小鼠皮肤巨噬细胞表型与功能的年龄相关变化及外周血单个核细胞分泌组对其的调控

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Age‐related changes in the phenotype and function of mouse skin macrophages and their modulation by the secretome of peripheral blood mononuclear cells

　　

皮肤衰老伴随慢性低度炎症（"inflammaging"）及真皮细胞外基质的渐进性重塑，然而在生命早期启动这些过程的细胞事件仍未被充分认识。本研究对年轻（8周龄）、中年（26周龄）和老年（52周龄）雄性C57BL/6小鼠背部皮肤进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），以绘制细胞组成的年龄相关变化图谱，并重点关注巨噬细胞。尽管大多数细胞类型的相对比例总体保持稳定，但巨噬细胞区室在最老皮肤中显著扩增。亚聚类解析出四个巨噬细胞群体，其中三个随年龄增长而扩增或出现。以S100a8和S100a9及Cd14高表达单核细胞来源特征为标志的Mac4群体主要见于老年皮肤，并通过F4/80、S100a8和S100a9共染色在in situ得到证实。细胞间通讯分析预测老年皮肤中巨噬细胞向成纤维细胞的信号增强，包括促纤维化介质Thbs1和Spp1，同时一部分成纤维细胞（FB3/FB4）中胶原及纤维化相关基因上调。值得注意的是，胶原转录本增加，而COL5A3蛋白减少，且二次谐波成像显示真皮胶原结构紊乱，提示基质重塑受转录后调控。Ex vivo以γ射线照射的外周血单个核细胞分泌组（PBMC-sec）处理老年皮肤，可使巨噬细胞区室向年轻样组成转变，并下调纤维化相关的成纤维细胞基因。总体而言，这些发现确定了单核细胞来源的、促炎且可能促纤维化的巨噬细胞亚群的早期出现是小鼠皮肤衰老的特征，并提示PBMC-sec可部分逆转这些变化。

研究背景方面，衰老累及全身各组织，以多器官系统功能衰退为特征，由细胞衰老、线粒体功能障碍、基因组不稳定及细胞间通讯改变等分子与细胞标志驱动。皮肤衰老表现为再生能力与结构完整性逐渐下降，出现表皮变薄、真皮胶原与弹性纤维含量减少、免疫功能改变及创面愈合受损。皮肤衰老的核心特征之一是炎性衰老（inflammaging），即由细胞衰老与免疫失调驱动的慢性、低度、无菌性炎症状态。巨噬细胞是真皮免疫细胞的核心，存在两种来源：胚胎期产生的长寿命组织驻留巨噬细胞，以及源自骨髓单核细胞、经血液进入组织的短寿命单核细胞来源巨噬细胞。传统M1/M2二分法已被组学研究表明过于简化，其表型常呈混合状态。在人类皮肤中，促炎性单核细胞来源巨噬细胞可从血液迁移并在衰老真皮中积聚，促进炎性衰老。γ射线照射的凋亡外周血单个核细胞分泌组（PBMC-sec）是一种无细胞复合制剂，具有广泛的细胞保护、促再生与免疫调节活性，已在心肌梗死、局灶性脑缺血及脊髓损伤模型中显示治疗潜力，并可加速皮肤创面闭合、促进组织再生与血管生成，还能减轻人及小鼠皮肤的增生性瘢痕形成。然而，小鼠皮肤衰老早期巨噬细胞区室的变化及其与成纤维细胞的互作尚不清楚，PBMC-sec能否调控这些年龄相关改变亦未明确，此即开展本研究的动因。

研究人员对三个年龄组雄性C57BL/6小鼠背部皮肤进行scRNA-seq，解析巨噬细胞亚群及其与真皮成纤维细胞的互作，并对老年小鼠皮肤进行ex vivo PBMC-sec处理以检验上述年龄相关改变能否被调控。结论为：单核细胞来源的、S100a8/S100a9阳性巨噬细胞群体在早期衰老皮肤中出现，并通过促纤维化信号与成纤维细胞互作；同时伴有亚群受限的基质重塑、纤维化相关基因特征及真皮胶原的转录后调控改变；PBMC-sec可部分使这些特征正常化，提示衰老巨噬细胞区室是可干预的靶点。其意义在于将炎性衰老与细胞外基质稳态改变相联系，并为基于分泌组的年龄相关皮肤重塑干预提供依据。

