《Frontiers in Immunology》：Sheng-Jiang Powder and Akkermansia muciniphila interventions in experimental autoimmune encephalomyelitis: microbiota-linked sphingolipid/S1PR1-associated barrier remodeling
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背景：生姜散（SJP）是一种经典中药复方，已有报道其具有抗炎和调节肠道微生物群的活性。然而，其在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的保护作用是否与肠道微生物变化、鞘脂/S1P代谢及S1PR1相关屏障信号有关尚不清楚。方法：在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE
背景：生姜散（SJP）是一种经典中药复方，已有报道其具有抗炎和调节肠道微生物群的活性。然而，其在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的保护作用是否与肠道微生物变化、鞘脂/S1P代谢及S1PR1相关屏障信号有关尚不清楚。方法：在雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE，自免疫后第2天起（预期临床症状出现前）给予SJP、Akkermansia muciniphila（AKK干预组）或其联合干预。评估临床严重程度、组织病理学、炎症细胞因子及屏障相关标志物。通过荧光原位杂交和16S rRNA测序评估肠道微生物群变化。采用LC–MS分析血清和粪便的非靶向代谢组学谱。通过UPLC–MS/MS表征血清中检测到的SJP相关化合物并进行网络药理学分析。通过Western blotting、免疫荧光及bEnd.3细胞中S1PR1过表达实验进一步检测S1PR1相关信号。结果：发病前SJP、AKK及AKK_SJP干预降低了EAE严重程度、炎症病理及血清炎症细胞因子水平。这些效应伴随结肠屏障标志物改善、Akkermansia相关黏膜信号增加及肠道微生物谱改变。血清和粪便代谢组学分析突出了脂质相关通路，尤其是鞘脂代谢和信号传导。血清中检测到的SJP相关化合物映射到包含S1PR1的候选网络。在结肠和中枢神经系统组织中，治疗改变了屏障相关标志物和S1PR1表达。在bEnd.3细胞中，S1PR1过表达降低ZO-1表达，而含SJP血清部分减弱了这一变化。结论：发病前给予SJP可减轻EAE，并伴随肠道微生物组成、鞘脂/S1P相关代谢、S1PR1表达及屏障相关标志物的变化。AKK相关干预在若干微生物、代谢及屏障相关标志物上显示出重叠效应。
研究背景：多发性硬化（MS）是一种累及中枢神经系统（CNS）的长期炎症性自身免疫性疾病，以免疫驱动的脱髓鞘、轴突损伤及血脑屏障（BBB）功能障碍为特征。近年来，肠-脑轴成为理解MS发病机制的重要概念，临床和实验研究表明肠道微生物失调与MS和EAE的疾病发生和进展相关。在候选菌群中，Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）因与维持黏膜完整性、调节宿主代谢及减轻炎症密切相关而受到广泛关注，但其在自身免疫性神经炎症中的作用似乎具有环境依赖性，微生物群改变尤其是A. muciniphila相关变化与EAE发病机制的关联尚未完全明确。此外，代谢异常日益被认为是MS的重要特征，脂质代谢与膜组成、细胞内信号传导、免疫细胞活性及屏障完整性密切相关，鞘脂信号传导尤其与炎症调节、神经血管功能障碍及BBB稳定性有关。生姜散（SJP）是经典中药复方，由大黄（Rheum officinale Baill.）、姜黄（Curcuma longa L.）、僵蚕（Bombyx mori Linnaeus）和蝉蜕（Cryptotympana pustulata Fabricius）组成，原载于《伤寒温疫条辨》，传统用于"温病"，现代也用于季节性流感及其他以"热"和"毒"为特征的炎症性疾病。