞嘧啶，特别是在CpG二核苷酸内，可经历自发脱氨并产生含胸腺嘧啶错配，当修复不完全或不准确时固定为特征性替换。
此机制说明表观遗传标记如何改变核苷酸的内在化学易感性而不产生广泛基因组不稳定性。其突变效应是序列依赖性的，并促成突变概率的区域变异。
DNA甲基化变化还可影响转录、染色质可及性、复制时序和修复。因此，基因组后果反映甲基化碱基的直接化学易感性和对基因组维持的更广泛调控效应。
5.7 复制时序与高阶基因组结构
复制时序和高阶核组织促成癌症基因组中突变密度的大规模空间变异。晚复制区域通常比早复制区域表现更高突变负荷，尽管这些差异的机制是多因素的。
潜在贡献者包括改变的损伤修复、不完全复制DNA的延长暴露、检查点活性差异、局部底物可用性以及晚复制域特征的染色质环境。高阶区室，包括核纤层相关区域和异染色质域，在转录活性、复制时序、修复可及性和细胞应激源暴露方面也不同。
这些特征可产生基因组范围内可重复的突变富集或耗竭模式。因此，其主要贡献是塑造突变过程留下固定基因组记录的空间概率，而非暗示突变率的普遍增加。
5.8 基因组维持和突变通路的表观遗传调控
表观遗传状态不仅可通过局部染色质结构影响突变产生，还可通过调控控制基因组维持的基因来影响。启动子甲基化、增强子重编程、组蛋白修饰和改变的染色质重塑活性可改变参与复制保真度、DNA修复、检查点控制、氧化防御和突变酶活性的基因表达。
此调控途径在机制上不同于局部染色质效应。表观遗传程序不是改变特定基因组区域的损伤可及性，而是可改变决定DNA异常是否被预防、耐受、修复或固定的分子系统的丰度或活性。
5.9 转录和染色质状态与突变产生联系的证据
R环持续性、转录-复制冲突、序列易感性、损伤加工和基因组维持活性的扰动研究在定义系统中提供直接证据。相比之下，染色质特征、复制时序、核组织和区域突变分布之间的关联主要定义突变地形学，除非伴随突变供给改变的证据。此区分对于将突变的空间再分布与突变能力的状态依赖性变化分开至关重要。
6 炎症、免疫信号与酶促突变
炎症和免疫过程可通过反应性中间体、感染相关应激、改变的基因组维持程序和失调的DNA修饰酶改变突变产生。这些机制范围从间接增加损伤形成到基因组DNA的直接酶促修饰。
免疫和炎症生物学的独特贡献在于细胞外信号、反应性化学、宿主防御程序和核酸修饰酶的组合，可改变新遗传变异的生产。
6.1 慢性炎症信号与突变压力
慢性炎症可使肿瘤和癌前细胞暴露于持续细胞因子信号、反应性代谢物、组织损伤和增殖与修复的反复循环。持续炎症程序可改变氧化还原平衡、复制动力学、DNA损伤反应以及基因组维持或DNA修饰酶的表达。
细胞因子驱动信号可通过增加氧化或亚硝化应激、修饰转录和复制程序或改变修复和抗氧化能力间接影响突变。基因组后果源于这些下游分子效应而非细胞因子信号本身。
反复组织损伤和代偿性增殖可进一步增加受损DNA在完全解析之前遇到复制的概率。因此，慢性炎症突变压力可源于持续损伤、改变基因组维持和持续细胞周期进程的汇聚。
6.2 炎症突变中的活性氧和氮物种
活化的免疫和基质细胞产生活性氧和活性氮物种作为抗微生物防御和炎症信号的组成部分。持续炎症暴露可修饰DNA碱基、脱氧核糖残基和核苷酸前体，并可产生链断裂或其他潜在突变中间体。
此情境中的独特特征是反应性物种暴露的细胞来源和空间组织。免疫来源的氧化剂和硝化物种可对邻近上皮或肿瘤细胞施加反复基因毒性应激，而炎症信号可同时修饰细胞内抗氧化和修复反应。
在分子水平，氧化和亚硝化化学可产生不同类别的突变底物。氧化反应可修饰鸟嘌呤和其他碱基、氧化核苷酸前体并促进糖损伤或链断裂，而一氧化氮和过氧亚硝酸盐相关化学可增加碱基脱氨、硝化、氧化和DNA链损伤。这些异常进入不同加工途径：修饰碱基可被碱基切除修复移除，受损核苷酸池可在掺入前被sanitize，链断裂需要在复制或染色体分离前修复。当损伤持续、被不准确旁路或通过易错修复加工时，改变的碱基配对可固定为替换，而不完全或不准确修复的链断裂中间体可促成缺失或结构改变。因此，炎症ROS/RNS通过定义明确的化学损伤将免疫激活与突变产生联系起来，其最终基因组后果取决于修复、复制和损伤加工通路。
6.3 感染相关突变环境
持续感染可通过慢性炎症、病原体衍生蛋白、改变的宿主细胞信号、氧化或亚硝化应激、DNA修复破坏和增加的再生性增殖促进突变产生。因此，感染相关癌症提供了免疫激活、组织损伤和基因组维持在机制上耦合的情境。
一些病原体主要通过持续炎症损伤和代偿性增殖间接增加突变压力。其他病原体编码改变DNA损伤信号、检查点控制、修复能力或复制保真度的蛋白或诱导宿主反应。其中几种机制可在同一组织内同时运作。
所得基因组模式反映炎症化学、病原体内在效应、改变复制和宿主基因组维持反应的相对贡献。当病原体相关条件可解析为修饰突变产生过程的定义分子途径时，归因变得更具体。
6.4 先天免疫信号与DNA修饰酶的调控
先天免疫通路可通过控制抗病毒防御、炎症信号、应激反应和核酸修饰酶的转录程序影响突变条件。模式识别和干扰素相关通路激活在正常宿主防御中具有保护性但在肿瘤细胞中慢性或异常参与时可变得适应不良的程序。
一个后果是胞苷脱氨酶及相关酶的调控改变，其生理功能包括修饰或限制外来核酸。失调表达、改变定位或延长活性可增加宿主基因组DNA成为非预期底物的概率。
先天免疫信号还可通过影响转录、复制、DNA末端加工和修复来修饰易感DNA中间体的可用性。因此，突变输出取决于酶调控与可及底物的丰度、持续性和基因组分布的汇聚。
6.5 APOBEC、AID与底物依赖性酶促突变
APOBEC家族胞苷脱氨酶构成癌症中特征最充分的体细胞突变酶促来源之一。失调的APOBEC活性可使暴露单链DNA内的胞嘧啶脱氨，产生含尿嘧啶中间体，随后被加工为特征性碱基替换并在某些情境中形成簇状突变事件。
APOBEC活性的基因组影响取决于底物可用性以及酶丰度。单链DNA可在DNA复制、停滞复制叉加工、DNA末端切除、转录相关结构和修复期间出现。因此，相当水平的APOBEC活性可根据暴露ssDNA的丰度、持续性和基因组分布产生不同突变输出。
