《Systematic Entomology》：Using highly variable exons to assess phylogenetic relationships among species of Anastrepha Schiner (Diptera: Tephritidae)
编辑推荐：
实蝇科Anastrepha属包含众多具有经济意义的实蝇物种，然而由于物种间形态相似及近期快速辐射分化，其种间关系解析始终面临持续挑战。基于形态特征及有限分子数据集的传统分类学体系难以解决这些复杂问题。本研究采用高多重扩增子系统发育基因组学（Highly Mul
实蝇科Anastrepha属包含众多具有经济意义的实蝇物种，然而由于物种间形态相似及近期快速辐射分化，其种间关系解析始终面临持续挑战。基于形态特征及有限分子数据集的传统分类学体系难以解决这些复杂问题。本研究采用高多重扩增子系统发育基因组学（Highly Multiplexed Amplicon-Based Phylogenomics, HiMAP）方法分析Anastrepha属物种及物种群之间的亲缘关系，基于479份标本、覆盖86个物种的444个核基因座。研究结果在很大程度上印证了近期发表的锚定杂交富集（anchored hybrid enrichment, AHE）系统发育树，同时揭示了关键性修正，包括广泛的基因树不一致（gene tree discordance）证据。值得注意的是，HiMAP基因座识别出网状进化模式（reticulate evolutionary patterns），支持远缘相关物种间存在不完全谱系分选（incomplete lineage sorting, ILS）和渐渗（introgression）。上述结果强调，在界定Anastrepha属物种群边界时，应考虑非 bifurcating 的系统发育拓扑结构。
**研究背景与问题提出**
实蝇科（Tephritidae）目前已知超过5000种，其中许多为具有经济重要性的害虫，影响全球多数国家的经济。Anastrepha属包含51个具有经济意义的物种和至少9个主要害虫物种，其成虫鉴定依赖翅斑、翅脉及雌性产卵器（aculeus）的微小形态差异，而幼虫阶段仅约9%的物种可通过形态特征鉴定至种级，这恰恰是 regulatory agencies 最常截获的虫态。雄性成虫常无法鉴定。历史上多数Anastrepha物种依据形态特征被归入物种群，但部分物种仍未分配。形态鉴定的局限性和物种数量的快速增长推动了分子标记在物种界定和系统发育推断中的应用。然而，既往分子研究受限于分类单元采样和/或遗传标记数量——如Mengual et al. (2017) 仅使用6个基因座（3个核基因、3个线粒体基因）分析137个物种，发现15个所分析物种群中仅7个为单系。近期Norrbom et al. (2025) 采用AHE方法对728份标本、237个物种进行分析，提出包含44个物种群的新分类体系，但微观进化现象（如渐渗和杂交）的检测与解释仍存在不确定性，且AHE探针基于保守区域设计可能低估揭示近期渐渗和杂交的变异。HiMAP方法通过识别适用于目标分类群的大量高变单拷贝核基因座，更可能通过基因树不一致检测ILS、渐渗和/或杂交信号。本研究旨在构建Anastrepha的HiMAP数据集，检验当前系统发育假说、评估物种群组成及其关系，并通过广泛地理采样（尤其关注fraterculus物种群）检验属内微观进化模式。
**主要关键技术方法**
研究人员对来自北美、中美和南美17个国家的564份标本（代表86个Anastrepha物种，以野生种群为主，少数来自实验室饲养种群）进行分析，采用McPhail诱捕器或多 lure 诱捕器采集成虫，幼虫从果实中饲养至成虫以供形态鉴定。基于37个基因组/转录组（主要为Anastrepha物种，含Bactrocera、Ceratitis和Zeugodacus代表）进行直系同源预测，估计18,109个直系同源基因，其中6,619个为单拷贝，经长度、系统发育信息量和标本代表性过滤后，提交3,441个外显子进行引物设计，最终基于系统发育信息量和基因组分布选择890个HiMAP外显子和110个来自Congrains et al. (2021) 的外显子构建扩增子面板。文库制备采用Swift Accel-Amplicon或SNAP方案，在Illumina MiSeq平台测序。序列数据处理后，对每个扩增子生成一致性序列，通过BLAST+比对参考HiMAP假基因组去除虚假序列。外群选取Zeugodacus cucurbitae、Ceratitis capitata和Rhagoletis pomonella的全基因组。系统发育分析包括：基于IQTREE的最大似然（ML）基因树构建、ASTRAL的溯祖物种树推断、超矩阵的串联ML和贝叶斯推断（BI）、Phytop的ILS和渐渗指数估计、Phylonet的网状进化分析以及D-statistics和F-branch统计量估计基因流。
**研究结果**
**描述性统计**：1000个目标基因座中912个在至少一个个体的中成功扩增，最终数据集包含444个扩增子，比对长度合计100,907 bp，479份标本代表417个已知物种中的86个，隶属44个物种群中的27个。GC含量每外显子范围为33%–62%（均值46%），缺失位点百分比0%–16%（均值1%），变异位点比例21%–59%（均值40%），简约信息位点1%–37%（均值12%）。较短扩增子优先扩增且变异位点较少，但扩增子长度与简约信息位点比例无显著相关。
**物种群组成**：基于444个核基因座通过三种方法推断系统发育关系——ASTRAL溯祖树（主要参考拓扑）、ML树和BI树。多数节点bootstrap支持率接近100%，但基因树间存在高度不一致。30个多标本物种中仅3个在溯祖分析中未呈单系（A. pickeli、A. hadropickeli和A. canalis）。