既往研究报道SJP可减轻高脂饮食相关急性胰腺炎大鼠的多器官炎症损伤，并通过调节肠道微生物群改善小鼠非酒精性脂肪性肝病；研究团队前期研究也提示SJP可通过调节脂肪酸代谢缓解EAE中的免疫失衡。然而，SJP的保护作用是否与肠道微生物群、鞘脂相关代谢及屏障功能的协同变化有关尚未系统研究。因此，本研究探讨发病前给予SJP是否减轻EAE，以及其效应是否与肠道微生物群、鞘脂/S1P代谢及S1PR1相关屏障信号的变化有关，采用体内和体外整合方法评估SJP、A. muciniphila干预（AKK）及其联合干预对疾病严重程度、炎症病理、肠道微生物谱、鞘脂相关代谢变化及屏障相关标志物的影响。
关键技术方法：研究采用雌性C57BL/6小鼠（购自广东省中医药科学院动物实验中心）诱导EAE模型，通过UPLC–MS/MS表征SJP化学成分及血清中检测到的SJP相关化合物；采用16S rRNA基因V4区测序分析肠道微生物群；采用LC–MS进行血清和粪便非靶向代谢组学分析；采用网络药理学分析血清检测到的SJP相关化合物的潜在靶点；采用Western blotting、免疫荧光、多重免疫荧光及荧光原位杂交（FISH）检测屏障相关标志物和S1PR1信号；采用bEnd.3细胞S1PR1过表达实验及跨内皮电阻（TEER）测定评估屏障功能；含SJP血清制备自20只八周龄雄性Sprague–Dawley大鼠。
研究结果：
3.1 SJP、AKK及AKK_SJP降低EAE严重程度和神经炎症病理：MOG35–55免疫后MOD小鼠出现进行性神经功能缺损，SJP、AKK和AKK_SJP组临床评分低于MOD组；H&E染色显示MOD小鼠脊髓和脑组织炎症浸润，治疗组炎症评分降低；MOD小鼠脊髓ZO-1染色减少，治疗后增加；MOD小鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-6水平高于CON小鼠，SJP、AKK和AKK_SJP组这些细胞因子降低。
3.2 SJP、AKK及AKK_SJP改善结肠屏障完整性并改变肠道微生物谱：MOD小鼠显示结肠炎症浸润、ZO-1染色减少及杯状细胞减少，SJP、AKK和AKK_SJP组这些变化减轻；FISH分析显示MOD小鼠结肠A. muciniphila相关信号降低，治疗后FISH阳性面积分数增加，AKK_SJP组信号最强；Shannon指数组间差异显著而Chao1无显著总体差异；Bray–Curtis PCoA显示微生物群落结构差异（PERMANOVA：R2=0.484，P=0.0001），PERMDISP无显著多变量离散度差异；与MOD相比，三个干预组均出现Enterococcus和Romboutsia降低、Bifidobacterium和Alistipes升高，部分比较中Muribaculum、Faecalibaculum和Turicibacter也有变化；PICRUSt2预测在AKK和AKK_SJP与MOD比较中识别出FDR显著的通路变化，而SJP与MOD比较中显示的途径均未达到FDR阈值。
3.3 SJP、AKK及AKK_SJP与EAE中鞘脂/S1P相关代谢组学变化相关：PCA得分图显示各组血清和粪便代谢组学谱分离；通路富集分析识别出血清和粪便中脂质相关代谢通路，包括鞘脂代谢和鞘脂信号传导；代谢组范围FDR校正后，AKK与MOD比较识别出92个血清和10个粪便特征，AKK_SJP与MOD比较识别出41个血清和43个粪便特征，MOD与CON及SJP与MOD比较中无特征达到q<0.05；注释的S1P和Sph特征组间有变化但未达到代谢组范围FDR显著性；汇总分析识别出12个FDR显著的粪便微生物–代谢物关联，无血清关联，经实验组调整后均不显著。
3.4 血清检测到的SJP相关化合物映射到包含S1PR1的候选网络：UPLC–MS/MS在血清样本中检测到SJP相关峰；利用血清检测到的SJP相关化合物与疾病相关靶点的重叠预测靶点构建聚焦PPI网络，S1PR1与IL1B、STAT3、MAPK1、SRC、ICAM1、PTPRC、IL2等高连接候选节点共同出现；KEGG富集分析识别出神经活性配体–受体相互作用、JAK–STAT信号、TNF信号、NF-κB信号、细胞因子–细胞因子受体相互作用、cAMP信号及鞘脂信号等通路。