这种酶-底物耦合解释了为什么APOBEC相关突变可在不同细胞背景中变化。抗病毒或炎症信号可在某些情境中调控酶表达，而复制、转录或修复异常可独立决定底物暴露。因此，APOBEC突变不应被解释为统一免疫驱动。
活化诱导胞苷脱氨酶提供相关但生物学上不同的例子。AID通常在B细胞中介导体细胞超突变和类别转换重组，但异常表达或错误靶向可在非免疫球蛋白位点引入损伤和突变。其基因组后果同样取决于表达、靶向、底物可及性和下游DNA加工。
因此，APOBEC和AID相关突变说明为受控核酸修饰而演化的酶在调控、靶向或底物暴露改变时如何成为基因组多样化的来源。
APOBEC活性的前瞻性研究还说明突变产生与选择之间的区分。APOBEC3A/3B活性可在癌细胞群体中产生广泛的新获得突变集和特征性突变模式，而所得变异中仅一部分（如果有的话）随后提供背景依赖性适应度优势。因此，持续酶促突变的证明确立突变供给增加，但不暗示每个新产生的改变都促进肿瘤进展。
6.6 酶促突变特征与因果解释
突变特征可揭示定义明确的生化过程对肿瘤中突变的历时累积有所贡献。APOBEC相关特征特别具有信息性，因为其序列背景和簇状模式通常可与胞苷脱氨和下游加工相联系。
特征归因提供突变活性的基因组记录而非上游细胞构型的直接测量。当特征性突变模式与相关酶、可及底物和扰动依赖性新产生突变变化的功能证据汇聚时，解释得到加强。
6.7 免疫选择与免疫驱动突变产生
免疫活性可通过选择和突变产生两者塑造肿瘤遗传多样性。免疫监视可有利于具有降低免疫原性或增强免疫逃逸能力的已有克隆的扩增，而炎症和免疫相关通路可通过反应性中间体、基因组维持变化或失调DNA修饰酶改变突变供给。
这些过程可顺序运作：免疫相关突变可产生新变异，随后被免疫选择过滤。因此，在解释炎症、突变负荷、瘤内异质性和免疫逃逸之间的关系时，其区分尤为重要。
6.8 炎症和免疫通路与突变产生联系的证据
APOBEC介导的胞苷脱氨证据特别强，其特征性突变模式可与酶活性、易感ssDNA底物和功能扰动相联系。相比之下，炎症ROS/RNS、感染相关应激、细胞因子依赖性基因组维持变化和先天免疫信号提供生物学上合理且实验支持的途径，其直接前瞻性突变证据在不同肿瘤类型和实验系统中仍不太统一。
7 突变产生的微环境和治疗相关驱动因素
肿瘤的突变景观不仅由细胞内在程序塑造，还由癌细胞居住和演化的细胞外环境塑造。缺氧、营养限制、酸中毒、基质相互作用、炎症生态位和治疗暴露可施加外部压力，改变复制、基因组维持、应激反应和潜在突变DNA中间体的加工。
当外部条件诱导改变损伤形成、复制保真度、DNA加工、底物可及性或突变固定的细胞反应时，可修饰突变供给。这些直接和适应途径与图2中其他主要突变产生机制整合。这些相同条件对已有遗传变异的选择效应在第7.7节单独考虑。
7.1 缺氧与基因组去稳定化
缺氧是实体瘤的常见特征，可通过缺氧反应信号、改变的细胞氧化还原条件、修复能力变化以及复制与可用代谢资源之间协调受损来修饰DNA复制和基因组维持。
延长或波动的缺氧可促进复制异常并增加DNA损伤负荷，特别是当不完全DNA合成或损伤持续超过基因组维持能力时。复氧可施加额外氧化挑战，创造缺氧适应和 renewed氧暴露产生不同形式基因组应激的循环。
7.2 营养限制、代谢应激与酸中毒
快速肿瘤生长可超过血管供应，产生葡萄糖、氨基酸、氧和其他细胞稳态所需资源受限的区域。营养限制可约束DNA合成和基因组维持，同时激活允许在资源有限条件下持续存活的应激适应程序。
严重营养限制可降低忠实DNA复制所需底物的可用性并改变细胞管理氧化或复制相关应激的能力。此情境中的相关贡献是创造这些约束的外部剥夺而非其传递的详细细胞内代谢通路。
细胞外酸中毒，灌注不良肿瘤的另一特征，可影响信号、酶活性、染色质调控和DNA损伤反应。因此，其对突变产生的贡献可能通过损伤持续、复制保真度和基因组维持能力的下游效应而非酸度作为直接突变剂发生。
7.3 基质和空间微环境对突变条件的控制
癌细胞在多细胞生态系统中演化，包含成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、细胞外基质组分和局部变化的生化条件。这些元素可通过可溶性因子、代谢物、细胞外囊泡和直接细胞-细胞相互作用影响肿瘤细胞增殖、应激信号、营养获取、炎症暴露、基因组维持通路和治疗敏感性。
癌症相关成纤维细胞和免疫细胞可通过细胞因子、反应性物种和代谢交换修饰局部基因毒性压力，而基质信号可改变增殖需求或参与基因组维持的通路表达。因此，这些相互作用的突变后果源于施加于肿瘤细胞的局部条件而非仅基质身份。
这些影响在空间上是异质的。不同肿瘤区域在氧合、细胞外pH、营养可用性、免疫浸润、基质组成和治疗暴露方面可不同。此类差异可创造损伤形成、DNA加工、复制压力或修复能力在肿瘤块内变化的局部环境。
因此，空间组织可塑造肿瘤细胞经历的突变压力强度和类型。当与局部环境条件相联系并与克隆扩增、迁移或群体结构产生的差异区分时，突变负荷或谱系的区域差异最具信息性。
7.4 化疗相关突变
许多细胞毒性化疗通过直接损伤DNA或干扰DNA合成起作用。烷化剂、铂类化合物、拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物可产生加合物、交联、链断裂或复制异常，为突变加工提供底物。
基因组结果取决于药物机制、暴露强度、修复能力、复制状态和治疗细胞的存活。治疗可同时产生潜在突变损伤并消除携带广泛损伤的细胞。因此，演化相关治疗相关突变仅在基因组改变在存活群体中固定时出现。
选定化疗可留下可识别突变特征。此类特征提供治疗相关损伤对突变累积有所贡献的证据，尽管这些突变的演化后果取决于其在治疗后环境中的效应。
治疗相关突变特征提供了为何突变获得不应等同于获得癌症驱动改变的清晰例子。全基因组治疗足迹可包含众多治疗相关替换或其他改变，而仅一小部分预期影响治疗后环境中的细胞适应度。因此，突变足迹独立于个体突变随后是否被选择而记录治疗相关突变产生。
7.5 放疗与照射后突变
