《Frontiers in Immunology》：CD177 gene polymorphisms governing the differential expression of HNA-2 on neutrophils in Indians
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背景：CD177gp又称人中性粒细胞抗原（HNA）-2，由位于19号染色体上的CD177基因编码。涉及该基因多态性、mRNA剪接缺陷、DNA甲基化等多种分子机制调控中性粒细胞上HNA-2的表达，表达范围为0%至100%，大多数个体呈现独特的双态性表达。由于假基
背景：CD177gp又称人中性粒细胞抗原（HNA）-2，由位于19号染色体上的CD177基因编码。涉及该基因多态性、mRNA剪接缺陷、DNA甲基化等多种分子机制调控中性粒细胞上HNA-2的表达，表达范围为0%至100%，大多数个体呈现独特的双态性表达。由于假基因CD177P1的存在，其基因分型常较为复杂。方法：本研究通过流式细胞术，使用MEM-166和TAG4两种克隆，比较了来自印度孟买的102名个体中性粒细胞上CD177gp的表达。采用长片段PCR对CD177基因进行基因分型。随后将表型表达与CD177基因多态性进行关联分析，以确定印度人群中HNA-2的分子基础。结果：总体而言，使用MEM-166克隆检测的CD177表达中位数为60.4%（Q1–Q3：48.5–70.8），使用TAG4克隆检测为58.4%（Q1–Q3：45.9–72.9）。两种克隆间观察到1.56%的克隆依赖性表达差异，具有统计学意义（p = 0.007）。分子基因分型鉴定出17种不同的基因型模式和8个新突变。含有NM_020406.4:c.787A>T的多位点基因型模式在8.8%的样本中以杂合状态存在，其中66.67%的样本CD177gp低表达。结论：这是首次报道印度孟买个体CD177基因分子特征的研究。
研究背景：人中性粒细胞抗原（HNA）-2（原称NB1）是中性粒细胞表面第二重要的多态性糖蛋白，由CD177基因编码，定位于染色体19q13.31。HNA-2携带于CD177糖蛋白上，该蛋白为糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白（58–64 kDa），专一表达于中性粒细胞。其独特性在于中性粒细胞表面呈现高度可变的双态性表达，即同一个体中存在两个亚群：一个反应性亚群和一个非反应性亚群。尽管HNA-2为高频抗原，但不同研究组报道约0.45%至14.29%的个体完全缺失该抗原（HNA-2 null）。此类个体易发生同种免疫并产生抗HNA-2抗体。CD177在中性粒细胞上的表达受到严格调控，呈现显著的个体间变异，主要由遗传多态性、涉及CD177基因及其假基因CD177P1的基因转换事件以及CD177位点内错误的mRNA剪接事件所决定。特别是外显子7基因转换导致提前终止密码子，是HNA-2 null表型的主要机制，而其他错义多态性与表面表达降低或异质性表达相关。尽管HNA-2具有临床相关性且分子中性粒细胞抗原分型日益受到关注，但印度人群中CD177多态性及其对HNA-2表达影响的数据仍然匮乏。鉴于印度人群的遗传多样性以及对HNA抗体介导输血并发症认识的不断提高，开展人群特异性研究十分必要。本研究旨在调查影响印度人群中中性粒细胞上HNA-2表达的CD177基因多态性，并将基因型变异与表型表达进行关联分析。
研究人员开展的研究及结论与意义：本研究在印度孟买招募了102名无关、非妊娠（女性）、无当前疾病或输血史且HIV、HBV、HCV检测阴性的个体，采用流式细胞术使用MEM-166和TAG4两种抗CD177克隆检测中性粒细胞上CD177gp的表达，采用长片段PCR结合直接测序对CD177基因进行基因分型，并将表型与基因型进行关联分析。研究鉴定出17种基因型模式和8个新突变，发现含有c.787A>T的基因型模式与CD177gp低表达相关，但该突变单独不足以完全解释表达变异。这是首次报道印度孟买个体CD177基因分子特征的研究，所发现的8个新突变扩展了CD177表达的遗传变异目录，为理解中性粒细胞抗原多样性提供了新见解，为未来研究CD177基因变异导致HNA-2差异表达及变异基因型对HNA-2相关同种免疫易感性的研究奠定了基础。