3.5 SJP、AKK及AKK_SJP调节结肠S1PR1和屏障相关信号：Western blot显示MOD小鼠结肠Occludin、WNT7A、β-catenin、RhoA、SPHK1和S1PR1表达低于CON小鼠，SJP、AKK和AKK_SJP组部分蛋白升高；多重免疫荧光显示MOD小鼠结肠组织ZO-1和S1PR1信号降低，治疗后增加，SJP和AKK_SJP组部分荧光读数尤为明显。
3.6 SJP、AKK及AKK_SJP减轻CNS屏障相关异常并改变S1PR1信号：CNS组织中MOD小鼠Occludin、WNT3A、β-catenin和SPHK1表达低于CON小鼠，S1PR1表达高于CON小鼠；RhoA在MOD小鼠中呈数值升高但总体组间差异无统计学意义；SJP、AKK和AKK_SJP不同程度增加Occludin、WNT3A、β-catenin和SPHK1表达并降低S1PR1表达；CNS微血管区域免疫荧光显示MOD小鼠ZO-1信号降低、S1PR1信号升高，治疗组ZO-1荧光增加、S1PR1荧光降低；双标记显示S1PR1染色与IBA1阳性区域的空間重叠较GFAP阳性结构更明显，MOD小鼠GFAP和IBA1阳性区域内S1PR1 MFI均高于CON小鼠，SJP治疗后降低。
3.7 含SJP血清减弱bEnd.3细胞中S1PR1过表达相关的ZO-1表达变化：EGFP荧光确认质粒转染成功；S1PR1-OE细胞S1PR1 mRNA表达高于Vector细胞，SJP+S1PR1-OE组S1PR1 mRNA表达低于S1PR1-OE组；S1PR1-OE细胞S1PR1荧光强度增加，含SJP血清处理后降低；反之，S1PR1-OE细胞ZO-1荧光强度降低，SJP+S1PR1-OE组增加；TEER测量显示S1PR1过表达bEnd.3细胞屏障电阻低于Vector细胞，含SJP血清部分减弱这一降低。
讨论部分总结：本研究在免疫后第2天即神经体征预期出现前开始给予SJP，这一发病前干预减轻了EAE的临床和炎症表现，并伴随结肠屏障标志物、肠道微生物谱、鞘脂/S1P相关代谢物及CNS屏障相关标志物的变化。AKK和AKK_SJP组进一步表明微生物导向干预伴随屏障和鞘脂/S1P相关变化。肠道发现支持黏膜屏障损伤和肠道微生物紊乱参与EAE，与既往MS/EAE研究一致。A. muciniphila与黏膜生态、黏液利用、宿主代谢及屏障功能密切相关，但其生物学效应可能因疾病背景、宿主背景、饮食、菌株特征及周围微生物群落而异。代谢组学数据提示脂质重塑是本研究EAE的重要特征，血清和粪便通路分析突出鞘脂代谢和鞘脂信号传导。血清化学谱和网络分析将血清检测到的SJP相关化合物与炎症、细胞因子相关、cAMP及鞘脂信号通路联系起来，S1PR1在聚焦PPI网络中作为高连接候选节点出现。结肠和CNS组织中S1PR1变化方向不同，不太可能具有相同生物学意义：结肠中S1PR1与SPHK1、Occludin、ZO-1等屏障相关标志物一同降低，符合局部S1P/S1PR相关屏障调节受损；CNS中S1PR1染色增加不一定表示BBB完整性改善，S1PR1可由不同CNS和血管细胞群表达，其病理意义可能随细胞来源和炎症背景而异，本研究双标记免疫荧光提示CNS S1PR1信号增加可能部分反映炎症性小胶质细胞/巨噬细胞相关变化而非单纯内皮屏障保护增强。研究局限性包括：SJP给药始于神经症状出现前，其对已建立EAE的疗效有待评估；个体细胞群对总体组织S1PR1信号的相对贡献尚不清楚；S1P和鞘氨醇特征通过非靶向LC–MS鉴定，有MS/MS谱支持但未经真实标准品验证，且变化未达到代谢组范围FDR显著性；微生物–代谢物关联具有观察性。这些发现支持SJP治疗、S1PR1相关反应及屏障改变之间的关联，但需进一步研究确定潜在因果机制。
结论翻译：总之，发病前给予SJP可减轻EAE，并伴随肠道微生物组成、鞘脂相关代谢、S1PR1表达及屏障相关标志物的变化。A. muciniphila及联合干预产生重叠的微生物、代谢及组织反应。这些发现为进一步研究EAE中微生物–代谢物–屏障相互作用提供了基础。
