《Frontiers in Immunology》：Immediate early response 3 promotes airway epithelial inflammation and represents a therapeutic target in chronic obstructive pulmonary disease
编辑推荐：
背景：慢性阻塞性肺疾病（COPD）以持续性气道炎症为特征，然而临床上实用的生物标志物和经机制验证的治疗靶点仍然有限。本研究旨在识别并功能验证COPD中烟雾应答性气道上皮炎症调控因子，并通过整合基于人群的临床数据、多组学分析、遗传因果推断和实验验证建立可解释的预
背景：慢性阻塞性肺疾病（COPD）以持续性气道炎症为特征，然而临床上实用的生物标志物和经机制验证的治疗靶点仍然有限。本研究旨在识别并功能验证COPD中烟雾应答性气道上皮炎症调控因子，并通过整合基于人群的临床数据、多组学分析、遗传因果推断和实验验证建立可解释的预测框架。方法：互补的临床和分子研究使用了不同的人群。可解释的机器学习模型在CHARLS中对记录的COPD状态进行分类，并在各调查波次间进行验证。独立的肺转录组分析整合了差异表达、共表达网络、113种机器学习配置和单细胞谱分析。两样本孟德尔随机化检验了基因预测的IER3表达与FEV1/FVC之间的关系。IER3的功能效应通过AAV介导的沉默在香烟烟雾暴露小鼠中以及通过siRNA敲低在香烟烟雾提取物刺激的支气管上皮细胞中进行评估。药物筛选和分子模拟优先筛选候选化合物以供进一步研究。结果：支持向量机对COPD风险取得了最佳预测性能（测试集AUC=0.821；时间验证AUC=0.829）。多组学分析一致将IER3识别为炎症富集转录网络中的核心COPD相关基因。一个六基因诊断特征展现出稳健的外部性能（AUC=0.882和0.836），其中IER3和ATF3成为跨独立队列最具可重复性的生物标志物。单细胞分析将IER3主要定位至气道上皮细胞和巨噬细胞，并揭示了COPD中上皮-巨噬细胞通讯增强。孟德尔随机化支持基因预测的IER3表达与肺功能受损之间的因果关联（IVW β=?0.042，P<0.001）。实验研究进一步证明香烟烟雾诱导上皮IER3表达，而IER3沉默抑制促炎细胞因子产生、减少炎症细胞募集、减轻肺损伤并部分恢复肺功能。药物重定位分析提名IMD-0354作为IER3相关炎症轴的潜在候选调节剂。结论：研究人员开发了一个用于COPD风险预测的可解释机器学习框架，并识别IER3作为气道上皮炎症的候选介导因子。整合证据支持其参与烟雾诱导的炎症放大以及可能导致肺功能受损，突出IER3作为值得进一步机制和临床验证的潜在治疗靶点。
慢性阻塞性肺疾病（COPD）以持续性气流受限、进行性肺功能丧失和反复急性加重为特征，全球患病率居高不下，吸烟是最主要的危险因素。当前药物治疗（主要为吸入性支气管扩张剂和糖皮质激素）仅能缓解症状，无法逆转已形成的气流阻塞或从根本上改变疾病进程，因此亟需稳健且具有临床可操作性的生物标志物以支持早期检测、生物学分层和精准干预。持续性气道炎症是COPD的核心特征，气道上皮细胞不仅是物理屏障，更是能感知香烟烟雾诱导的应激并产生细胞因子和趋化因子以塑造局部免疫应答的主动免疫调节细胞。高通量多组学分析和机器学习为解析这种跨尺度生物学异质性提供了互补手段。然而，仍存在以下研究空白：第一，非西方人群代表性队列中COPD的可解释风险架构尚未用当代机器学习框架系统建模；第二，转录组生物标志物发现多局限于单一队列或分析平台，从组织水平特征到细胞类型分辨表达模式的跨数据集一致性验证较少；第三，气道上皮细胞维持免疫细胞募集和炎症放大的分子节点尚未完全阐明，且连接候选调控因子与肺功能受损的因果证据有限。为此，研究人员开展了互补的人群水平和分子水平研究：利用CHARLS分析构建并解释中老年人COPD状态的临床模型；在独立人类转录组队列中，采用差异表达、共表达网络、免疫浸润谱分析、基于机器学习的生物标志物筛选和单细胞分析识别可重复的COPD相关基因及其细胞背景；进一步通过孟德尔随机化、虚拟敲除和药物筛选分析优先候选基因，并在香烟烟雾暴露小鼠和香烟烟雾提取物刺激的支气管上皮细胞中进行功能研究。通过这一整合框架，研究人员识别IER3为可重复失调的COPD相关基因，富集于气道上皮细胞和巨噬细胞，遗传和实验证据支持IER3在香烟烟雾诱导的上皮炎症应答、免疫细胞募集和肺损伤中的致病作用，提示IER3作为连接气道上皮激活与COPD持续性炎症的潜在分子生物标志物和治疗靶点。