《Analyst》：Quantification of drug concentrations in individual living cancer cells using Raman spectroscopy and machine learningOpen Access
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在抗癌药物研发中，明确药物进入细胞的量及其在细胞不同区室（如细胞核或细胞质）中的浓度至关重要。该信息有助于评估治疗效力并优化药物设计与体内给药方案。本研究将灌流技术与自发拉曼光谱（spontaneous Raman spectroscopy）及多元曲线分辨（m
在抗癌药物研发中，明确药物进入细胞的量及其在细胞不同区室（如细胞核或细胞质）中的浓度至关重要。该信息有助于评估治疗效力并优化药物设计与体内给药方案。本研究将灌流技术与自发拉曼光谱（spontaneous Raman spectroscopy）及多元曲线分辨（multivariate curve resolution）相结合，在单个细胞的核与细胞质采样位点监测无标记抗癌药物。研究考察了吉西他滨盐酸盐（gemcitabine hydrochloride）-A549、5-氟尿嘧啶（5-FU）-HT29、卡铂（carboplatin）-HeLa组合以及5-FU耐药HT29模型。光谱以300 s积分窗口顺序采集。测量曲线显示药物相关信号积累存在区室依赖性差异，包括野生型与耐药HT29细胞中不同的核-质分布模式。这些观察支持对细胞内药物动力学的进一步研究，但其定量解读依赖于校准、细胞外信号校正、时间平均及细胞活力。该测量不能独立识别膜通透性或耐药机制。
**研究背景与意义**
据预测，到2050年全球癌症病例数将达到3530万例，较2022年估计的2000万例增长76.6%；癌症死亡人数预计将升至1850万例，较2022年估计的970万例增长89.7%。尽管1990年至2023年间全球年龄标准化癌症死亡率下降了23.9%，但人口增长和老龄化仍是病例数上升的主要驱动因素。抗癌药物研发的治疗效力评价阶段迫切需要测量活细胞内无标记药物的存在，以了解药物进入细胞的量及其积累位置。抗癌药物设计的目标是杀死癌细胞的同时尽量减少对健康细胞的损害。癌细胞通常具有缺陷的DNA修复系统，已接近功能崩溃，无法应对进一步损伤；因此，诱导DNA或蛋白质损伤的治疗药物在癌细胞中触发凋亡（apoptosis），而修复系统完整的健康细胞则更有能力减轻或恢复此类损伤。
目前已有很多技术用于追踪抗癌药物在癌细胞中的存在。例如，多柔比星（doxorubicin）作为一种天然荧光抗癌药物，可在孵育6小时后通过激光扫描共聚焦显微镜在DLD1人结直肠腺癌细胞中清晰可视化。荧光光学成像有助于追踪药物在细胞中的分布，但它依赖于罕见的天然荧光药物或荧光分子标记，后者会改变药物的化学结构，并可能改变药物进出细胞的转运以及细胞内药物行为和效力。传统质谱分析可在短时间内分析细胞的分子组成，但通常需要大量细胞且往往涉及细胞裂解。先进的单探针质谱技术克服了这一局限，能够分析单个活细胞，但所涉及的大多数药物用氘标记，存在合成复杂、成本高以及与未氘代对应物相比药代动力学性质改变等缺点。流式细胞术（flow cytometry）利用平均荧光强度（MFI）定量测量癌细胞对抗癌药物的摄取，但该方法仍要求药物具有天然荧光或进行荧光标记。Kansom等证明流式细胞术可定量HT29癌细胞中对多柔比星负载胶束的摄取，揭示与游离药物相比更高的细胞摄取。电泳不能直接定量抗癌药物在癌细胞中的浓度，而是通过评估DNA片段化来评价药物诱导的DNA损伤。
拉曼光谱（Raman spectroscopy）是一种非破坏性、非侵入性分析技术，通常需要很少或无需样品制备，且不依赖外部标记，因为它通过激光诱导散射探测分子振动，无需物理接触或化学修饰。拉曼光谱与活细胞兼容，包括单细胞分析。它还非常适合实时监测和定量分析，使研究人员能够追踪拉曼信号强度的变化并在生理环境中研究生物样品。然而，5-FU和卡铂的体外浓度使用高达约200 μM，远低于乙醇的拉曼检测限，这需要更高的药物剂量、优化的检测灵敏度和超过60秒的采集时间来实现定量浓度测量。同时，此前尚未有任何技术能够非侵入性地随时间监测单个细胞内无标记药物。
本研究首次使用拉曼光谱测定单个活细胞内无标记药物的浓度，并采用时间过程实验评估多种抗癌药物的药代动力学。野生型人癌细胞系包括A549（肺）、HT29（结肠）和HeLa（宫颈），分别用吉西他滨盐酸盐、5-FU和卡铂处理；耐药细胞系为对5-FU耐药的HT29。研究预期通过跨不同药物和细胞系的重复测量揭示药物摄取速率及核质积累的一般模式；野生型与耐药HT29细胞系之间的比较分析可能有助于阐明耐药机制；此外，从时间过程实验确定每种细胞-药物对的膜渗透系数（membrane permeability coefficients）。
