《Frontiers in Endocrinology》：Molecular mechanisms underlying phenotypic overlap and AI-misclassification in rare bone diseases: Insights from SHOX-related signaling pathways in endochondral ossification
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罕见骨病（RBDs）的诊断因其异质性和罕见性而面临挑战。然而，正确且及时的诊断对患者获得最佳治疗结局至关重要。研究人员关注了Bone2Gene项目开发的两项人工智能（AI）方法，其目标是通过将手部X线片归入RBDs以支持诊断过程。研究人员注意到，多种RBDs被
罕见骨病（RBDs）的诊断因其异质性和罕见性而面临挑战。然而，正确且及时的诊断对患者获得最佳治疗结局至关重要。研究人员关注了Bone2Gene项目开发的两项人工智能（AI）方法，其目标是通过将手部X线片归入RBDs以支持诊断过程。研究人员注意到，多种RBDs被主要误分类为SHOX相关矮身材组。为寻找这一重叠的潜在遗传学解释，研究人员对软骨内成骨中SHOX相关信号及其与其他RBDs相关信号的关联进行了文献研究。研究发现，SHOX激活结构蛋白aggrecan（ACAN）的表达，并抑制FGFR3诱导的RAS/RAF/MAPK信号，分别显示出与ACAN相关生长障碍以及Hypochondroplasia和Achondroplasia的信号关联。此外，研究人员认为，SHOX相关矮身材的高度表型多样性也促成了与SHOX相关信号无直接联系的RBDs的误分类。总体而言，研究人员加深了对两种Bone2Gene方法中误分类发生的理解。结合基因检测，Bone2Gene可成为RBDs诊断过程中的有价值工具。
研究背景方面，已有研究对771种干扰软骨与骨生长的罕见骨病（RBDs）及552个相关基因进行了分类；RBDs占全部罕见病的5%，其罕见性与群体异质性使诊断面临挑战并可能被延迟。特发性矮身材（ISS）表型谱从重度到轻度不等，因缺乏综合征特征而不能视为特定诊断，若无基因检测指征，大量ISS病例的潜在突变难以被检出，从而妨碍RBDs的诊断与监测，并可能造成漏诊；而早期诊断对改善预后十分重要，诊断过程宜结合基因检测与临床表型评估。人工智能（AI）方法在罕见病诊断中已显示潜力，Face2Gene、GestaltMatcher、Eye2Gene等工具以及利用手部X线片区分Turner综合征（TS）与未患病者的研究均提供了依据；Bone2Gene同样基于临床常规获取的手部X线片开展RBDs诊断。除分类准确率外，上述AI工具在多大程度上混淆不同罕见病（常以混淆矩阵（CMs）呈现）可为这些疾病的表型相似性提供线索。本研究即考察两个初步Bone2Gene AI模型（端到端深度学习方法和基于定量形态学测量提取后行机器学习分析的方法）所得的CMs：两个分类器虽能较好地区分不同RBDs，但混淆呈现与基础RBD相关的特定模式，手部X线片主要被误分类为SHOX相关矮身材（SHOX-RSS）；两种独立方法误分类模式的相似性提示混淆源于部分RBDs的表型重叠。研究人员因此从遗传学角度分析SHOX-RSS预测的高变异性，在软骨内成骨框架下寻找SHOX相关信号与其他RBDs信号之间的分子联系。
