部分氧压力（pO2）对Sf-RVN?昆虫细胞平台生产寨卡病毒样颗粒（ZIKV-VLP）的影响

《Virology》：Impact of partial oxygen pressure on Zika-VLP production using Sf-9 rhabdovirus negative (Sf-RVN?) insect cell line

　　

寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）可引起先天性和神经系统并发症，但目前尚无获批疫苗或治疗方法。病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）是有前景的疫苗平台，而溶解氧是昆虫细胞生物过程的关键参数。本研究评估了部分氧压力（partial oxygen pressure, pO₂）如何影响弹状病毒阴性草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf-RVN?细胞系中的ZIKV-VLP生产；该细胞系在化学成分明确培养基中生长，并被编码衣壳（C）、膜前体（prM）和包膜（E）蛋白的重组杆状病毒感染。细胞在30%、20%和10%空气饱和度pO₂下培养，并分析生长、细胞死亡、摄氧、杆状病毒生产和包膜蛋白表达。Sf-RVN?细胞在所有条件下均产生ZIKV-VLP，其生理行为与Sf-9细胞相当。在所评估的pO₂条件中，30% pO₂获得最高比包膜蛋白生产速率（22.5 pg 10⁶ cells^-1 h^-1）和体积生产力（32.2 pg mL^-1 h^-1）。VLPs的大小和结构特征与既往报道一致。这些结果支持Sf-RVN?细胞作为安全且一致的ZIKV-VLP生产平台。