关键技术方法方面（不超过250字）：采用8、26、52周龄雄性C57BL/6小鼠背部皮肤样本（每条件3只动物混合）；经组织酶解后以10x Genomics Chromium平台构建scRNA-seq文库并测序；以Seurat进行整合聚类与注释，MAST进行差异表达分析，EnrichR进行富集分析，CellChat推断细胞间通讯，AddModuleScore计算纤维化模块评分；以免疫荧光共染色验证巨噬细胞亚群，H&E染色评估组织形态，多光子成像结合二次谐波生成（SHG）评估胶原结构，Western blot检测COL5A3蛋白；并以ex vivo PBMC-sec处理皮肤24 h后进行平行scRNA-seq分析。

研究结果方面：2.1 巨噬细胞在小鼠皮肤早期衰老中选择性扩增——通过对18 551个质控后细胞的无偏聚类获得23个簇并注释为角质形成细胞、成纤维细胞、内皮/平滑肌细胞（EC/SMC）、骨骼肌细胞、T细胞、朗格汉斯细胞与树突状细胞（LC/DC）及巨噬细胞（Mac），发现单核/巨噬细胞（Mono/Mac）比例由8周与26周龄的1.53%和1.48%升至52周龄的16.41%，而多数主要细胞类型比例稳定或下降，提示髓系区室的选择性重塑；差异表达基因（DEG）在年轻与老年比较中最多，以角质形成细胞和成纤维细胞亚群变化最强。2.2 衰老重塑巨噬细胞区室并揭示S100a8/S100a9阳性群体——巨噬细胞亚聚类得到Mac1–Mac4四个群体，Mac2和Mac3随年龄相对增加，Mac4仅见于老年皮肤；Mac1高表达趋化因子（Ccl12、Ccl8、Ccl2、Ccl7）及抗炎因子Il10，Mac2富集核苷酸代谢、转录调控、凋亡与应激相关基因及核糖体基因，Mac3高表达Lpl、Trem2、Lyz2、Syngr1、Ptgr1，Mac4表达G0s2、S100a8、S100a9、Lcn2等炎症相关基因；基于组织驻留标志Mrc1、Fcgr1与单核细胞来源标志Cd14、S100a8的表达模式，提示Mac1及部分Mac2、Mac3为组织驻留型，Mac4符合单核细胞来源；Mac1在年轻与老年间仅6个上调、1个下调基因，较为稳定；Mac2富集内质网应激，Mac3富集线粒体与有氧电子传递链，Mac4富集炎症反应、细胞因子结合与IL-1信号；免疫荧光显示老年真皮中F4/80与S100a8或S100a9双阳性细胞显著增多，支持S100a8/S100a9阳性巨噬细胞群体的年龄限定性存在。2.3 老年巨噬细胞与成纤维细胞通讯增强并伴基质重塑基因程序——CellChat预测老年皮肤中巨噬细胞与其他细胞信号总体增强，各巨噬细胞亚群与成纤维细胞间信号随年龄增加，包括巨噬细胞来源的Thbs1（凝血酶敏感蛋白-1，可激活潜伏型TGF-β）与Spp1（骨桥蛋白）信号，二者在老年巨噬细胞区室整体升高；老年成纤维细胞中多个胶原基因及TGF-β下游靶基因Lox、Skil、Smad7、Serpine1、Fn1、Timp1上调，纤维化模块评分主要在FB3/FB4亚群升高；然而COL5A3蛋白在老年真皮中降低，SHG成像显示老年真皮胶原信号更弱且组织紊乱，呈现胶原转录与蛋白及结构水平的不一致。2.4 PBMC-sec使老年皮肤巨噬细胞组成向年轻样转变——ex vivo PBMC-sec处理后主要细胞簇构成未发生 gross 改变，老年皮肤巨噬细胞相对比例下降至接近年轻与中年水平，Mac2、Mac3、Mac4相对比例降低，基因表达变化主要见于老年巨噬细胞（尤其Mac1、Mac2、Mac4）；老年成纤维细胞中Col1a1、Col1a2、Col3a1等细胞外基质及TGF-β调控基因显著下调，而Thbs1与Spp1本身未降低，提示纤维化基因下调可能继发于年龄扩增巨噬细胞群体减少所致的巨噬细胞来源信号减弱。