研究结论方面，文献研究发现SHOX-RSS与其他RBDs之间存在若干直接分子联系：ACAN（ACAN-RGD）与FGFR3（ACH、HCH）是SHOX的直接靶点，可解释表型重叠；SHOX单倍剂量不足参与TS中所见矮身材；其他RBDs（NS、SRS）仅通过汇聚性生长相关信号（如RAS/RAF/MAPK信号）与SHOX相连，却仍被误分类为SHOX-RSS；SHOX-RSS与其他RBDs一样表型变异很大、涵盖轻至重度病例，特征不明显的手部X线片可能被错误分类为SHOX-RSS。大量RBDs underlying信号尚未被阐明，未识别的信号机制可能进一步促成表型重叠，这凸显了进一步研究RBDs分子病因及相关信号级联的重要性。Bone2Gene可作为有价值辅助手段整合进更大的诊断情境，借助常规拍摄的手部X线片为进一步的遗传与临床检查提供方向，从而可能加速RBDs诊断并改善治疗结局。其重要意义在于加深了对两种Bone2Gene方法中误分类发生的理解，并提示结合基因检测时Bone2Gene可成为RBDs诊断过程中的有价值工具。
关键技术方法方面，研究采用文献研究法，围绕软骨内成骨中SHOX相关信号及其他RBDs的分子背景与信号通路开展检索，经标题与摘要筛选、全文评阅并追溯参考文献，最终纳入80篇文献。AI分析方面，一是端到端深度学习方法，队列为来自936名个体的3,649张手部X线片、十个RBD组，本研究缩减为七个组，采用EfficientNet-B4骨干网络并以骨龄预测预训练权重初始化，将个体性别经稠密层嵌入后与图像特征拼接，经两个全连接层与softmax层输出十类，训练五次、每次按个体随机抽取约10%验证集，并按个体汇总预测（多数投票，平局以softmax概率之和最高者判定）；二是定量形态学测量方法，参考队列为1,454名健康个体的1,454张手部X线片（洛杉矶儿童医院公开数据集1,378张、德国马格德堡大学医院76张），疾病队列为七个诊断组349名患者的1,289张手部X线片，流程包括骨分割及人工复核校正、形态学测量、尺度不变特征生成、样条法Z分数标准化、One-vs-One/One-vs-Rest支持向量机训练与软投票元分类，采用10折患者层面分层交叉验证。统计学上对CMs各单元格行归一化比例以精确Clopper-Pearson法计算95%置信区间。
研究结果方面，在混淆矩阵部分，研究人员将Bolmer等观察的RBDs缩减为七个纳入分析，选择依据为文献研究中发现与SHOX相关信号有直接联系的RBDs（TS、ACAN-RGD、HCH、ACH），并纳入在原始方法中SHOX-RSS误分类比例较高的SRS与NS。端到端深度学习方法的平衡准确率为71.56%，定量形态学测量方法为67.3%。ACH在两种方法中分别有92%与93%被正确识别，表现最佳；其余RBDs正确分类率分别为18%至90%与43%至83%，其中ACAN-RGD最低（18%与43%），其次为SRS（60%与44%）。在定量形态学测量方法中，这两种RBDs的错误分类主要指向SHOX-RSS；在端到端深度学习方法中，ACAN-RGD亦如此，SRS误分类为SHOX-RSS的比例最高，NS达到相同比例。NS在两种方法中均主要表现为误分类为SHOX-RSS；TS在端到端深度学习方法中亦可见此现象。
在软骨内成骨中SHOX相关信号通路部分，软骨内成骨涉及TGF-?/BMP、FGF、WNT/?-catenin、Hedgehog与PTHrP、IGF、Notch、视黄酸及mTOR等信号，研究聚焦与SHOX相关并与其他RBDs信号相连的级联。SHOX经SOX9通路激活结构蛋白aggrecan表达方面，SHOX的靶点之一为由SOX5、SOX6与SOX9组成的“SOX-Trio”，该 trio 参与构建生长板软骨支架的多个信号通路，其直接靶点之一是激活ACAN；SHOX与SOX-Trio协同激活ACAN，SOX9对间充质细胞定向并执行软骨分化至关重要，可直接激活软骨细胞分化标志物并诱导SOX5与SOX6表达，SOX5、SOX6与SOX9共同激活软骨细胞分化程序。SOX9与骨形态发生蛋白信号方面，SOX9的表达与维持依赖骨形态发生蛋白（BMP）信号，后者通过影响多个级联促进各阶段软骨细胞增殖与分化，增强Indian Hedgehog（IHH）信号并阻碍FGF信号，还增强Runx2活性，Runx2自身亦诱导IHH表达，Runx2与SOX9均为软骨内成骨信号的中心枢纽。