关键技术方法：研究采用流式细胞术，使用MEM-166（FITC标记）和TAG4两种抗CD177克隆检测中性粒细胞上CD177gp的百分比表达，以FSC vs SSC设门鉴定中性粒细胞，CD177表达分为低表达（5%–39.9%）、中间表达（40%–59.9%）和高表达（>60%）三类。采用长片段PCR扩增涵盖CD177基因外显子1至9的8.3 kb片段以排除CD177P1假基因干扰，纯化后进行Sanger测序鉴定单核苷酸多态性（SNP），变异按HGVS命名法以CD177参考转录本NM_020406.4和蛋白参考序列NP_065139.2描述。样本来源为印度孟买不同民族背景的102名无关个体。统计分析使用IBM SPSS Statistics（版本27）和R软件（版本4.5.2），采用Wilcoxon符号秩检验比较两种克隆的配对测量，Bland–Altman分析、组内相关系数（ICC）和加权Cohen's kappa评估一致性，Kruskal–Wallis检验及Dunn事后检验比较基因型模式间表达差异，线性回归和序数逻辑回归评估基因型模式与CD177gp表达的关联，模型校正年龄和性别。
研究结果：
3.1 HNA-2（CD177）的血清学表型分析：通过流式细胞术使用MEM-166和TAG4两种抗CD177抗体克隆研究102名个体的CD177gp表达，所有受试个体均呈现HNA-2双态性表达，表达范围为15.22%至98.57%。MEM-166克隆检测的CD177表达中位数为60.4%（Q1–Q3：48.5–70.8），TAG4克隆为58.4%（Q1–Q3：45.9–72.9）。Wilcoxon符号秩检验显示两种克隆间存在1.56%的统计学显著差异（p = 0.007），表明存在小幅但显著的克隆依赖性变异。Bland–Altman分析显示平均差异（偏倚）接近零，大多数观测值位于95%一致性界限内，表明无系统性偏倚。
3.1.1 MEM-166与TAG4表达分类的一致性：基于中性粒细胞上HNA-2表达百分比将个体分为低表达（5%–39.9%）、中间表达（40%–59.9%）和高表达（>60%）三类。MEM-166分类为低表达的样本中大多数（12/14；85.71%）经TAG4也分类为低表达，小部分（2/14；14.28%）分类为中间表达，无样本分类为高表达。MEM-166分类为中间表达的样本中大多数（28/36；77.77%）经TAG4也分类为中间表达，较小比例显示低表达（5/36；13.88%）或高表达（3/36；8.33%）。MEM-166分类为高表达的样本中大多数（42/52；80.77%）经TAG4也分类为高表达，其余落入中间表达类别。总体上，克隆间不一致主要局限于相邻表达类别。加权Cohen's kappa分析显示两种克隆在CD177表达分类上具有高度一致性（κ = 0.813；p < 0.001）。
3.1.2 年龄和性别对CD177表达的影响：采用Student独立t检验评估性别对CD177表达的影响，MEM-166（p = 0.429）或TAG4（p = 0.558）检测均未观察到男女间CD177表达的统计学显著差异。按年龄分为≤40岁和>40岁两组，MEM-166（p = 0.302）或TAG4（p = 0.626）检测均未显示两组间CD177表达的显著差异。
3.1.3 抗体克隆间的相关性与一致性：MEM-166与TAG4检测的CD177表达之间观察到强正相关（r = 0.918；95% CI：0.880–0.944；p < 0.001）。ICC分析显示两种克隆间具有极好的一致性（ICC = 0.916；95% CI：0.878–0.942；p < 0.001）。这些结果共同表明MEM-166与TAG4在定量中性粒细胞CD177表达方面具有高度一致性，并证实本研究人群中CD177表达不受年龄或性别的显著影响。