讨论部分总结：研究指出衰老皮肤获得以巨噬细胞扩增及S100a8/S100a9阳性、可能为单核细胞来源的Mac4群体出现为标志的独特髓系特征，并伴巨噬细胞-成纤维细胞通讯增强及亚群受限的成纤维细胞基质重塑程序，提示早期皮肤衰老涉及髓系区室的选择性重塑，可能连接炎性衰老与细胞外基质稳态改变。关于巨噬细胞数量随衰老增减尚无共识，差异可能源于物种、解剖部位、年龄范围、标志物及定量方法不同；衰老皮肤可能表现为不同巨噬细胞生态位的分化轨迹，即驻留的血管相关群体减少而招募的炎症群体扩增，且该扩增在较早阶段即可检出，可能先于并促成后期真皮基质结构退化。Mac1与Mac4均为炎症群体，但未显示明确M1特征而呈混合M1/M2特征，凸显巨噬细胞可塑性及二分法的局限；Mac4因年龄限定性出现、Cd14高表达及S100a8/S100a9阳性、表达与组织重塑相关的炎症介质，可能连接局部炎性衰老与基质重塑。S100a8/S100a9高表达巨噬细胞与心肌梗死后的纤维化重塑、梗阻性肾病及特发性肺纤维化相关，且S100a8/S100a9亦见于中性粒细胞等其他髓系细胞，其细胞与部位特异性作用可能依情境而异。巨噬细胞向成纤维细胞信号增强包括凝血酶敏感蛋白-1与骨桥蛋白，结合FB3/FB4中胶原及纤维化相关基因上调，支持正在形成的巨噬细胞-成纤维细胞轴使老年真皮倾向于基质重塑程序；但CellChat互作与纤维化评分属计算预测，需中和实验或共培养等功能验证以确立因果。胶原转录与蛋白水平的不一致可能与动物年龄相对较轻有关，胶原转录增加或代表衰老早期短暂阶段，转录后调控（mRNA稳定性或翻译改变、前胶原加工受损或基质周转增加）可使转录本丰度与功能性纤维状胶原解耦。PBMC-sec部分逆转年龄相关改变，与已知免疫调节及抗纤维化特性一致；由于Thbs1表达未被降低，纤维化成纤维细胞基因下调更可能继发于巨噬细胞负荷减少；处理为ex vivo且未直接评估细胞衰老，故效应更宜描述为免疫调节或衰老调节；因无血管及循环单核细胞供应，可排除新巨噬细胞招募，亦未检测到凋亡相关转录本的显著变化，其机制尚待TUNEL或Ki-67等功能实验确定。研究局限包括：每条件混合3只动物以最大化细胞回收，消除了动物水平重复，故比例与转录谱差异属假设生成性；实体组织酶解可能因组织组成与基质密度差异影响解离效率并诱导应激反应，但S100a8/S100a9阳性巨噬细胞增加经免疫组化独立支持；52周龄小鼠代表成熟成年而非高龄，仅纳入雄性，且未解析中性粒细胞群体；巨噬细胞-成纤维细胞互作与纤维化程序主要基于转录特征与计算推断，需个体样本验证、机制性共培养或扰动实验及in vivo研究。研究结论译为：本研究提供了早期衰老小鼠皮肤的单细胞图谱，其中单核细胞来源的S100a8/S100a9阳性巨噬细胞群体出现，并通过促纤维化信号与成纤维细胞互作；这伴随亚群受限的基质重塑、纤维化相关基因特征及真皮胶原的转录后调控改变；PBMC-sec对这些特征的部分正常化表明衰老巨噬细胞区室是可干预的靶点，并支持进一步研究基于分泌组的干预措施用于年龄相关皮肤重塑。