12个多物种物种群中绝大多数在各分析中大体恢复为单系， notable exceptions 为mucronota和grandis物种群。mucronota群在溯祖树和ML树中因A. hastata的 placement 而呈并系；grandis群的单系性存疑。A. tecta传统上归入spatulata群，但被置于该群之外。各方法间拓扑差异主要体现在物种群间的排列方式：溯祖树将物种群分为两大 clade，而ML和BI拓扑呈更 pectinate 的格局。leptozona和schausi群的位置对比是主要拓扑不一致的来源，伴随高discordance（平均ILS-i = 0.89）。fraterculus群被分为两个主要节点，A. atrigona（bivittata群）为fraterculus群的姐妹群，三者依次与A. psidivora（psidivora群）和striata群构成姐妹关系。fraterculus复合体呈多系，至少包含6个不同 lineage，Mexican A. fraterculus与A. zenildae同种，Mexican colony样本鉴定为A. obliqua。
**物种群关系及与Norrbom et al. (2025) 的比较**：与AHE ML树的比较显示总体拓扑一致，但差异在统计上显著（SH检验p < 3e-255）。HiMAP溯祖树将属分为两大 clade，而ML和BI拓扑更 pectinate，与AHE ML和AHE ASTRAL拓扑中观察到的模式相似。mucronota群的单系性被SH检验显著拒绝（AU-test p = 0.0003）。leptozona群 placement 的替代假说均未被SH检验拒绝（AU-test p = 0.132）。spatulata群和grandis群的单系性检验均不显著。
**基因树不一致与网络分析**：尽管多数分支支持率高，但内部关系（尤其深节点）存在显著不一致，主要由ILS驱动，渐渗作用较小。分支长度与ILS呈强负相关（r2 = 0.83），与渐渗无显著相关。超过90%的节点ILS-e值>60%，渐渗在所有节点中约6%被推断，包括12%的内部节点、14%的物种级节点，甚至两个物种群之间（leptozona和panamensis群）。基于54个扩增子簇的Phylonet网络分析中，仅四网状结构网络重现了溯祖树拓扑。Phytop和Phylonet推断的渐渗节点在多种方法中大体得到印证，如fraterculus和panamensis群之间的渐渗（inheritance probabilities >0.28；A. punctata IH-e ~17%–20%），以及涉及更深节点的渐渗（leptozona群IH-e = 27%）。
**讨论与结论**
本研究构建了稳健的系统发育基因组数据集，获得444个高变核基因座、479份标本、86个物种的数据。尽管扩增子较短（121–429 bp），仍获得足够的系统发育信号以区分Anastrepha内先前定义的 clade。拓扑不一致主要源于基因树间差异，溯祖树与串联树方法间差异始终较大，表明种间群关系甚至种级关系并非泾渭分明，可能涉及非 bifurcating 进化模式。数据支持将A. alveata从spatulata群移除、annonae群的形成、A. atrigona从grandis群移除以及buscki群的形成；但不支持亦不拒绝A. barbiellinii归入grandis群，且不支持mucronota群的单系性。基因一致性分析表明Anastrepha系统发育各层级均存在高水平ILS，物种节点平均ILS-e = 0.45，物种群节点平均ILS-e = 0.36，非拓扑节点ILS-e = 0.62。ILS与内部分支长度负相关，物种群分支比物种分支长70%，物种分支比非定义物种/物种群的分支长82%。渐渗估计总体很低（物种节点平均IH-e = 0.02），表明相比ILS，渐渗在Anastrepha基因间不一致中的作用更为有限。Phytop检测到77个物种分支中12个和479个总分支中28个IH-e >0.10。渐渗证据最高的为A. pickeli和A. hadropickeli之间（IH-e = 0.25），与溯祖树中这两个物种未呈单系一致。fraterculus复合体各 lineage 间渐渗证据较少，可能因节点较浅且ILS水平高而难以检测。leptozona和fraterculus群之间的渐渗推断因生物学和历史因素被认为极不可能，可能反映祖先渐渗经持续高水平ILS保留，或来自"ghost" lineage的基因流。leptozona群在各树中位置未良好解析，可能与根部 placement 未充分解决及同塑性有关。
**结论翻译**：研究人员采用HiMAP——一种新型系统发育基因组学方法——产生数据用于研究Anastrepha属（双翅目：实蝇科）内的系统发育关系。结果表明，即使在Anastrepha这样ILS和渐渗可能普遍存在的复杂属中，系统发育基因组学仍能提供显著效力以解析近缘 lineage 和高层级关系。通过整合近500份标本的数百个核基因座，研究人员恢复了与多数物种和物种群对应的良好支持 clade，并细化了其在更广泛系统发育中的 placement。虽然某些关系因快速辐射分化的进化历史及随机过程和非 bifurcating 分支模式（如渐渗）的限制而本质上难以解析，但研究结果在不同分析框架间的一致性凸显了方法的稳健性。ILS和渐渗的相互作用并非障碍，而是为Anastrepha的进化动力学提供了宝贵见解。研究结果补充了Norrbom et al. (2025) 关于某些物种群变更的证据，同时表明拓扑不同层级仍存在不确定性，原因包括ILS和/或渐渗，这可能正是Anastrepha物种群边界长期模糊的原因。本研究与合作者的 complementary 工作共同建立了未来研究的坚实系统发育基因组学基础，既提供了物种鉴定的实用工具，也更清晰地描绘了进化过程如何塑造这一最具多样性的新热带实蝇类群之一。