Indian Hedgehog与甲状旁腺相关肽信号方面，前肥大软骨细胞产生IHH配体，其与甲状旁腺相关肽（PTHrP）形成负反馈环路，对调控软骨细胞增殖与成熟至关重要；IHH驱动增殖软骨细胞向肥大软骨细胞分化，同时促进静息区软骨细胞表达PTHrP，后者通过维持软骨细胞增殖抑制该分化，远离静息区的软骨细胞不表达PTHrP并发生肥大。SHOX抑制FGFR3诱导的RAS/RAF/MAPK信号方面，成纤维细胞生长因子（FGFs）包含22种蛋白，FGFR3通过促进软骨细胞分化在软骨内成骨中起关键作用，其功能获得性（GoF）突变可导致HCH与ACH等RBDs，ACH为最常见RBDs之一，出生频率为1/15,000至1/25,000；SHOX通过直接结合FGFR3上游多个区域负调控FGFR3，该抑制对肢体发育至关重要，而Shox2在鸡模型中未改变Fgfr3表达；FGFR3在所有类型软骨细胞中强表达而在骨膜等其他肢体组织中缺如，其激活对软骨细胞增殖与分化至关重要的RAS/RAF/MAPK通路，故SHOX下调FGFR3抑制增殖并促进生长板软骨细胞分化，从而作为生长板发育的关键推进因素；此外FGFR3信号可能调控BMP信号以及IHH与PTHrP信号。NS与SRS中的IGF与RAS/RAF/MAPK信号方面，两者与SHOX信号的联系不如前述RBDs明确，但下游信号主要汇聚于RAS/RAF/MAPK信号，且两者的IGF信号均发生改变，IGF信号还与BMP及IHH信号交叉连接。NS由RAS/RAF/MAPK通路组成或调控基因的生殖系突变所致，PTPN11错义突变最常见、约占半数患者，其编码的SHP2是RAS/RAF/MAPK信号的关键调控因子；小鼠研究显示SHP2突变通过过度激活RAS/RAF/MAPK通路阻碍胰岛素样生长因子1（IGF1）产生，且SHP2突变损害RAS/RAF/MAPK依赖的软骨细胞分化，生长板长度减少主要因肥大区缩短、增殖区亦缩短。SRS为印记障碍，多数病例分子病因为印记IGF2低表达，其表达依赖亲本来源并受H19/IGF2基因间差异甲基化区（DMR）ICR1表观调控；未患病个体父源等位基因甲基化驱动IGF2表达而母源等位基因不甲基化则表达非编码转录本H19，SRS中父源等位基因低甲基化降低IGF2表达，IGF2是生长调控尤其胎儿期发育的关键蛋白，与IGF1一样可结合IGF1受体（IGF1R）并激活调控增殖与分化的RAS/RAF/MAPK及PI3K/AKT/mTOR等信号，小鼠Igf2突变导致生长缺陷；SRS第二常见分子病因为7号染色体母源单亲二体（mUPD7），见于5-10%患者，而H19/IGF2基因间DMR受累见于30-60%患者。生长板发育中相关SHOX信号级联方面，研究将已识别的信号级联（SOX9介导的ACAN激活、FGFR3与RAS/RAF/MAPK信号）整合进生长板时空发育，并展示相应基因在各生长板区域的表达以及多种RBDs中观察到的生长板改变。
讨论部分总结如下：RBDs诊断因高表型变异性和异质性发育表达而常被延误，AI工具可作为辅助诊断手段；研究人员考察了两种Bone2Gene模型将RBDs误分类为SHOX-RSS的现象，文献研究发现SHOX信号与若干其他RBDs信号之间的联系可能致其表型重叠并妨碍分类，而对另一些RBDs未发现直接信号联系，软骨内成骨信号整体高度复杂且多通路交叉。SHOX-RSS方面，其主要特征为缺乏表型-基因型相关性，高表型变异性和从轻度到重度（LMD）的广谱性及遗传异质性使其与其他RBDs区分困难，可促成两种矩阵中的误分类；部分SHOX-RSS特异特征如肢体中段比例失调或LWD中Madelung畸形在青春期较晚出现，RBDs骨骼表现可能直至骨骼成熟才出现或随时间逐渐减轻，提示年龄区分的重要性，女性SHOX单倍剂量不足者重度表型频率更高，可能与雌激素水平较高有关；SHOX突变是ISS最常见病因，ACAN与PTPN11突变亦较少见地存在，表型表达部分一致使相关RBDs重叠合理，由此产生的诊断挑战再次提出表型异常不明显时某些RBDs是否可能被漏检的问题。