电离辐射产生广谱DNA损伤，包括碱基损伤、单链断裂、双链断裂和复杂簇状损伤。这些损伤为修复、复制和损伤耐受通路创造底物，其保真度决定基因组完整性是恢复还是持续改变出现。
放疗对突变产生的贡献取决于损伤强度和细胞存活。广泛辐射诱导损伤可致死，而亚致死暴露可使存活细胞中不完全或不准确加工的损伤固定为替换、缺失、重排或其他基因组改变。
照射后突变由修复通路使用、细胞周期状态、复制状态和肿瘤已有基因组背景塑造。纵向或配对治疗前后分析对于鉴定照射后存活肿瘤群体中出现的改变特别具有信息性。
7.6 靶向治疗与适应性突变反应
靶向治疗通常比DNA损伤治疗直接基因毒性更低，但可诱导改变突变产生条件的适应性细胞反应。致癌信号抑制可在残留肿瘤细胞中产生应激反应重编程、改变复制行为、检查点适应、DNA加工通路变化和生存程序。
在选定情境中，这些适应可增加对低保真度DNA加工的依赖、改变异常DNA中间体的丰度或修饰突变酶底物的可及性。相关问题不是任何单一通路的再激活，而是治疗诱导的适应构型是否改变后续突变获得。
7.7 治疗诱导突变产生与选择
治疗抵抗可通过已有抵抗变异的选择、治疗期间或之后新突变的获得或允许存活直到遗传编码抵抗出现的非遗传适应产生。这些途径还可顺序运作，适应性存活保存群体，其中新变异随后出现并在持续治疗下被选择。
治疗诱导APOBEC突变为这些顺序过程提供了实验解析的例子。在暴露于靶向治疗的持续癌细胞群体中，治疗诱导的APOBEC3A活性增加基因组多样化，从而扩展新产生变异的池，抵抗相关改变可随后从中被选择。因此，突变供给的增加在机制上不同于随后提高治疗下存活的特定变异的选择性富集。
区分这些途径需要时间和谱系解析。治疗后检测到的抵抗相关改变不能假定由治疗产生；需要纵向或谱系解析分析来确定治疗是改变突变供给、克隆适应度还是两者。
7.8 微环境和治疗压力与突变产生联系的证据
证据在外部压力之间差异显著。DNA损伤治疗提供相对直接的突变产生途径，而缺氧、营养限制、酸中毒、基质信号和靶向治疗更常间接修饰突变条件且具有较不统一的前瞻性证据。
第3-7节考察的主要机制根据其生物学背景、分子介质、基因组后果、新获得突变证据、时间行为、代表性肿瘤情境和主要证据局限性在表2中比较。
[表2：癌症中促进突变产生的机制比较证据。核苷酸池失衡：改变的核苷酸合成、营养可用性或增殖需求——失衡或耗竭的dNTP池；受损核苷酸物种——错误掺入、改变复制保真度、复制相关错误——实验操纵可在定义系统中改变突变频率或谱系——可诱导变化在实验上可处理；持续时间依赖性因系统而异——快速增殖肿瘤；代谢扰动——机制强；定义情境中可获得直接突变证据。必须区分核苷酸效应与下游复制压力。肿瘤代谢物依赖性基因组维持破坏：IDH、FH、SDH或相关代谢改变——代谢物敏感性修复和调控酶——改变修复、损伤持续、染色质调控、突变易感性——直接突变证据比机制证据更可变——在代谢改变持续时通常持久；状态依赖性可能未完全解析——IDH突变和代谢改变肿瘤——机制证据强；因果突变证据背景依赖。多个下游通路使归因复杂化。线粒体和氧化还原功能障碍：线粒体功能障碍、改变氧化还原缓冲、氧化应激——ROS、氧化核苷酸池、改变抗氧化和修复能力——氧化损伤和 incomplete修复或sanitization后的特征性替换——选定扰动系统中证明直接突变变化——可瞬时、复发或持续取决于线粒体/氧化还原背景——多种实体和血液恶性肿瘤——机制强但异质。单独氧化损伤不确立突变固定。致癌基因驱动复制压力：RAS-MAPK、MYC、PI3K-AKT、细胞周期蛋白/CDK失调——过度起点活性、停滞或崩溃复制叉、ssDNA、改变重启——替换、插入缺失、拷贝数改变、结构改变——当致癌扰动与突变获得前瞻性联系时直接证据最强——随致癌活性可诱导；持续性取决于细胞适应和基因型——致癌基因驱动肿瘤——机制支持强；直接突变证据因通路和模型而异。复制压力本身不等同于突变。易错旁路和复制重启：持续复制阻断损伤或异常复制中间体——跨损伤聚合酶、易错重启、替代修复/耐受通路——碱基替换、插入缺失、重排、复杂改变——特定加工通路的扰动可改变突变率或谱系——活性可在定义复制压力期间增加——复制压力和治療暴露肿瘤——与突变固定的直接机制联系。通路冗余和代偿加工使解释复杂化。R环和转录-复制冲突：高转录活性、R环解析受损、转录-复制干扰——RNA-DNA杂交、暴露ssDNA、停滞复制中间体——局部替换、断裂、插入缺失或重排——选定扰动系统中证明突变变化——通常可诱导并与转录/复制状态相关——高度转录活跃或复制压力肿瘤——机制证据强；直接突变证据新兴。局部基因组效应不应自动解释为增加全局突变率。染色质和表观遗传背景：改变可及性、核小体组织、组蛋白修饰、染色质重塑、甲基化——差异损伤暴露、修复可及性、对基因组维持的调控效应——区域突变富集/耗竭；序列背景突变性；改变突变易感性——突变地形学证据强；增加全局突变供给的直接证据不太统一——一些构型动态而其他相对稳定——广泛跨癌症基因组——空间模式证据强；改变总突变产生的证据可变。地形学必须与全局突变能力分开。炎症ROS/RNS：慢性炎症或免疫激活——免疫来源活性氧和氮物种；改变修复和抗氧化反应——氧化、亚硝化、脱氨相关或其他可固定损伤——直接前瞻性突变证据因炎症系统而异——反复或慢性炎症暴露可创造时间可变突变压力——炎症和感染相关癌症——生化合理性 强；因果突变证据异质。单独反应性损伤不足。APOBEC/AID酶促突变：失调酶表达与可及核酸底物——APOBEC家族胞苷脱氨酶；AID；ssDNA底物可用性——特征性替换和簇状突变事件——广泛基因组和实验证据，特别是APOBEC相关突变模式——在选定情境中已推断或证明 episodic、复发或持续活性——多种肿瘤类型，包括治疗演化癌症——最强酶促例子之一。单独酶丰度不足；需要底物可及性和加工。缺氧和营养限制微环境：灌注不良、缺氧、营养剥夺、酸中毒——应激适应程序；改变修复、复制和基因组维持条件——增加损伤持续或复制相关突变加工的机会——直接突变证据比基因组应激证据不太统一——波动氧合和资源可用性可产生反复暴露——灌注不良实体瘤——机制证据 substantial；直接突变证据相对有限。