《Frontiers in Oncology》：Targeting autocrine CCL2 signaling reveals oncogenic networks and prognostic biomarkers in medulloblastoma
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背景：CCL2是免疫细胞向肿瘤微环境（TME）募集的重要介质，然而其在髓母细胞瘤中的自分泌作用仍知之甚少。本研究探讨了CCL2敲除对髓母细胞瘤细胞分子及预后方面的影响。方法：对HTB-186髓母细胞瘤细胞中CCL2的表达进行表征，并利用CRISPR/Cas9技
背景：CCL2是免疫细胞向肿瘤微环境（TME）募集的重要介质，然而其在髓母细胞瘤中的自分泌作用仍知之甚少。本研究探讨了CCL2敲除对髓母细胞瘤细胞分子及预后方面的影响。方法：对HTB-186髓母细胞瘤细胞中CCL2的表达进行表征，并利用CRISPR/Cas9技术构建CCL2敲除（KO）细胞。通过RNA测序评估转录组改变，随后进行差异基因表达、KEGG通路和基因本体分析。通过细胞因子和蛋白质分析验证选定信号通路。利用Kaplan-Meier和多因素Cox比例风险分析在Cavalli髓母细胞瘤队列（n = 488）中评估差异表达基因的预后意义。结果：HTB-186细胞高表达CCL2，约40%的细胞表达CCL2受体CCR2，支持自分泌信号的存在。CCL2敲除导致2 284个差异表达基因，并显著改变涉及PI3K/Akt、NF-κB、JAK/STAT、cAMP和Hippo信号的通路。这些转录组发现通过IL-6产生减少以及Akt、NF-κB、CREB和YAP激活改变得到证实。生存分析鉴定出四个在CCL2敲除后上调的基因（KSR2、DLG4、DGKA和PLD2）与改善的总生存期相关，而四个下调基因（HSPA8、MYC、CCND1和ETS2）与较差生存期相关。在调整年龄、性别、转移状态、组织学和分子亚组后，这些关联仍然显著。结论：研究结果表明，自分泌CCL2信号调控髓母细胞瘤中多条致癌通路，并促进与肿瘤生长、存活和不良临床结局相关的转录程序。这些结果将CCL2确定为潜在治疗靶点，并突出CCL2调控的基因特征作为髓母细胞瘤候选预后生物标志物。
研究背景：脑肿瘤是儿童及青少年和年轻成年男性癌症相关死亡的首要原因，也是青少年和年轻成年女性癌症相关死亡的第二大原因。髓母细胞瘤是儿童中最常见的恶性胚胎性脑肿瘤，这些高度增殖性肿瘤发生于小脑，导致小脑功能障碍，最常在6至8岁之间被诊断。约三分之一的患者在诊断时即表现为转移性疾病，主要通过脑脊液沿软脑膜播散，转移性疾病与显著较差的无进展生存期（PFS）相关，并且仍然是不良临床结局的主要决定因素。髓母细胞瘤包括四个分子和临床上截然不同的亚组：WNT、SHH、Group 3和Group 4。当前标准治疗包括最大程度安全手术切除，随后进行颅脊髓照射（适当时包括质子放疗）和辅助铂类化疗。尽管多模式治疗显著改善了生存，但疾病复发仍是主要临床挑战并与不良结局相关。因此，迫切需要为复发或治疗抵抗的髓母细胞瘤患者开发更有效的治疗策略。CCL2是一种关键炎症趋化因子，调控肿瘤微环境（TME）中免疫细胞特别是髓系细胞的募集。CCL2在脑肿瘤中表达升高，并与髓母细胞瘤的转移播散和疾病进展相关，提示CCL2信号可能促进肿瘤侵袭性。虽然CCL2的旁分泌效应已被充分表征，但关于该趋化因子对髓母细胞瘤的自分泌效应知之甚少。本研究旨在通过对HTB-186髓母细胞瘤细胞（SHH亚组）进行CCL2敲除并进行转录组RNA测序（RNA-seq），鉴定由自分泌CCL2信号驱动的可操作靶点和通路，并利用Cavalli队列评估CCL2敲除相关基因在髓母细胞瘤中的预后相关性。
研究人员开展的研究及结论：研究人员利用CRISPR/Cas9技术在HTB-186髓母细胞瘤细胞中敲除CCL2，通过RNA-seq进行转录组分析，鉴定出2 284个差异表达基因，涉及PI3K/Akt、NF-κB、JAK/STAT、cAMP和Hippo等多条信号通路。通过细胞因子和蛋白质分析验证了这些通路改变，发现IL-6产生减少以及Akt、NF-κB、CREB和YAP激活改变。利用Cavalli髓母细胞瘤队列（n = 488）进行生存分析，鉴定出8个与总生存期显著相关的基因：四个上调基因（KSR2、DLG4、DGKA、PLD2）与改善的生存期相关，四个下调基因（HSPA8、MYC、CCND1、ETS2）与较差的生存期相关。在调整年龄、性别、转移状态、组织学和分子亚组后这些关联仍然显著。研究结论表明，自分泌CCL2信号调控髓母细胞瘤中多条致癌通路，促进与肿瘤生长、存活和不良临床结局相关的转录程序，将CCL2确定为潜在治疗靶点，并突出CCL2调控的基因特征作为髓母细胞瘤候选预后生物标志物。重要意义在于识别了新的可成药候选靶点和通路，可能作为儿童髓母细胞瘤患者的新治疗靶点。