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：利用CHARLS 2018年波次（n=17,776）构建 derivation 队列、2013年波次（n=15,629）作为时间验证队列，结合LASSO回归和随机森林进行特征筛选，训练六种机器学习模型并以SHAP进行可解释性分析；使用GEO肺组织芯片数据集GSE151052、GSE38974和GSE76925进行差异表达分析、WGCNA共表达网络构建、TF-miRNA-mRNA调控网络分析和ssGSEA免疫浸润评估；采用113种机器学习建模配置筛选诊断基因特征；利用GSE173896单细胞RNA测序数据进行细胞分群、注释和CellChat细胞通讯分析；使用scTenifoldKnk进行虚拟基因敲除分析；基于IEU OpenGWAS的全血cis-eQTL（14,263名欧洲 ancestry 参与者）和FEV1/FVC GWAS汇总数据（321,047人）进行两样本孟德尔随机化；构建6个月慢性香烟烟雾暴露小鼠模型并结合AAV2/9介导的Ier3气道内沉默；使用16HBE支气管上皮细胞和香烟烟雾提取物刺激结合siRNA敲低进行体外验证；通过Enrichr/DSigDB药物重定位筛选、AutoDock分子对接和GROMACS分子动力学模拟优先候选化合物。
研究结果如下：（1）基于人群的COPD风险预测与特征重要性——在CHARLS队列中，LASSO和随机森林交集筛选出14个稳健特征，SVM模型表现最佳（测试集AUC=0.821；2013年波次时间验证AUC=0.829），SHAP分析显示哮喘史、共病负担、较差自评健康、年龄和胃/心脏病史为主要风险驱动因素，高教育程度和非吸烟显示保护效应。（2）COPD患者肺组织转录组谱分析——在GSE151052中鉴定出数百个差异表达基因，上调基因略多于下调基因，炎症/应激相关即刻早期基因（IER3、ATF3、NFKBIZ、IL1B、IL6）显著诱导，肺泡上皮稳态相关转录本（SURF4、ABCA3）显著降低；WGCNA鉴定出14个共表达模块，magenta模块与COPD状态相关性最强（r=0.82），富集于先天免疫应答、白细胞迁移和NF-κB信号通路，与上调DEG交集获得262个候选基因。（3）转录调控网络与免疫微环境分析——跨队列交集获得12个一致上调的候选枢纽基因，TF-miRNA-mRNA网络显示NF-κB为中心的调控轴，ATF3和NR4A2兼具转录因子和枢纽基因双重角色，NFKBIZ占据关键桥接位置；ssGSEA显示COPD肺组织中巨噬细胞和中性粒细胞浸润评分显著升高，核心基因表达与炎症细胞富集正相关（r=0.3–0.5）。（4）多模型整合识别诊断标志基因——113种建模配置中，Stepwise GLM+GBM表现最佳（三数据集平均AUC=0.901），最小签名包含六个基因（ATF3、IER3、IL6、IL1B、CH25H、NR4A2），六基因签名在GSE76925中AUC=0.882、GSE38974中AUC=0.836，IER3单基因判别性能最强（AUC=0.825）。（5）单细胞异质性与细胞间通讯——约31,000个高质量细胞被注释为T细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、B细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等，IER3和ATF3主要富集于上皮细胞并在部分巨噬细胞中升高，IL1B和IL6主要来源于巨噬细胞；CellChat显示COPD中配体-受体通讯全局增强，尤其沿巨噬细胞-上皮-中性粒细胞轴，MIF-CD74/CXCR4、C3-C3aR、WNT5A、CCL2-CCR2和VEGF信号通路活性增加。（6）IER3和ATF3作为上皮相关COPD生物标志物的优先排序——整合分析识别IER3和ATF3为仅有的两个同时满足跨队列一致上调、属于COPD相关共表达网络成员和上皮细胞富集的基因，在独立GSE47460队列（n=328）中验证两者显著上调，基于二者的逻辑回归模型显示良好校准和临床净获益。（7）基于scTenifoldKnk的核心基因计算机扰动——在上皮细胞中虚拟敲除IER3后鉴定出BCAM、FMO2、KRT7、SDC1、CAV1/CAV2、SCNN1B、AQP5等受扰动下游靶基因，富集于上皮架构/黏附、跨膜转运和上皮分化/应激应答；在巨噬细胞中鉴定出MCEMP1、CD52、ZFP36L1等受扰动基因，富集于免疫激活和吞噬/炎症调控通路；RT-qPCR实验验证了BCAM、SDC1、SCNN1B和CAV2四个上皮靶标。