必须避免仅从应激标志物推断突变。化疗相关突变：暴露于DNA损伤或复制干扰细胞毒性剂——药物特异性损伤随后修复、耐受或复制——治疗相关替换、插入缺失、重排或突变特征——选定治疗产生可识别治疗相关突变/特征的强证据——定义暴露间隔允许时间归因，特别是配对或纵向采样——治疗恶性肿瘤和继发/治疗后肿瘤——对选定药物强。单独损伤形成不足；需要在存活细胞中固定。放疗相关突变：电离辐射——碱基损伤、单和双链断裂、簇状损伤及后续修复——替换、缺失、结构改变、重排——在定义实验和临床情境中证明照射后突变获得——暴露时机定义明确，但突变固定和后续选择发生在照射后——照射肿瘤和存活细胞群体——直接基因毒性机制有 substantial支持。必须区分损伤、存活、突变固定和后续选择。靶向治疗相关适应性突变：药理学通路抑制和治疗下存活——改变复制、修复、DNA加工或突变底物可及性的适应应激反应——存活细胞中新获得突变的潜在增加或偏移——选定治疗情境中存在直接证据但跨治疗不统一——在治疗适应和残留疾病中特别相关——分子靶向治疗和获得性抵抗——新兴和背景依赖。治疗后出现的抵抗本身不证明治疗诱导突变产生。]
8 肿瘤演化中的动态突变器状态
癌症中的突变产生可受多种细胞内在和背景依赖过程影响。尽管这些机制在分子基础和证据强度上不同，它们汇聚于更广泛的原则：癌细胞产生新基因组变异的能力可随生理和环境背景而变化。因此，突变活性不必仅源于基因组维持的组成性缺陷；在选定情境中，它可源于改变突变产生和固定条件的协调细胞构型。
动态突变器状态指突变能力与适当参照状态不同且伴随新获得突变可测量变化的协调细胞构型。单独应激、DNA损伤、活性氧、缺氧、复制压力或APOBEC表达不足以定义此类状态。这些特征可作为触发因素、组分或机制，但状态本身反映一个或多个突变产生过程被改变的整合细胞构型。
该序列可表示为：细胞或环境扰动→协调细胞状态改变→改变突变产生过程→新突变获得→基因组多样化→选择和克隆演化。
扰动、协调细胞状态改变、改变突变能力、突变获得和后续基因组多样化之间的整合关系总结于图3。
[图3：癌症中的动态突变器状态。动态突变器状态是突变能力与适当参照状态不同且伴随新突变获得、速率或谱系改变的协调细胞构型。个体应激或通路是组分而非状态本身。动态突变器状态可表现瞬时、复发、持续或稳定化时间行为，恢复或逆转恢复参照构型。突变产生供给新变异，而选择决定哪些变异持续和扩增。]
每一步在机制上可分离。扰动可改变细胞生理而不改变突变；增加DNA损伤可在无突变固定的情况下被解析；新产生变异可为中性或有害；克隆扩增取决于特定环境中的适应度。因此，动态突变代表肿瘤演化的一个组成部分而非选择、漂变、群体结构或克隆竞争的替代。
8.1 从机制输入到状态依赖性突变能力
细胞状态的突变后果源于多种生物过程的相互作用而非单一通路。代谢、复制相关、转录、染色质、炎症和治疗反应程序可在同一细胞内汇聚并可相互加强、抵消或条件化。
当协调变化同时影响多个突变产生决定因素时，状态依赖性突变能力增加最合理。单一扰动可以因细胞背景不同而以不同组合改变底物可用性、基因组维持能力、复制保真度、染色质组织或突变酶可及性。
因此，突变输出不仅取决于个体机制的活性，还取决于其发生的构型。相同上游扰动可根据修复能力、复制状态、染色质状态、抗氧化防御和易感底物可用性产生不同基因组后果。这种背景依赖性是状态依赖性突变能力的定义特征。
8.2 突变状态的时间行为
动态突变器状态不必遵循单一时间模式。可区分几种时间行为形式作为组织类别而非固定生物类别。
瞬时突变状态是突变产生活性上升并随后随起始条件解析或细胞稳态恢复而下降的有限间隔。此类行为可在急性应激或短暂环境或治疗扰动期间发生。其基因组影响取决于突变活性的幅度和持续时间以及受影响细胞的存活。
复发突变状态由波动或反复条件触发的突变活性反复发作组成。间歇环境应激、反复炎症暴露或连续治疗扰动可在适当情境中产生此模式。复发发作即使个体短暂也可产生 substantial累积基因组多样性。
持续突变状态的特征是突变产生活性在直接起始刺激之后继续升高。持续性可反映持续信号、持久转录或代谢重编程、持续基因组维持损害或对低保真度加工通路的延长依赖。
稳定化突变状态代表进一步转变，其中最初背景依赖性构型被持久表观遗传或遗传改变强化。随着稳定化增加，可逆细胞状态与组成性突变器表型之间的区分可能缩小。因此，稳定化需要持久强化或可逆性降低的证据而非仅持续性。
这些时间行为最好视为可能突变动力学的连续体而非肿瘤必然经过的阶段。
突变获得还可反馈于后续突变能力。一个间隔或细胞分裂中产生的突变可改变DNA修复、复制保真度、检查点控制或其他基因组维持决定因素，从而改变后代细胞继承的突变构型。因此，后续分裂的突变率或谱系不必与亲本状态等同。在此情境中，最初状态依赖性突变事件可产生强化、重定向或稳定化未来突变活性的遗传改变，创造细胞状态→突变获得→改变基因型→改变后续细胞状态和突变能力的潜在反馈序列。此类反馈不是动态突变器状态的 obligatory特征，但它提供瞬时可背景依赖性突变在肿瘤演化期间逐步稳定化的机制。
8.3 肿瘤起始期间的动态突变
起始突变产生的条件可随组织背景、增殖历史、炎症暴露和其他生理应激而变化。慢性损伤、感染、再生性增殖或持续组织扰动可在明显恶性肿瘤发展之前创造突变产生过程升高的间隔。
当增殖增加期间与基因组维持受损或潜在突变中间体暴露增加重合时，可能特别具有后果，增加起始遗传改变固定的概率。因此，突变能力的瞬时或复发增加可促进携带有利驱动改变的克隆的出现。
当时间定义的组织条件可与改变突变获得相联系而非仅从已确立肿瘤的累积基因组负荷推断时，肿瘤起始期间的动态突变得到最强支持。
8.4 肿瘤进展、空间异质性与不等突变供给
转化后，扩增的肿瘤群体遇到在氧合、营养可用性、基质组成、炎症信号、细胞外pH和治疗暴露方面不同的异质局部环境。遗传相关细胞可因此在同一肿瘤内占据不同生理状态。
如果这些状态在基因组维持能力、复制保真度、底物暴露、氧化还原控制或突变酶可及性方面不同，新遗传变异的生产可在肿瘤亚群之间不均匀分布。