3.2 CD177基因的分子分析：对CD177基因进行直接测序后，鉴定出19种不同的多态性，单独或组合出现。其中4个变化为同义SNP（NM_020406.4:c.114G>A、c.156C>T、c.429G>C和c.786A>C），1个为终止突变（5.26%），73.68%为错义突变；共检测到8个新突变（42.11%），其中6个为错义突变，2个为同义突变。纯合SNP NM_020406.4:c.551G、c.610A和c.614G在所有受试个体中均检测到。1名个体存在杂合NM_020406.4:c.551G>T。已知导致CD177gp低表达的c.787A>T突变在8.82%的样本中以杂合状态存在，该突变与NM_020406.4:c.782G>C、c.786A>C、c.790G>A和c.799A>G完全连锁不平衡。共鉴定出17种基因型模式。最常见的基因型模式为551G-610A-614G-1042GA（总体频率0.2745），在低表达个体中占14.29%、中间表达中占28.57%、高表达中占57.14%。c.787A>T作为基因型模式782GC-786AC-787AT-790GA-799AG的组成部分，在所有8.82%的样本中以杂合状态携带，该基因型模式在CD177gp低表达个体中最常见（66.67%）。8种基因型模式为罕见型，在研究人群中频率低于1%。对少于5名个体的基因型模式（基因型模式8至17）归为罕见型并排除于正式统计检验。Kruskal–Wallis检验比较7种基因型模式（n = 90）的平均基因表达水平，显示基因型模式间表达差异具有统计学意义（p = 0.0188），效应量中等（?2 = 0.11），表明约11%的表达变异性归因于基因型模式差异。Dunn事后检验结合FDR校正显示，基因型模式7（含CD177*787A>T）与基因型模式1（校正p = 0.020，r = 0.30）、基因型模式2（校正p = 0.017，r = 0.32）、基因型模式4（校正p = 0.011，r = 0.35）和基因型模式6（校正p = 0.011，r = 0.35）存在显著差异。线性回归分析显示未校正模型具有统计学意义（p = 0.006），解释19.1%的方差（R2 = 0.191）。与基因型模式1相比，仅基因型模式7显示表达显著降低（β = ?28.66，p = 0.001）。校正年龄和性别后模型仍显著（β = ?30.22，p = 0.013），R2 = 0.205。序数逻辑回归显示，未校正分析中基因型模式7与基因型模式1相比与较低表达水平显著相关（OR = 0.03，95% CI：0.003–0.31），校正年龄和性别后该关联仍具有统计学意义（校正OR = 0.02，95% CI：0.002–0.26）。Fisher精确检验显示基因型模式与表达分布间存在显著总体关联（p = 0.036）。
讨论部分总结：本研究使用MEM-166和TAG4两种克隆研究中性粒细胞上CD177gp表达，显示两种克隆间存在1.56%的统计学显著差异（p = 0.007），克隆间分类一致性高（κ = 0.813），少数一致性界限外的离群值主要出现在较高平均表达水平，可能反映克隆特异性表位识别差异或CD177gp表面表达变异性而非系统性测量误差。本研究未发现CD177表达与性别的显著关联，也未观察到年龄对CD177表达的影响。c.787A>T（rs879198465）由基因转换事件（CD177P1：外显子7）产生，导致终止密码子形成，既往报道该突变导致CD177gp低表达和HNA-2 null表型，并与邻近变异存在连锁不平衡。本研究中CD177*787A>T在8.8%样本中以杂合状态存在，但在其中2例样本中并未降低CD177gp表达，表明其他因素参与中性粒细胞CD177gp低表达。含c.787A>T的基因型模式在CD177gp低表达个体中富集，但该关联并不均一，3名携带该模式的个体也呈现中间至高表达，因此c.787A>T单独可能不能完全解释CD177表达的个体间变异。在其余低表达病例中观察到基因型模式1、2、3和5，提示存在其他驱动CD177表达的分子机制。本研究中未通过流式细胞术鉴定到null病例。总体上最常见的基因型模式为551G-610A-614G-1042GA（27.45%），其次为基因型模式2（15.69%）。年龄（校正OR = 1.01，95% CI：0.97–1.06）和性别（校正OR = 0.68，95% CI：0.27–1.72）与表达类别无独立关联。由于某些基因型模式的个体数较少，这些发现应谨慎解读。
研究结论：这是首次报道印度孟买个体中调控HNA-2表达的分子机制的研究。8个新突变的发现扩展了CD177表达的遗传变异目录，为中性粒细胞抗原多样性提供了新见解。重要的是，在66.67%的CD177gp低表达个体中发现的含c.787A>T的基因型模式表明该突变单独并非降低中性粒细胞表达的唯一原因。需要进行更大规模队列的更广泛研究。所观察到的遗传和表达模式为未来研究理解CD177基因变异导致HNA-2差异表达以及研究变异基因型对HNA-2相关同种免疫易感性提供了基础。
