基于新城疫病毒载体表达嵌合镶嵌HA与三拷贝M2e的重组疫苗对H9N2禽流感病毒提供广谱早期保护

《Frontiers in Immunology》：Recombinant NDV-vectored vaccine expressing mosaic HA and M2e confers broad and early protection against H9N2 avian influenza virus

　　

摘要：开发一种通用型H9N2禽流感疫苗对于减少家禽业疾病发生和经济损失至关重要。在本研究中，研究人员基于新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）无毒株TS09-C，开发了一种重组疫苗rTS-mH9-3M2e，该疫苗包含一个嵌合镶嵌H9血凝素（hemagglutinin, HA）和三拷贝H9N2禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）M2e。1日龄鸡接种rTS-mH9-3M2e后，诱导了针对H9N2 AIV的广泛中和抗体活性，有效降低了病毒载量和病毒脱落，并减轻了临床症状和组织损伤。此外，rTS-mH9-3M2e能够诱导针对异源亚型AIV H3N2的交叉中和反应，并提供针对H3N2 AIV的交叉保护。当rTS-mH9-3M2e作为胚内（in ovo）疫苗使用时，与孵化后免疫相比，它提供了更早的对NDV和H9N2 AIV的保护。rTS-mH9-3M2e胚内免疫显著增加了7日龄鸡脾脏CD8+T细胞的水平，并对H9N2 AIV提供了100%的保护，对NDV强毒株提供了80%的保护。这些结果表明，rTS-mH9-3M2e是一种有前景的候选疫苗，可用于开发广谱H9N2禽流感疫苗和胚内疫苗。

一、研究背景与目的

禽流感在全球范围内对动物和公共卫生构成威胁，并造成严重的经济损失。其中，H9N2亚型禽流感病毒（AIV）被归类为低致病性病毒，却是全球家禽中最流行的AIV，并且已被确定为感染人类的多种亚型流感病毒的基因供体，如H3N8、H5N1和H7N9。在中国，虽然全病毒灭活疫苗已被用于控制H9N2 AIV，但免疫鸡群中仍频繁分离到病毒。这是因为灭活疫苗主要依赖诱导针对血凝素（HA）头部表位的中和抗体来介导免疫保护，而在抗体压力下，H9N2 AIV会发生抗原漂移，导致免疫逃逸突变，使疫苗保护效力丧失。因此，开发一种通用型H9N2 AIV疫苗迫在眉睫。

为解决上述问题，研究人员开展本研究，旨在开发一种基于新城疫病毒（NDV）载体的重组活疫苗，通过优化抗原设计（引入镶嵌HA和保守的M2e蛋白）和选择合适的递送平台（NDV载体及胚内免疫途径），以实现对H9N2 AIV的广谱保护和早期免疫。

二、研究方法

本研究采用的主要关键技术方法包括：

1. 1.
   镶嵌抗原设计：从GISAID数据库下载15,060条H9 HA序列，剔除不完整序列后剩余10,785条，提交至Mosaic Vaccine Designer软件，获得镶嵌H9 HA序列。
2. 2.
   重组病毒构建与拯救：以NDV无毒株TS09-C的感染性cDNA克隆（pTS09-C）为骨架，将镶嵌H9 HA（其跨膜区和胞质区替换为NDV F蛋白相应区域）插入P基因和M基因之间，并将三拷贝H9N2 AIV M2e（3M2e）融合至HN基因C端，通过多重重叠PCR和同源重组构建全长cDNA克隆，共转染MAV-T7感染的BHK-21细胞拯救重组病毒rTS-mH9-3M2e和rTS-mH9。
3. 3.
   动物实验：使用SPF来航鸡胚胎和雏鸡进行免疫攻毒保护试验。设置三个独立实验：实验一评估1日龄鸡免疫后对不同H9N2 AIV的广谱保护；实验二评估对异源亚型H3N2 AIV的交叉保护；实验三比较胚内免疫与孵化后免疫的早期保护效果。攻毒毒株包括NDV强毒F48E9株、H9N2 AIV DY0602株（h9.4.2.5分支）、HB-01株（h9.4.2.6分支）以及H3N2 AIV SD株。
4. 4.
   免疫学检测：采用血凝抑制（HI）试验检测NDV和H9特异性抗体，ELISA检测M2e特异性抗体，微量中和试验检测中和抗体滴度，流式细胞术分析脾脏CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞比例。
5. 5.
   病理学和病毒学评估：通过苏木精-伊红（HE）染色进行组织病理学检查，RT-qPCR检测肺脏、气管及咽喉拭子、泄殖腔拭子中的病毒载量。

三、研究结果

1. 镶嵌H9 HA的特征分析与重组病毒rTS-mH9-3M2e的获取

系统发育和同源性分析显示，镶嵌H9 HA属于h9.4.2.5分支，与该分支代表株A/Chicken/Guang Xi/55/2005的同源性高达97.1%，其构象与h9.4.2.5和h9.4.2.6分支的代表株相似，且包含更多的T细胞和B细胞表位。成功拯救的重组病毒rTS-mH9-3M2e和rTS-mH9表现出与亲本株TS09-C相似的生物学特性，并成功表达了镶嵌H9 HA和3M2e蛋白。