TS与SHOX方面，TS多因X染色体完全或部分缺失致PAR1区缺失而引起SHOX单倍剂量不足，手部X线片表型重叠可信，可解释CMs中TS与SHOX-RSS的重叠，端到端深度学习方法中确见TS主要误分类为SHOX-RSS，而定量形态学测量方法中未见，且TS在AI检测中总体表现良好（84%与83%）；与TS不同，LMD与LWD等SHOX-RSS表现为肢体中段变形，且SHOX单倍剂量不足不能解释TS全部骨异常，提示其他基因参与及潜在基因剂量效应，这些方面可能有助于AI区分TS表型。ACAN-RGD与SHOX方面，SHOX经SOX-Trio激活ACAN对aggrecan表达至关重要，两种CMs中ACAN-RGD误分类为SHOX-RSS的比例相对其他RBDs最高，端到端深度学习方法中仅18%被正确识别而55%被误分类为SHOX-RSS，定量形态学测量方法中43%被正确识别而38%被误分类为SHOX-RSS；两者高重叠可由其各自表型谱范围解释，Trigui等分析24例携带不同ACAN突变患者发现几乎所有患者为杂合突变、仅1例为纯合突变，纯合ACAN突变可致严重骨骼发育不良而杂合变异表型较轻、常 underlying ISS，提示表型表达谱广，且缺乏可靠的基因型-表型相关性凸显信号复杂性、常无清晰影像学征象而致表型模糊；ACAN与SHOX（经SOX-Trio）在生长板细胞外基质（ECM）组织尤其PHZ软骨细胞柱状结构中均起重要作用，两者均编码关键的细胞内和细胞外过程，通过构建和形成软骨支架共同促成健康骨结构和表型表达；Comel等病例报告描述一例同时携带致病性SHOX与ACAN变异的个体，其表型较仅携带其中一个变异的家系成员更重，提示该遗传信号通路存在叠加效应。HCH、ACH与SHOX方面，SHOX直接结合并抑制FGFR3，这是SHOX信号与导致HCH和ACH的FGFR3 GoF突变之间的核心联系，故SHOX单倍剂量不足应导致对FGFR3的抑制减弱，可能造成与HCH尤其相似的表型表达，HCH表型较ACH轻；然而两者在两种AI方法中正确分类率均高，ACH为所有组中最高（92%与93%），HCH为83%与76%；值得注意的是Hoffmann等在斑马鱼模型中发现shox敲低后鳍中相对fgfr3表达较野生型无显著变化，尽管可能由shox敲低效率降低所致，这或可解释HCH与ACH误分类为SHOX-RSS少于ACAN-RGD等其他RBDs；此外Madelung畸形、尺骨头突出及腕骨掌侧和尺侧偏斜（“金字塔构型”）是SHOX-RSS中中段发育不良的特征，而HCH与ACH通常表现为肢体近端变形，但这不影响本研究的形态学方法，因其仅观察指骨与掌骨；ACH因表型严重而独特可与其他RBDs良好区分，HCH与ACH的重叠可由较严重HCH与较轻ACH处于同一表型谱的一致性解释。SRS与NS方面，研究人员未发现SHOX信号与SRS或NS之间的直接分子联系；同时SRS在定量形态学测量方法中误分类为SHOX-RSS的比例最高（40%），在端到端深度学习方法中为第二高（20%），NS患者中21%在定量形态学测量方法中被误分类为SHOX-RSS；由于所有RBDs均影响软骨与骨生长这一相同生物学过程，涉及信号通路之间存在交叉连接是合理的，且信号汇聚于中心级联，如SHOX相关与IGF相关信号均汇聚于RAS/RAF/MAPK信号，故研究人员不认为这是SRS误分类为SHOX-RSS的分子解释；重要的是，临床诊断SRS的患者中仅约60%可发现分子异常，即40%病例分子病因仍未知，未识别的机制可能进一步促成表型重叠，NS中高达20%患者致病突变未知；研究人员仍认为独立于SHOX相关信号的其他方面对这些RBDs的显著误分类有很大影响；SRS相当部分手部X线片被误分类为SHOX-RSS可能再次归因于两种疾病的高表型变异