关键技术方法：研究使用人髓母细胞瘤细胞系HTB-186（Daoy），通过CRISPR/Cas9技术构建CCL2敲除细胞。采用RNA测序进行转录组分析，利用DESeq2进行差异基因表达分析，clusterProfiler进行KEGG和GO富集分析。通过ELISA和细胞因子阵列分析验证细胞因子水平，免疫印迹（Western blot）验证信号通路蛋白激活状态。利用Cavalli髓母细胞瘤公共队列（n = 488）进行Kaplan-Meier生存分析和多因素Cox比例风险分析。此外，使用638例髓母细胞瘤患者样本队列评估CCL2在各亚组中的表达差异。
研究结果：
CCL2在HTB-186髓母细胞瘤细胞中的表达：通过细胞因子阵列鉴定CCL2为HTB-186细胞中表达最高的趋化因子，ELISA证实这些细胞表达极高水平的CCL2。流式细胞术检测发现至少40%的细胞高水平表达CCL2受体CCR2，支持自分泌信号的存在。利用CRISPR技术成功敲除CCL2，并通过ELISA确认完全基因敲除。
CCL2 KO髓母细胞瘤细胞的基因表达分析：对HTB-186Scr和CCL2 KO细胞进行基因表达谱分析，层次聚类显示CCL2 KO细胞具有独特的转录组谱，共鉴定出2 284个差异表达基因，包括1 390个下调转录本和894个上调转录本。
差异表达基因的KEGG注释和富集生物学过程分析：KEGG通路分析显示，与CCL2缺失相关的通路包括"细胞因子-细胞因子受体相互作用"和"PI3K-Akt信号通路"。GO分析显示上调基因类别主要为"趋化性"、"信号受体活性"和"受体配体活性"，下调基因类别主要为"系统过程调控"、"细胞外基质"和"外部包封结构"。研究人员绘制了PI3K-Akt、NF-κB、JAK/STAT、cAMP和Hippo信号通路的基因变化瀑布图。
HTB-186 CCL2 KO细胞中选定信号通路的验证：IL-6在CCL2 KO细胞培养上清中显著降低，证实了PI3K/Akt和JAK/STAT信号通路相关的mRNA水平结果。通过分析通路关键介导因子（P-Akt、P-NF-κB、P-CREB和P-YAP）的激活状态，证实了PI3K/Akt、NF-κB、cAMP和Hippo信号通路在CCL2 KO细胞中发生改变。回补实验表明，向CCL2 KO细胞添加CCL2可逆转CREB激活。
选定差异表达基因的Kaplan-Meier生存曲线：在638例髓母细胞瘤患者队列中分析CCL2表达，发现CCL2在所有髓母细胞瘤亚组中显著相关。Kaplan-Meier分析显示，CCL2 KO细胞中四个上调基因（KSR2、DLG4、DGKA、PLD2）的高表达与改善的总生存期相关；四个下调基因（HSPA8、MYC、CCND1、ETS2）的高表达与较差的总生存期相关。
差异表达基因的Cox比例风险分析：Cox比例风险模型评估在调整年龄组、性别、转移状态、LCA组织学和分子亚组后预后模式是否仍然存在。上调基因PLD2、DGKA、DLG4和KSR2均显示有利的预后关联（HR<1），下调基因HSPA8、MYC、CCND1和ETS2均显示不良预后关联（HR>1）。构建的8基因风险评分在完整分析队列中显示清晰的预后分层，调整协变量后，较高连续风险评分与较差总生存期显著相关（HR = 1.90，95% CI：1.54–2.35，p< 0.001）。高风险组患者总生存期显著差于低风险组（HR = 2.82，95% CI：1.85–4.30，p< 0.001）。
讨论部分总结：本研究探讨了CCL2在髓母细胞瘤中的自分泌信号效应。CCL2在脑肿瘤中频繁过表达，在招募髓系细胞至TME中起关键作用，这些效应主要归因于其旁分泌信号功能。尽管有大量证据支持CCL2的旁分泌功能，但对其在髓母细胞瘤中的自分泌效应了解相对较少。CCL2敲除细胞的转录组分析显示，自分泌CCL2信号中断改变了涉及多条经典信号通路（包括PI3K/Akt、NF-κB、JAK/STAT、cAMP和Hippo信号）的基因表达，这些转录组发现在蛋白质水平得到证实。研究结果表明CCL2可能调控多条与髓母细胞瘤进展相关的信号通路：CCL2缺失降低PI3K/Akt信号，可能限制肿瘤细胞增殖、转移和癌症干细胞样细胞维持，同时抑制NF-κB信号；CCL2敲除增加cAMP信号，与肿瘤抑制通路激活增强一致；CCL2缺失还激活Hippo通路，表现为YAP磷酸化增加。总体而言，CCL2作为髓母细胞瘤中多条致癌信号网络的关键调控因子，通过维持促肿瘤信号通路同时抑制具有肿瘤抑制功能的通路来促进髓母细胞瘤进展。靶向CCL2可能代表一种破坏多种疾病促进机制的治疗策略。在Cavalli队列中评估CCL2敲除相关基因的预后相关性，发现四个上调基因（KSR2、DLG4、DGKA、PLD2）和四个下调基因（HSPA8、MYC、CCND1、ETS2）与总生存期相关。两个基因集之间一致但相反的预后关联提示这些转录变化反映了影响髓母细胞瘤进展的生物学上不同的过程。在调整已建立的临床和分子预后因素后，这些关联仍然明显。研究局限性包括：分析基于公共队列的回顾性生存建模，发现应解释为预后关联而非直接因果证据；转录组分析仅使用一种SHH髓母细胞瘤细胞系。未来研究将在多种髓母细胞瘤细胞类型中验证这些基因表达和信号通路变化。
研究结论翻译：总之，研究结果表明CCL2协调髓母细胞瘤中涉及增殖、存活、应激适应、疾病进展和患者结局的多种分子程序。靶向CCL2的自分泌效应因此代表一种有吸引力的髓母细胞瘤治疗策略，特别是SHH亚型。