2. rTS-mH9-3M2e诱导针对不同H9N2 AIV的广泛免疫反应

1日龄鸡分别接种rTS-mH9-3M2e、rTS-mH9和TS09-C后，各组均能诱导ND特异性HI抗体，且无显著差异。rTS-mH9-3M2e诱导的H9特异性HI抗体滴度高于rTS-mH9，但差异不显著。仅有rTS-mH9-3M2e组诱导了M2e特异性抗体。两种重组疫苗均能诱导针对来自h9.4.2.5分支（DY0602、JS1002株）和h9.4.2.6分支（HB-01株）三种H9N2 AIV的中和抗体，且rTS-mH9-3M2e组的抗体滴度略高于rTS-mH9组。

3. 重组疫苗提供针对不同H9N2 AIV的广谱保护

攻毒试验表明，所有疫苗接种组（rTS-mH9-3M2e、rTS-mH9、TS09-C）对NDV强毒株F48E9的攻击均提供100%保护。针对H9N2 AIV DY0602和HB-01株的攻毒，rTS-mH9-3M2e和rTS-mH9组鸡只均未出现临床症状，而TS09-C和PBS组则出现体重减轻、呼吸窘迫等症状。组织病理学检查发现，PBS组鸡只肺脏和气管出现严重病变，而两个疫苗组未见明显病变。疫苗组鸡只肺脏和气管的病毒载量显著低于PBS组。更重要的是，rTS-mH9-3M2e组在攻毒后5天的咽喉和泄殖腔拭子病毒载量显著低于rTS-mH9组，表明其在抑制病毒脱落方面更具优势。

4. rTS-mH9-3M2e提供针对H3N2 AIV的异源交叉保护

1日龄鸡接种rTS-mH9-3M2e后，血清中针对H3N2 SD株的中和抗体滴度（3.4 ± 0.49 log₂）显著高于PBS组。攻毒后，疫苗组鸡只的平均临床评分更低，病程更短。组织病理学检查显示，疫苗组鸡只肺脏（淋巴细胞浸润）和气管（纤毛丢失）的病变比PBS组（肺出血、淋巴细胞浸润；气管纤毛丢失、黏膜下水肿）更轻微。疫苗组肺脏和气管的病毒载量显著低于PBS组。虽然疫苗未能降低病毒脱落的阳性率，但能显著降低咽喉和泄殖腔拭子中的病毒载量。

5. rTS-mH9-3M2e作为胚内疫苗提供针对NDV和H9N2 AIV的早期保护

胚内接种rTS-mH9-3M2e（18日龄鸡胚）与孵化后接种（1日龄雏鸡）相比，胚内接种组鸡胚的孵化率为93.3%，表明疫苗安全。在NDV攻毒试验中，胚内接种组在3、7、14日龄攻毒时的存活率分别为40%、80%和100%，远高于孵化后接种组的0%、20%和40%。在H9N2 AIV攻毒试验中，胚内接种组在7日龄攻毒时已无临床症状，而孵化后接种组仍有70%的鸡只出现症状。胚内接种组在7日和14日龄攻毒时，肺脏和气管的病毒载量均显著低于孵化后接种组。

6. rTS-mH9-3M2e作为胚内疫苗诱导更早的细胞免疫应答

在3和7日龄时，胚内接种组与孵化后接种组的ND特异性HI和H9特异性HI抗体水平无显著差异。在细胞免疫方面，两组CD3⁺CD4⁺T细胞水平也无显著差异。然而，在7日龄时，胚内接种组脾脏中的CD3⁺CD8⁺T细胞水平显著高于孵化后接种组，这表明胚内免疫诱导了更早的CD8⁺T细胞免疫应答。

四、讨论与结论

讨论总结：传统的禽流感疫苗需定期更新以应对抗原漂移，而研发通用疫苗的需求迫切。本研究表明，基于镶嵌HA和M2e设计的重组疫苗rTS-mH9-3M2e能够诱导针对不同分支H9N2 AIV的广泛中和活性和保护作用，并能有效减少病毒脱落，优于仅含镶嵌HA的rTS-mH9疫苗。该疫苗还能提供针对异源亚型H3N2 AIV的交叉保护，这可能归因于镶嵌抗原最大化覆盖T细胞表位以及高度保守的M2e蛋白诱导的细胞免疫应答。此外，作为胚内疫苗，rTS-mH9-3M2e能在新生雏鸡免疫窗口期提供更早的保护，这种早期保护独立于体液免疫，而与胚内免疫诱导的更高水平的CD8⁺T细胞密切相关。研究的一个局限性是尚未深入探索胚内免疫诱导早期CD8⁺T细胞增殖的具体机制。

研究结论：研究人员开发了一种基于NDV载体的重组疫苗rTS-mH9-3M2e，该疫苗可提供针对同源和异源亚型AIV的交叉保护。此外，rTS-mH9-3M2e作为胚内疫苗能够诱导显著的CD8⁺T细胞免疫应答，并为雏鸡提供针对NDV强毒和H9N2 AIV的早期免疫保护。未来将进一步研究rTS-mH9-3M2e作为胚内疫苗如何诱导早期的CD8⁺T细胞免疫。