性，SRS表型严重程度范围广且与低甲基化严重程度相关并取决于分子病因，其诊断受非特异特征挑战，即使经典特征也非见于所有患者，常用的Netchine-Harbison临床评分系统不包含手部X线片直接可见的特征，第5指弯曲指、屈曲指和关节挛缩等临床体征虽被描述于SRS但仅见于部分患者；NS亦表现为轻度、非特异的手部骨表型，这些不甚明显的表型可能妨碍Bone2Gene分类，而较轻表型似优先被分类为SHOX-RSS，可能因其表型高度可变；有趣的是相当数量SRS患者在两种方法中也被误分类为NS，端到端深度学习方法中误分类为NS与误分类为SHOX-RSS一样频繁；这些关于SRS与NS的观察在更大背景下可能也重要，因RBDs的表型变异性也可能在显示与SHOX相关信号遗传联系的RBDs中额外造成AI误分类，由此产生的问题是AI误分类中可归因于所述特定分子信号联系与RBDs一般表型重叠的比例各为多少，可能为两者结合，特定遗传联系可能进一步促成一般表型相似性从而提高误分类比例。局限性与展望方面，Bone2Gene基于手部X线片，患者手部骨表型缺如或不明显会妨碍其分类；Bone2Gene拟整合进RBDs整体诊断过程并与其他评估并用，明显表型时手部X线片可为基因检测提供指引，而基因检测补充表型评估，尤其在较轻病例及考虑到各RBDs所述表型异质性和RBDs间表型重叠时尤为有用，但RBDs亦显示遗传异质性和多效性，总体凸显诊断过程需同时纳入遗传与表型评估；另一需考虑方面是所观察AI方法的数据基础，多数患者获得分子诊断，但有时缺乏其诊断是分子确诊还是仅临床诊断的信息，尽管临床诊断由领域专家作出，鉴于多种RBDs所述表型异质性，分子确诊高度可取且常为明确诊断所需，在本数据与讨论背景下这一点尤其适用于NS与SRS，定量形态学测量方法中仅48%的SRS患者有分子确诊，虽这些缺乏原始来源信息的患者很可能也获得了分子诊断，但无法像所有SHOX-RSS患者那样确证，故须考虑这些临床诊断在分子分析后可能被证明不成立，错误的“真实”标签可能影响AI分类并促成误分类；此外两种AI方法中部分RBDs患者数量有限，虽训练时考虑了类别不平衡，但小样本量增大了X线片间个体变异的影响，其叠加于预期的疾病特异性差异之上；小样本量也导致部分较宽的95%置信区间，妨碍结果解读，故所给百分比应谨慎解读、真实值可能差异较大，但CMs仍可实现关于误分类模式的一般观察，且本研究主要目的并非量化分类性能而是将这些模式与RBDs分子背景相联系，故认为该局限可接受；此外两种AI模型均为初步模型，一种尚未经同行评审，另一种正在同行评审中，但两个基于不同方法学的独立模型显示相似结果，支持所描述RBDs依赖性误分类模式的观点；一个显著例外是NS，其在端到端深度学习方法中表现明显优于定量形态学测量方法，后者可能归因于该方法不包含腕骨或腕部图像信息，总体文献研究结果与CMs观察均不矛盾；软骨内成骨中的遗传信号仍是高度复杂的系统，研究仅呈现了在软骨内成骨中起关键作用的选定SHOX相关信号通路的概览，须考虑到此处仅展示少数选定RBDs，对部分纳入的RBDs仅有单一研究及模型生物（多为小鼠模型）的限制，研究意在展示细胞水平表型表达可能的样子，尽管许多RBDs显示广泛表型变异性且无表型-基因型相关性（如ACAN-RGD、SHOX-RSS），故其提供理解这些通路如何相连及展示野生型与致病突变表型表达差异的一般概览；此外所综述的几乎所有基因均参与生长板发育中促进或抑制软骨细胞增殖与分化的相似功能，凸显这些RBD表型重叠的潜力；然而软骨内成骨是涉及许多不同基因的高度复杂过程，未来研究应考虑与其他基因的相互作用，此处仅考察与SHOX相关的选定信号通路，为充分理解决定RBDs的遗传基础的复杂性，需进一步研究并对该领域现有结果进行文献比较；此外RBDs的分子病因与机制仅被部分理解，对此的进一步研究也亟需开展，不仅为改善RBDs诊断，也为识别可能改变疾病的潜在治疗靶点，以补充仅对症治疗。