动态突变器状态和肿瘤亚克隆相关但概念上不同。肿瘤亚克隆主要由共享祖先和遗传改变定义，而动态突变器状态由与改变突变能力相关的生理或功能细胞构型定义。因此，属于同一遗传亚克隆的细胞在暴露于不同微环境或治疗条件时可占据不同突变器状态，而遗传不同亚克隆在经历可比生理压力时可汇聚于相似突变状态。相反，特定亚克隆内突变产生增加可产生新可遗传变异，从而建立女儿谱系并促成后续亚克隆多样化。因此，动态突变器状态可在演化遗传亚克隆之内、之间和跨其运作，而非与克隆身份一一对应。
因此，不等突变供给可与差异选择和克隆扩增一起促成瘤内异质性。然而，突变负荷或突变特征的区域变异本身不确立突变产生的区域差异，因为空间模式还可源于克隆祖先、迁移、局部选择或群体历史差异。
当区域细胞条件可与新获得变异的模式机制上和时间上相联系而非仅与空间克隆结构联系时，状态依赖性突变的贡献最具说服力。
8.5 转移演化
转移播散使肿瘤细胞在侵袭、循环、免疫监视、定植和适应远处组织期间暴露于顺序不同的环境。这些转变可施加新生理压力并要求 substantial细胞重编程。
此类变化可在转移进展期间改变突变能力。适应新组织生态位可修饰基因组维持程序或其他突变产生决定因素，而转移部位 renewed增殖扩增可创造额外基因组多样化机会。
转移转变本身诱导动态突变器状态的直接证据相对于其他几种情境仍有限。原发和转移病变之间的基因组分歧可源于已有亚克隆的选择、遗传漂变、 elapsed演化时间或播散之前、期间或之后突变获得。
因此，转移相关突变供给变化应保持为可检验可能性而非仅从原发-转移基因组分歧推断。
8.6 治疗诱导状态转变与抵抗演化
治疗暴露是肿瘤细胞状态可快速变化的特别重要情境。细胞毒性剂、放疗和靶向治疗可在存活群体内诱导应激适应、改变基因组维持活性、转录重编程和DNA加工变化。
一些治疗诱导状态可通过改变复制保真度、损伤加工、底物暴露或对低保真度修复和耐受通路的依赖来修饰突变供给。存活和突变保持可分离结果：治疗诱导状态可在不增加突变产生的情况下保存活力，或可改变突变获得而不立即产生有利抵抗突变。
因此，抵抗演化可涉及几种相互作用过程，包括 standing遗传变异、非遗传适应、治疗相关新突变产生和后续选择。当治疗诱导细胞重编程改变治疗选择随后可作用的新遗传变异生产时，动态突变器状态最相关。
8.7 复发与反复突变活性
复发肿瘤经常包含治疗前样本中未检测到的基因组改变，但这些差异可通过多种演化途径产生。一些变异可能在治疗前低于检测限存在，其他可能在残留疾病期间出现，还有其他可能在治疗相关应激或后续再生长期间产生。
残留肿瘤群体可经历信号改变、生理约束、免疫压力和治疗暴露的反复发作。如果此类条件反复改变突变产生过程，连续治疗和恢复间隔可创造基因组多样化的反复窗口。
此可能性在暴露于多轮治疗的肿瘤中特别相关，但反复突变活性不应仅从复发相关基因组改变推断。证明需要纵向证据将反复状态改变与新获得突变时机相联系。
这些演化情境可整合为肿瘤演化期间突变活性的时间可变窗口，如图4所示。
[图4：肿瘤演化中的动态突变活性。蓝色轨迹是突变活性可能相对变化的示意图，不旨在代表所有肿瘤亚克隆的定量均值。个体遗传亚克隆、空间不同肿瘤区域或生理细胞状态可同时遵循不同突变轨迹。突变活性可在肿瘤起始、进展、空间多样化、转移演化、治疗暴露、残留疾病、抵抗和复发期间上升、下降、复发或持续。因此，空间不同肿瘤区域可经历不等突变供给，而转移和复发相关变化仍背景依赖并需要时间证据进行因果归因。治疗暴露可产生瞬时、持续或最小突变活性变化。突变供给和选择压力保持肿瘤演化中不同但相互作用的组成部分。]
8.8 从动态突变到克隆演化
突变产生和克隆选择是肿瘤演化的顺序但不同组成部分。动态突变器状态影响新遗传变异的供给和谱系，而选择决定哪些变异在特定环境中频率增加。
如果大多数新产生变异为中性或有害，突变供给增加不一定加速演化。相反，当强选择压力有利于稀有适应变异时，即使突变产生的适度增加也可具有 substantial演化后果。
因此，突变器状态的演化影响取决于其突变输出和该输出产生的选择环境。在治疗下、转移定植期间或空间异质肿瘤生态位内，改变突变供给可增加潜在适应变异出现的概率，而选择决定这些变异是否持续并成为克隆优势。
8.9 动态突变器状态框架的边界
并非癌症中每个促进突变的机制都构成动态突变器状态。一些过程是组成性的，因为它们源于DNA复制或修复的稳定缺陷。其他可能可诱导但缺乏突变获得随细胞状态随时间变化的证据。还有其他可能增加DNA损伤或基因组不稳定性而无证明增加固定突变产生。
当三个元素汇聚时，动态突变器状态得到最强支持：可测量细胞状态改变→机制相关的突变产生过程改变→新获得突变的后续变化。
时间、扰动、可逆性或挽救证据提供额外支持，表明突变能力随状态变化而非仅与其相关。
仅由通路激活、应激标志物、DNA损伤、基因组不稳定性或回顾性突变模式支持的机制应根据可用证据强度解释，而非自动归入动态类别。此区分保持已确立因果机制、合理状态依赖性过程和时间未解析关联之间的分离。
因此，动态突变可理解为选定癌细胞状态的可变属性而非肿瘤生物学的普遍特征。其演化意义取决于此类状态何时出现、持续多久、是否复发或稳定化以及其产生的遗传变异是否随后被选择保留。确立这些关系需要能够在时间上解析细胞状态和突变获得的实验方法。
9 突变器状态的实验鉴定与重建
动态突变器状态的生物学相关性取决于其是否可被鉴定、时间解析并与组成性突变器表型或回顾性基因组后果区分。这需要能够将定义明确的细胞构型与突变加工的机制相关改变以及随后新突变获得相联系的实验策略。
需要两种互补方法。回顾性重建从已累积的基因组模式推断先前突变活性，而前瞻性证明在获得新突变的间隔之前或期间测量细胞状态。回顾性方法对于重建人类肿瘤演化不可或缺，但前瞻性设计为确立因果状态依赖性突变提供更强基础。
核心实验要求可表示为：细胞构型→机制相关的突变加工改变→新突变的后续获得。
当该序列由时间优先、受控扰动、细胞增殖标准化、逆转或挽救以及跨独立生物模型验证支持时，证据逐步增强。