研究背景：寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）属黄病毒科，可引起新生儿小头畸形等先天性畸形及Guillain–Barré综合征等神经系统后遗症，目前尚无获批疫苗或抗病毒药物。病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）由病毒结构蛋白自组装，可模拟天然病毒的大小、结构、对称性和抗原性，是安全的疫苗候选平台；昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统（insect cell-baculovirus expression vector system, IC-BEVS）广泛用于重组蛋白和VLP生产。问题在于，常用Sf-9细胞存在Sf-弹状病毒污染风险，而人用生物药品需满足严格安全性要求，因此需要无该病毒污染的替代细胞平台。Sf-RVN?为弹状病毒阴性Sf细胞，配合化学成分明确、无动物源成分培养基构成Sf-RVN?平台；同时，溶解氧/部分氧压力（partial oxygen pressure, pO₂）是昆虫细胞生物过程关键参数，但pO₂对ZIKV-VLP生产的影响尚需评估。
研究人员以编码ZIKV衣壳（C）、膜前体（prM）和包膜（E）蛋白的重组杆状病毒（rBV-CprME-ZIKV）感染Sf-RVN?细胞，在生物反应器中比较感染后30%、20%和10%空气饱和度pO₂，分析生长、细胞死亡、摄氧、rBV生产、E蛋白表达及VLP特征。结论是：三种pO₂均可生产ZIKV-VLP，细胞生长、呼吸和活力与文献报道的Sf-9细胞相当；30% pO₂获得最高比E蛋白生产速率和体积生产力，VLP平均大小和结构特征与文献一致，支持Sf-RVN?作为安全、一致的ZIKV-VLP生产平台。
关键技术方法概括：采用Sf-RVN?细胞系（SAFC，SFRVN-1VL）和Sf-9 Easy Titer（Sf-9ET）细胞（由Dr. Dominic Esposito提供）；在Minifors 2搅拌式生物反应器（stirred tank reactor, STR）中以0.4 L工作体积、28°C、80 rpm、0.1 vvm批培养，感染期维持pO₂为30%、20%或10%，以感染复数（multiplicity of infection, MOI）0.2 pfu cell^-1在活细胞密度2×10⁶ cells mL^-1（约36 h）感染。动态法测摄氧率（oxygen uptake rate, OUR），计数法测密度、活力和粒径，Sf-9ET/绿色荧光蛋白（GFP）法滴定rBV，Bradford法测总蛋白，Western blot和酶联免疫吸附测定（ELISA）测E蛋白，透射电镜（TEM）免疫金标记表征VLP。
研究结果：
3.1 未感染Sf-RVN?细胞的生长与大小（Cell growth and size of uninfected Sf-RVN? cells）：批培养指数期约68 h，最大比生长速率0.0320 h^-1，倍增时间21.64 h；最大活细胞密度6.23×10⁶ cells mL^-1（约92 h）；最低活力93.8±1.2%，随后高于96%；细胞大小主要16.5–18.0 μm。与文献中Sf-9及化学成分明确培养基结果相当，说明该平台生长可重现。
3.2 感染Sf-RVN?细胞的生长、大小与活力（Growth, cell size, and cell viability of infected Sf-RVN? cells）：感染前最大比生长速率0.0330±0.0007 h^-1，倍增时间21.02±0.44 h；感染后活细胞继续生长至30 hpi（30% pO₂）或12 hpi（20%、10%）；最低活力分别为28.0±6.2%、20.8±6.0%、54.4±2.7%；最大直径20.8±0.4 μm；死亡分两阶段，第一阶段死亡速率0.19、0.17、0.22×10⁵ cells mL^-1 h^-1，30%组第二阶段最大1.70×10⁵ cells mL^-1 h^-1；比死亡常数最高0.2803 h^-1（20%）。说明低MOI感染非同步，死亡动力学随pO₂变化。
3.3 未感染与感染Sf-RVN?细胞的摄氧（Oxygen uptake by uninfected and infected Sf-RVN? cells）：未感染OUR最大23 mg O₂ L^-1 h^-1（48 h）；比摄氧率在48 h前近8.0×10^-9 mg O₂ cell^-1 h^-1，之后下降并低于感染组；最大比摄氧率9.3×10^-9，最低2.0×10^-9 mg O₂ cell^-1 h^-1。OUR和比摄氧率为反应器曝气及体积氧传递系数设计提供依据。
3.4 Sf-RVN?生产ZIKV E蛋白与rBV-CprME-ZIKV（Sf-RVN? production of the ZIKV envelope protein and rBV-CprME-ZIKV）：ELISA最大E蛋白浓度在30%、20%、10% pO₂分别为2.7 ng mL^-1（约48 hpi）、2.2 ng mL^-1（约55 hpi）、2.8 ng mL^-1（约55 hpi）；密度法值更高，可能因同分子量宿主/病毒蛋白共带而高估。比E蛋白生产速率和体积生产力在30% pO₂最高（22.5 pg 10⁶ cells^-1 h^-1；32.2 pg mL^-1 h^-1），20%为17.9和24.3，10%为20.7和30.7；最高E蛋白浓度条件未带来最高生产率。rBV滴度在20% pO₂ 48 hpi最高1.49×10⁷ pfu mL^-1；30%和10%最大分别为3.2×10⁶和1.4×10⁶ pfu mL^-1（32 hpi），60 hpi前降至10⁴ pfu mL^-1量级。
3.5 Sf-RVN?平台ZIKV-VLP的表征（Charactization of ZIKV-VLP produced with Sf-RVN? Platform）：Western blot在>50 kDa检测E蛋白条带，与灭活ZIKV阳性对照位置一致；30% pO₂样品负染TEM免疫金标记显示10 nm金粒标E蛋白、5 nm金粒标prM；平均直径70.43±11.05 nm（n=8），示例93.23 nm，大于成熟ZIKV约50 nm但小于200 nm，与Sf-9来源ZIKV-VLP 50–100 nm报道一致。
讨论总结：原文讨论强调，最高E蛋白浓度并不对应最高比E蛋白生产速率或体积生产力，过程性能不能仅以生产力评价；产品质量属性如糖基化可能受溶解氧可用性影响，应进一步评估；rBV滴度在感染后下降，收获时间与产品质量需综合考虑；Sf-RVN?平台无Sf-弹状病毒且培养基于无动物源成分，具有安全性和批次一致性优势。
研究结论翻译：Sf-RVN?细胞在化学成分明确EX-CELL? CD昆虫细胞培养基中于生物反应器培养，可在三种不同溶解pO₂水平（30%、20%和10%）下表达ZIKV-VLPs；整个过程中，这些细胞对杆状病毒感染表现出的生长、呼吸和细胞活力与文献报道的原始Sf-9细胞系相当；Sf-RVN?细胞未受Sf-弹状病毒污染，并在无动物源成分培养基中培养；感染后阶段pO₂维持30%的条件突出，获得最高比包膜蛋白生产速率（22.5 pg 10⁶ cells^-1 h^-1）和体积生产力（32.2 pg mL^-1 h^-1），这是工艺可行性的关键参数；所产生VLPs的平均大小和结构特征与文献报道一致，表明Sf-RVN?平台可替代原始Sf-9细胞系，因不存在蛋白裂解物和动物源成分而促进下游处理，同时提高工艺一致性和安全性。