**关键技术方法**
本研究采用自行设计的细胞灌流系统（cell perfusion system）在封闭无菌环境中维持细胞活力并控制培养基或药物溶液输送。拉曼光谱测量使用Renishaw InVia系统，激发波长785 nm，激光功率37–40 mW，光谱范围约500–1700 cm?1，每次采集300 s。数据分析采用多元曲线分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS）分解光谱数据，并与普通最小二乘法（OLS）、非负最小二乘法（NNLS）等回归技术比较。细胞系A549、HT29、HeLa购自英国健康安全局（UK Health Security Agency），5-FU耐药HT29通过逐步暴露于递增浓度5-FU建立。细胞内药物浓度校准通过系列稀释水溶液（1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%）建立校准曲线并计算检测限（LOD）。膜渗透系数基于细胞半椭球体形状假设估算。
**研究结果**
**拉曼光谱**：通过比较三种抗癌药物1%水溶液与对应癌细胞系的拉曼光谱，确认每种药物至少有一个不与细胞背景重叠的拉曼谱带。5-FU和吉西他滨盐酸盐的最强峰达到对应细胞信号强度的12–14倍，而卡铂最强峰仅为HeLa细胞信号的三倍左右，可能导致较低的测量精度和较大的误差。
**细胞光损伤**：研究人员考察了不同激光照射时间下活细胞的形态和活力。照射少于90分钟的细胞无明显可见损伤；照射90分钟的细胞在24小时后接近崩溃；照射100分钟的细胞立即死亡。结果表明单个活细胞的总测量时间应限制在不超过90分钟。
**吉西他滨盐酸盐与A549细胞系**：通过10次独立重复测量，药物摄取在细胞核中明显快于细胞质。达到平衡后核质浓度比为1.64，细胞核和细胞质达到各自平衡浓度一半所需时间分别为7.72和13.52分钟。
**5-氟尿嘧啶与HT29细胞系**：通过3次独立重复测量，5-FU表现出与吉西他滨相似的摄取模式，细胞核摄取和积累高于细胞质。核质浓度比为1.7，细胞核和细胞质达到半平衡浓度时间分别为11.51和9.5分钟。
**卡铂与HeLa细胞系**：通过3次独立重复测量，观察到类似模式。核质浓度比为1.52，细胞核和细胞质达到半平衡浓度时间分别为4.54和12.95分钟。
**5-氟尿嘧啶耐药HT29细胞系**：与野生型HT29细胞相反，耐药细胞中5-FU在细胞质的积累和摄取速率高于细胞核。平衡后质核浓度比为1.65，细胞质和细胞核达到半平衡浓度时间分别为12.02和7.57分钟。
**膜渗透系数计算**：外细胞膜渗透系数通过摄取前2分钟药物浓度增加速率估算，核膜渗透系数通过前20分钟估算。野生型细胞中核膜渗透系数为负值，表明核内药物捕获导致的主动转运相关过程而非被动扩散。耐药HT29细胞中5-FU的核膜渗透系数为正值。
**讨论与结论**
研究人员建立了一种能准确反映真实细胞内药物浓度的定量分析方案，并发现了野生型和耐药细胞系中的药物摄取模式。在野生型细胞系中，细胞核中的药物积累和摄取速率高于细胞质，主要因为药物在细胞质中代谢为活性形式并转运至细胞核，与DNA结合形成稳定复合物而被捕获。基于估算的细胞膜和核膜渗透系数，药物进入外细胞膜的过程慢于跨核膜进入细胞核的过程，药物进入细胞核后与DNA结合的速度远快于跨外细胞膜的转运速度并被捕获，这可能是核积累持续高于细胞质的原因。此外，在所有三种药物中，细胞质药物水平略低于细胞外药物水平，提示细胞质内药物代谢可能导致细胞质药物水平的净减少。
与野生型细胞系相比，耐药HT29细胞表现出相反的核质药物积累和摄取速率模式。这是因为活性药物代谢物产生减少，导致这些代谢物向细胞核的转运减少，药物不再以稳定复合物形式在细胞核中积累，而是在细胞质中积累增加。这一发现表明，对5-FU的耐药并不限制细胞对药物的吸收，而是抑制药物靶向核DNA的能力。基于渗透系数，提示耐药机制影响药物活化而非改变膜通透性。
研究结论：拉曼光谱可测量活细胞中无标记抗癌药物的浓度。野生型细胞中药物摄取速率和细胞核药物积累高于细胞质，而耐药细胞系呈相反趋势。一种解释是抗癌药物在细胞质中代谢，产生的代谢物转运至细胞核并与DNA结合而被捕获；然而在耐药细胞系中，靶向DNA的代谢物减少。基于渗透系数，提示耐药机制影响药物活化而非改变膜通透性。