9.1 突变活性的回顾性重建
大多数人类肿瘤在 substantial基因组演化已经发生后分析。因此，测序通过累积替换、插入缺失、结构改变、拷贝数改变和突变特征提供突变过程的历时记录。
突变特征可暗示错配修复缺陷、聚合酶相关突变、APOBEC活性或暴露相关突变等生化过程，而克隆和系统发育分析可大致将突变谱系变化定位于肿瘤演化历史内。主干和亚克隆突变、原发和转移病变、空间不同肿瘤区域或治疗前后样本之间的差异可揭示突变过程随时间的变化。
当突变特征、克隆性、系统发育结构和正交分子测量一起解释时，这些方法最具信息性。特征更容易鉴定突变过程的历史活性而非产生它的生理状态，系统发育时机通常相对于而非直接按时间顺序。
因此，回顾性重建最适用于鉴定突变活性的候选变化、约束其大致演化时机并提名细胞状态进行前瞻性测试。
9.2 状态依赖性突变的前瞻性证明
前瞻性分析为确立动态突变器状态提供最强途径，因为它直接测试可测量细胞构型是否先于并修饰后续突变获得。
严格设计可遵循序列：定义参照状态→诱导或扰动候选状态→验证拟议突变机制→纵向追踪细胞→量化新获得突变→表征突变谱系→测试逆转或挽救→跨独立模型验证。
参照状态应针对生物系统明确界定。取决于实验，它可包括扰动前状态、未处理对照、遗传匹配谱系、匹配培养条件或其他实验指定比较物。
然后应使用适合拟议机制的测量表征候选状态，包括转录组、代谢、表观遗传、蛋白质组、复制相关或信号特征。目标是确立在评估其基因组后果之前已诱导可重复细胞构型。
突变获得应在状态定义之后并相对于指定比较物测量。DNA损伤增加、复制异常、ssDNA暴露、核苷酸失衡或突变酶活性改变等机制变化支持拟议通路但仍不同于新产生突变的测量。
实验解释还必须区分单位时间突变累积与每细胞分裂突变倾向。更快增殖群体可在固定间隔内累积更多突变，即使每复制周期突变概率不变。因此，在可行时，突变获得应标准化为群体倍增、细胞分裂或其他生物学适当分母。
9.3 前瞻性突变累积与纵向测序
与纵向测序耦合的突变累积实验提供在定义条件下测量新获得基因组变异的最直接手段之一。细胞可源自遗传表征的起始群体，暴露于指定扰动，扩增定义间隔或世代数，并连续测序以鉴定实验期间获得的突变。
充分表征的起始群体至关重要，因为稀有已有变异在随后扩增时否则可被误分类为新产生突变。克隆起始群体、高深度基线测序、分子条形码或能够检测低频变异的相关方法可减少此模糊性。
全基因组测序可量化定义间隔内的替换、插入缺失、结构改变和突变谱系变化。将连续基因组测量与分子谱分析配对允许候选状态的出现与新突变出现的间隔对齐。
选择仍是重要混杂因素，因为观察到的突变累积反映突变产生与活力、增殖和克隆竞争。有害突变可消失，而有利变异可变得不成比例地代表。因此，最小化强选择、追踪谱系丰度或明确建模差异存活的设计特别具有信息性。
机制扰动可进一步加强因果推断。抑制候选突变酶、校正核苷酸失衡、恢复氧化还原控制或抑制易错加工通路可测试观察到的突变累积是否取决于拟议机制。
9.4 单细胞和谱系解析方法
单细胞基因组学、谱系追踪和克隆条形码提供解析细胞状态、祖先、突变获得和克隆适应度之间关系的互补策略。
单细胞DNA测序可鉴定分支特异性突变和亚克隆多样化，而配对或联合分子谱分析可将基因组改变与转录组或表观遗传状态相联系。这些方法有助于解析在 bulk群体中模糊的细胞构型与突变历史之间的候选关系。
谱系追踪和克隆条形码通过在扰动前标记细胞或克隆增加时间和谱系信息。它们特别适用于区分已有抵抗谱系的扩增与存活群体内新突变的获得。
最强设计将谱系信息与纵向测序和分子状态谱分析结合。这使得测试定义状态是否先于同一谱系内突变获得以及区分从头基因组多样化与 standing变异选择成为可能。
单细胞基因组测量的技术局限性，包括等位基因脱落、覆盖不均、扩增伪影和低频变异灵敏度有限，必须纳入实验解释。
9.5 测试状态依赖性突变的实验模型
细胞系、类器官、患者来源肿瘤模型和实验肿瘤提供互补系统，其中候选突变器状态可被诱导、测量和扰动。
类器官和患者来源模型特别有用，因为它们可保留组织架构、谱系身份和临床相关基因组背景的方面，同时允许受控扰动。纵向采样随后可将定义状态转变与后续突变获得相联系。
这些模型还允许直接测试背景依赖性。相同扰动可在一个谱系或基因组背景中产生突变反应而在另一个中不产生，允许鉴定状态可及性和突变产生能力的决定因素。
没有模型完全再现人类肿瘤的多细胞、免疫、基质、空间和演化复杂性。因此，当在可处理系统中鉴定的因果关系跨互补模型再现并与人类疾病观察比较时，实验结论最强。
9.6 候选状态的空间、多组学和计算重建
空间和多组学方法可解析细胞表型、克隆祖先和局部肿瘤背景在癌症演化期间如何交叉。重要的是，近期研究已开始提供这些关系的生物学例子而非仅方法能力。使用单细胞多组学谱系追踪，Nadalin等人鉴定了转录上不同的癌细胞状态，这些状态已与不同后续命运相关，包括肿瘤起始和药物耐受。肿瘤起始克隆占据具有共享染色质可及性特征的独特基线转录程序，而药物耐受群体遵循遗传和转录上不同的轨迹。这些发现证明谱系解析多组学可将已有细胞构型与后期演化行为相联系，从而鉴定候选状态以测试细胞生理差异是否伴随突变获得改变。
空间解析基因组和转录组分析同样揭示遗传祖先和细胞表型可在同一肿瘤内区域组织。在肝细胞癌中，空间采样肿瘤区域的系统地理分析鉴定了具有 substantial基因型和转录组差异的块状区域；在肿瘤子集中，不同转录组亚型共存于分离空间块中，与区域分歧演化轨迹一致。此类发现表明空间不同细胞程序可与遗传不同肿瘤群体共存，提供框架询问局部微环境或生理状态是否与突变过程的相应差异相关。
空间转录组数据还可用于直接重建基因组演化。Ma等人开发了一种从空间解析转录组数据推断等位基因特异性拷贝数改变和肿瘤系统地理的方法，鉴定了仅从表达测量不明显的拷贝中性杂合性丢失、镜像亚克隆拷贝数改变和空间分离演化分支。这种分子状态、基因型和物理位置的整合说明空间多组学分析如何区分区域细胞构型和克隆祖先并提名特定肿瘤区域进行状态依赖性突变产生的后续测试。