（8）IER3与肺功能的因果关联——两样本孟德尔随机化IVW分析显示基因预测的IER3表达与FEV1/FVC呈负相关（β=?0.042，SE=0.010，P<0.001），加权中位数（β=?0.048）、加权模式（β=?0.050）和MR-Egger（β=?0.053）结果一致，MR-Egger截距接近零（0.003；P=0.96）提示无水平多效性，留一法分析显示无单一SNP主导，Q检验无显著异质性（P=0.42）。（9）IER3促进香烟烟雾诱导的气道上皮炎症——6个月CS暴露小鼠表现肺泡扩大、肺泡间隔破坏、气道壁增厚和气道重塑，MLI显著增加，FVC、Cchord、FRC、IC和VC显著增加而FEV50/FVC显著降低；IER3 mRNA和蛋白在CS暴露小鼠肺中显著升高，双免疫荧光显示IER3主要表达于CC10阳性气道上皮细胞；CS暴露增加CXCL1、CXCL2、TNF-α、CCL22和IL-23表达；体外CSE刺激16HBE细胞增加IER3表达及IL-6、IL-1β、IL-8、CCL22、CXCL1、CXCL2和IL-23 mRNA表达，IER3敲低显著减弱CSE诱导的IL-6、IL-1β和IL-23表达。（10）AAV介导的气道上皮IER3沉默减轻CS诱导的气道炎症并改善肺气肿性肺损伤和肺功能障碍——AAV2/9-shIer3显著降低CC10阳性气道上皮细胞中IER3表达，减少BALF中CD45+炎症细胞、巨噬细胞和中性粒细胞绝对数量，降低BALF中CXCL1和CCL2浓度（IL-6呈下降趋势但未达统计学显著性），减轻肺泡扩大和MLI增加，部分改善FRC、Cchord、IC、VC和RI（FEV100/FVC未显著恢复）。（11）药物优先排序与分子模拟验证——Enrichr/DSigDB分析提名IMD-0354为与IER3相关转录模式逆转最強关联的化合物（combined score≈146,675.9；P=6.50×10??；调整P=0.0256），IMD-0354为选择性IKKβ抑制剂；AutoDock Vina预测IMD-0354与AlphaFold预测的IER3结构跨膜域邻近口袋结合，最佳结合能约?6.3 kcal/mol；100 ns分子动力学模拟显示RMSD轨迹和氢键数量随时间变化，回旋半径和SASA在初始平衡后趋于平台，RMSF谱显示残基水平柔性异质性。
讨论部分总结：本研究整合了CHARLS人群水平临床分析与分子水平研究，临床模型描述COPD发生的广泛临床背景，分子发现支持IER3在香烟烟雾诱导气道上皮炎症中的作用，但二者使用独立数据集，不能建立参与者水平的临床评分与IER3表达之间的关联。吸烟提供了组分间的生物学连接：吸烟史被纳入临床预测因子，香烟烟雾在实验系统中增加上皮IER3表达，IER3沉默减轻炎症应答和肺损伤，支持IER3参与COPD相关暴露相关炎症过程的假说，但不能证明IER3介导CHARLS预测因子的贡献。在分子层面，IER3区别于既往COPD生物标志物的四个特征为：跨四个独立批量转录组数据集可重复上调、单细胞水平主要定位于气道上皮基底和分泌细胞、孟德尔随机化提供遗传因果证据、AAV介导的体内沉默减轻CS诱导的肺气肿性改变和气道炎症。机制上，IER3（又称IEX-1）是TNF-α等炎症刺激快速诱导的即刻早期基因，与NF-κB依赖性转录控制紧密相关，其功能具有背景依赖性。孟德尔随机化分析需要注意全血cis-eQTL可能不能完全捕获肺组织或气道上皮中IER3的调控架构。转化方面提出三个潜在方向：开发基于血液的IER3检测、将IER3表达作为候选分层标志物、药物重定位和结构分析应被视为两条独立的假设生成证据线。局限性包括：CHARLS风险模型为观察性队列衍生，不能完全排除残余混杂；批量转录组反映复合组织信号；scTenifoldKnk结果为计算预测；缺乏GOLD分期分层结果；体内AAV实验每组仅5只小鼠且未预设主要终点；孟德尔随机化依赖全血cis-eQTL工具；Enrichr筛选和AlphaFold对接不能证明IMD-0354直接结合或特异性靶向IER3。结论部分翻译：在一个具有代表性的中国中老年队列中，研究人员开发了一个用于COPD风险预测的可解释机器学习框架，并跨多队列批量肺转录组、单细胞转录组、基于孟德尔随机化的因果推断以及互补的体内外实验，一致优先识别IER3作为核心候选疾病驱动因子。整合证据表明IER3在COPD中可重复上调并主要定位于气道上皮相关细胞群体。除与增强的炎症微环境相关外，升高的IER3可能在遗传层面因果性促进肺功能下降，并增强烟雾诱导的上皮炎症介质放大。因此，IER3可能作为COPD中可操作的治疗节点。对其上游调控架构、细胞类型限制性作用和通路靶向干预的进一步验证可能为COPD的早期检测和精准治疗提供更直接可转化的支持。