总之，这些研究表明整合空间、谱系解析和多组学方法可鉴定已有细胞程序、重建克隆轨迹并映射肿瘤空间中的遗传和表型异质性。它们本身不确立特定细胞状态产生了该区域或谱系内观察到的突变。因此，其对动态突变器状态框架的主要价值是鉴定候选细胞构型、定义其空间和克隆背景并产生实验可检验假设，随后可通过前瞻性突变测量和扰动评估。
9.7 测试突变器状态的时间行为
一旦状态依赖性突变获得已证明，候选状态的时间特性可实验测试。
移除起始刺激可确定升高的突变活性是否可逆。反复暴露可测试反应是否在相同或相关扰动下复发。起始条件撤回后突变获得持续升高可支持持续性。
稳定化状态需要更强证据。持久表观遗传或遗传强化、对原始刺激依赖性降低或可逆性丧失可表明最初背景依赖性构型已变得日益自我维持。
这些结果应解释为时间行为而非 obligatory生物类别。其其实验价值在于确定突变能力是否随定义细胞状态的历史、持续时间、复发或撤回可预测地变化。
9.8 确立动态突变器状态的实验标准
当可重复细胞构型可在突变累积之前定义、与突变加工的机制相关改变相联系并证明先于新获得突变的可测量变化时，动态突变器状态的实验支持最强。
基因组结果应相对于明确界定的比较物量化，同时考虑细胞分裂、差异存活、克隆竞争和已有基因组异质性。当候选状态或其机制介质的操纵改变后续突变获得时，受控扰动加强因果归因。当扰动过程恢复减少或逆转突变效应时，挽救或逆转提供额外支持。
因此，最严格的实验序列是：状态定义→时间优先→机制联系→受控扰动→前瞻性突变测量→细胞分裂和选择标准化→逆转或挽救→独立验证。
没有单一实验平台可能满足每个标准。人类肿瘤提供生物学相关性和演化复杂性但实验控制有限，而模型系统允许因果扰动但生理复杂性降低。因此，跨互补系统的汇聚证据比任何个体方法更具信息性。
主要实验目标是确定细胞构型变化是否前瞻性改变新遗传变异的生产。证明该关系将为动态突变器状态提供直接支持并确立将细胞状态动力学与突变产生相联系的可证伪基础。
可用于鉴定、重建和因果测试动态突变器状态的互补实验策略总结于表3。
[表3：鉴定和测试动态突变器状态的实验策略。横断面肿瘤基因组测序和突变特征分析：累积突变负荷、突变谱系、突变特征、克隆结构——低至中等时间分辨率；主要回顾性——无匹配早期参照样本时区分新获得突变能力有限——因果推断能力低——与人类肿瘤直接相关；重建历史突变过程——突变产生时细胞状态通常未知；特征为推断性。配对或纵向肿瘤测序：定义采样点之间出现的基因组改变——中至高取决于采样频率——基线测序足够灵敏时中至高——中等——提供时间顺序并可鉴定治疗后或进展相关变化——采样间隔可长；空间异质性和未检测已有变异仍为混杂因素。前瞻性突变累积与全基因组测序：受控条件下突变率、累积、谱系和结构变化——高——起始群体充分表征时高——与受控扰动结合时高——直接测量新获得突变；可按时间或细胞分裂标准化——实验选择、培养适应和模型特异性效应可扭曲测量突变累积。单细胞DNA测序：细胞解析基因组异质性和分支特异性突变——中等；纵向设计可行时更高——中等——单独低至中等——解析亚克隆多样性和稀有谱系——等位基因脱落、扩增伪影、覆盖不均、成本和灵敏度有限。谱系追踪和克隆条形码：扰动后细胞祖先、克隆动力学、存活和扩增——高——与基因组测序整合时高——受控系统中高——区分新变异出现与已有谱系扩增——条形码本身不鉴定突变产生机制；需要与分子/基因组数据整合。联合基因组和状态解析单细胞谱分析：谱系、基因组改变、转录组或表观遗传状态之间关系——前瞻性设计时高——中至高——中至高——直接以细胞分辨率连接细胞构型和基因组演化——技术复杂性、覆盖限制和重建不确定性。类器官和患者来源实验模型：谱系和基因型特异性情境中状态依赖性反应和突变获得——连续采样时高——定义基线和纵向测序时高——受控扰动时高——允许扰动、挽救、可逆性和背景特异性测试——免疫、血管、基质和系统肿瘤环境的不完全代表。体内肿瘤模型：多细胞和生理肿瘤条件下突变获得——中至高取决于采样设计——中至高——遗传或药理学控制时高——更大生理复杂性和微环境相关性——纵向采样更困难；选择和群体复杂性使突变率测量复杂化。空间基因组和多组学谱分析：区域细胞状态、微环境背景、克隆结构和突变分布——主要空间；无连续采样时时间分辨率通常有限——有限至中等——单独低——将局部肿瘤条件与区域基因组模式联系——空间关联本身不确立局部状态产生了突变。系统发育和克隆重建：肿瘤演化中突变和突变过程的相对顺序——回顾性相对时机——中等——低至中等——重建演化分支和历史突变活性变化——通常不能直接鉴定突变出现时存在的细胞状态。基因组和多组学数据的计算整合：候选状态转变、网络关系、突变过程关联、预测模型——可变；通常推断——间接——单独低——整合高维人类数据并产生实验可检验假设——关联和潜在状态需要前瞻性实验验证。扰动与逆转或挽救：突变获得对候选状态或机制介质的依赖性——高——与前瞻性测序耦合时高——非常高——直接测试必要性、可逆性和机制因果——需要实验可处理系统和足够特异于拟议机制的干预。]
确立动态突变器状态所需的实验序列以及突变产生过程可被治疗拦截的潜在点整合于图5。
[图5：突变器状态的实验鉴定和治疗拦截。确立动态突变器状态需要前瞻性证明定义细胞构型先于并改变新突变获得。严格测试包括明确参照状态、纵向突变测量、已有变异和选择控制、细胞分裂标准化、受控扰动、逆转或挽救以及独立验证。一旦因果支持，潜在干预可阻止状态进入、阻断突变介质、减少易感底物或恢复忠实基因组加工。抗突变活性需要减少新突变获得，应与单独肿瘤细胞杀伤区分。]
10 靶向突变产生过程与未来方向
突变能力的变化提出癌症治疗不仅可靶向肿瘤细胞活力还可靶向支持后续演化的新遗传多样性产生的可能性。因此，抑制突变产生过程将针对不同于肿瘤负荷的生物学变量：可用于后续选择的新变异供给。
潜在治疗靶点在证据支持、选择性和可处理性方面差异显著。关键终点不是通路调节本身，而是新获得基因组变异的可证明减少。
10.1 代谢、线粒体和氧化还原拦截
当代谢和线粒体过程与改变突变获得的定义肿瘤特异性异常因果联系时，提供候选干预点。潜在策略包括校正核苷酸失衡、减少病理性氧化或线粒体应激以及中断代谢物依赖性基因组维持损害。
治疗效应可能背景依赖。广泛抑制活性氧不太可能提供通用抗突变策略，因为氧化还原信号促进正常细胞功能、治疗反应以及在某些情境中的肿瘤细胞杀伤。更有希望的机会可能源于维持异常核苷酸池、持续氧化损伤或促突变线粒体信号的肿瘤选择性依赖。
干预还可产生抵消效应。限制核苷酸合成可抑制增殖同时加剧存活细胞中的复制压力。因此，抗突变活性应通过减少后续突变获得证明而非从代谢抑制或肿瘤生长抑制推断。
10.2 复制相关通路
复制相关突变为治疗拦截提供几个候选点，包括跨损伤合成、易错重启、复制压力耐受和选定复制叉加工通路。
减少对突变性损伤旁路或不准确复制重启的依赖可减少复制相关突变的固定。然而，许多这些通路还保护应激复制叉或保存细胞活力。因此，其抑制可在将存活细胞重定向至具有不同突变后果的替代DNA加工通路的同时增加肿瘤细胞杀伤。
相关治疗终点是对存活、总突变获得和突变谱系的联合效应。不应假定抑制个体复制相关通路减少基因组多样化，除非还考虑代偿加工途径。
10.3 APOBEC与酶促突变
APOBEC家族胞苷脱氨酶提供相对直接靶点，因为其酶活性可在易感ssDNA底物中产生序列改变。APOBEC相关突变已在选定癌症中涉及持续基因组多样化和治疗抵抗。
潜在策略包括直接酶抑制、减少病理性APOBEC表达、限制易感底物可用性或中断维持异常酶活性的上游信号。治疗效用将取决于足够选择性以抑制肿瘤相关突变同时保存生理抗病毒和免疫功能。
减少APOBEC表达或减弱APOBEC相关特征本身不确立突变产生的广泛抑制。相关终点是归因于APOBEC活性的新获得基因组变异的纵向减少，同时评估其他突变过程是否代偿。
10.4 炎症、染色质和转录相关机会
当特定改变可与突变获得而非仅通路激活相联系时，炎症、转录和染色质调控过程可提供额外治疗机会。
候选干预包括选择性抑制促突变炎症信号、恢复RNA-DNA杂交解析和调节维持突变DNA加工的染色质调控异常。此类策略需要特别选择性，因为相同通路促进免疫监视、分化、转录控制、DNA修复和正常应激反应。
因此，最强治疗候选将是定义扰动减少机制相关突变产生来源而不产生代偿基因组不稳定性或不可接受生理功能破坏的候选。直接证据最终应由新突变获得的减少而非仅通路正常化组成。
10.5 结合肿瘤细胞杀伤与未来多样化抑制
肿瘤细胞杀伤和突变供给抑制靶向肿瘤演化的不同组成部分。细胞毒性和通路导向治疗减少群体大小并施加选择压力，而抑制突变产生过程将减少可用于后续选择的新遗传变异的生产。
结合这些效应可减少存活肿瘤细胞数量及其产生适应多样性的能力。这在残留疾病中可能特别相关，其中存活群体在持续选择压力下并可持续后续复发。
因此，此类组合的益处应通过即时和延迟结局评估。相关终点包括肿瘤反应、新变异获得减少、亚克隆多样化减弱、基因组分歧减慢和抵抗相关改变出现减少。
10.6 代偿突变过程与治疗权衡
突变产生机制在互联网络中运作，抑制一个过程可重新分布突变负荷而非消除它。抑制跨损伤合成可改变修复通路使用，调节氧化还原应激可改变DNA损伤加工，抑制APOBEC活性可使其他突变过程不受影响。
代偿突变使全基因组测量至关重要。减少一种特征性突变谱系的干预如果替代通路保持活跃或变得更突出，对总突变获得可能影响甚微。
治疗选择性同样重要。基因组维持、炎症、代谢和应激反应通路在正常组织中需要。因此，突变抑制干预的可行性将取决于肿瘤特异性依赖、通路冗余、治疗时机、耐受性以及抑制一个过程产生更有害替代形式基因组损伤的可能性。
10.7 抗突变治疗活性的证据阈值
氧化应激、DNA损伤标志物、复制压力或突变酶表达的减少不确立突变产生的抑制。直接证据需要新获得基因组改变的可测量减少。
最强支持将证明干预修饰定义突变产生过程并随后在考虑增殖、存活和克隆选择差异后减少突变率、突变累积或预测突变谱系。
纵向分析特别重要，因为突变获得的适度减少可对肿瘤负荷产生有限即时效应但对后期多样化和抵抗产生 substantial后果。因此，抗突变活性应作为独立治疗属性评估而非从细胞毒性或通路抑制推断。
10.8 时间和转化优先事项
突变抑制策略的转化需要前瞻性鉴定在残留疾病、治疗适应和其他演化重要间隔期间保持活跃的突变过程。其时间活性、肿瘤特异性、对遗传背景的依赖和对突变获得的定量贡献必须在干预可优先化之前解析。
时机可能关键。一些突变产生过程可能需要在治疗相关窗口期间短暂干预，而其他可能需要持续或反复抑制。时间谱分析可因此帮助确定抗突变干预何时最可能改变后续肿瘤演化而不重新定义动态突变器状态本身的时间行为。
临床评估还将需要肿瘤缩小之外的终点。连续基因组谱分析、循环肿瘤DNA分析和其他纵向方法可帮助确定干预是否减少新变异出现、减慢基因组分歧或延迟抵抗发展。
10.9 动态突变器状态框架的可检验预测
该框架产生五个实验可检验预测。
定义细胞状态应先于突变获得的测量变化。
移除因果突变可诱导状态应减少后续突变累积。
反复应激应在易感肿瘤群体中产生反复突变活性升高发作。
不同突变状态构型应产生至少部分可区分的突变模式。
抑制突变产生过程应减少后期基因组多样化，即使即时肿瘤细胞杀伤有限。此效应应可检测为亚克隆多样化减少、抵抗相关突变获得或基因组分歧，尽管短期细胞毒性适度。
总之，这些预测提供实验可分离标准，用于测试状态依赖性突变产生是否促成癌症演化以及治疗抑制突变供给是否可改变其后续轨迹。
11 结论
癌症中的突变产生不能仅归因于基因组维持通路的组成性缺陷。细胞内在和背景依赖过程还可修饰新突变获得的概率、速率或谱系，尽管因果和时间证据强度在各生物情境之间差异显著。
因此，区分突变产生的真实变化与DNA损伤、基因组不稳定性、通路激活、累积突变负荷和克隆选择至关重要。最强证据将定义细胞构型与突变加工的机制相关改变以及随后新获得基因组变异的可测量变化相联系。
确定肿瘤细胞何时和在何种条件下进入动态突变器状态可阐明癌症演化期间基因组多样性如何产生。其实验解析还可能鉴定限制促成瘤内异质性、治疗抵抗、复发和疾病进展的演化能力的机会。
